Effektive Isolation von funktionellen Inselchen von Neonatal Maus Pancreas

Chen Huang; Guoqiang Gu

doi:10.3791/55160

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Methodenartikel

Effektive Isolation von funktionellen Inselchen von Neonatal Maus Pancreas

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DOI:

10.3791/55160

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6. Januar 2017

Chen Huang¹ , Guoqiang Gu¹

¹Department of Cell and Development Biology, Vanderbilt University Medical School

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Protokoll hier für intakte Inseln von neugeborenen Mäusen zu isolieren. Bauchspeicheldrüsen wurden teilweise mit Kollagenase, gefolgt von Waschen und Hand picking verdaut. 20-80 islet Cluster können pro Bauchspeicheldrüse von neugeborenen Mäusen erhalten werden, die für mehrere islet Studien geeignet sind.

Zusammenfassung

Perfusions-basierte Inselisolierung Protokolle von großen Säugetieren Bauchspeicheldrüsen sind gut etabliert. Solche Protokolle sind in vielen Laboratorien aufgrund der großen Größe der Pankreasgang, der ermöglicht bereit Kollagenase Injektion und anschließende Gewebeperfusion leicht durchgeführt. Im Gegensatz dazu Inselisolierung von kleinen Bauchspeicheldrüsen, wie die von neugeborenen Mäusen, ist schwierig, weil die Perfusion nicht leicht erreichbar in dem kleinen pancreata ist. Hier haben wir ein detailliertes einfaches Verfahren beschreiben, die von neu geborenen Mäusen, die mit visuellen Unterstützung einer beträchtlichen Zahl von Inseln erholt. Frisch sezierte ganze Bauchspeicheldrüsen wurden mit 0,5 mg / ml Kollagenase IV in Hanks 'Balanced Salt Solution (HBSS) bei 37 ° C, in Mikrozentrifugenröhrchen gelöst verdaut. Die Röhrchen wurden regelmäßig zu unterstützen Gewebe Zerstreuung angezapft. Wenn der größte Teil des Gewebes zu kleinen Gruppen etwa 1 mm dispergiert, drei- bis viermal mit Nährmedien Lysate wurden mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), gewaschen. Islet Cluster,ohne erkennbare acinar Gewebe kann dann unter Sezieren Stereoskop zurückgewonnen werden. Dieses Verfahren gewinnt 20 - 80 kleine bis große Inseln pro Bauchspeicheldrüse von Neugeborenen Maus. Diese Inseln sind für die meisten denkbaren Downstream-Assays, einschließlich der Insulinsekretion, Genexpression und Kultur. Ein Beispiel für die Insulinsekretion Assay dargestellt, um den Isolationsprozess zu validieren. Der genetische Hintergrund und der Grad der Verdauung sind die größten Faktoren, die Ausbeute zu bestimmen. Frisch mit hoher Aktivität hergestellt Kollagenase-Lösung wird bevorzugt, da es in endokrin exokrinen Isolation hilft. Die Anwesenheit von Kationen [Calcium (Ca ²⁺⁾ und Magnesium (Mg ^2+)] in allen Lösungen und fötales Rinderserum in der Wasch- / Kommissionierung Medien sind notwendig für eine gute Ausbeute an kleinen Inseln mit der richtigen Integrität. Ein Binokular mit gutem Kontrast und Vergrößerung wird auch dazu beitragen.

Einleitung

Die Isolierung reiner Pankreasinseln ist essentiell für die Bestimmung der glukosestimulierten Insulinsekretion (GSIS) von Betazellen und für die Inseltransplantation von Leichenspendern ^1-3. Es ist auch notwendig, die endokrine Genexpression in Inselzellen zu etablieren ^{4, 5}. Zu diesem Zweck wurden detaillierte Protokolle erstellt, die die Isolierung von Pankreasinseln aus großen Pankreasinseln ermöglichen (⁶ und Verweise darin). Diese Methoden basieren auf enzymatischer Perfusion zur Dissoziation von Azinus aus Inselgewebe, gekoppelt mit Gradiententrennung und Handpflückung. Somit kann die Isolierung von Inselzellen aus einer großen ....