Der Nachweis von Inter-chromosomale Stable Abberationen durch Mehrfachfluoreszenz In Situ Hybridisierung (MFISH) und Spektrale Karyotypisierung (SKY) in Bestrahlte Mäuse

Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Nützlichkeit der multiplen Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (mFISH) und der spektralen Karyotypisierung (SKY) bei der Identifizierung interchromosomaler stabiler Aberrationen in den Knochenmarkzellen von Mäusen nach Exposition gegenüber Ganzkörperbestrahlung.

Abstract

Ionisierende Strahlung (IR) induziert zahlreiche stabile und instabile Chromosomenaberrationen. Instabile Aberrationen, bei denen die Chromosomenmorphologie erheblich beeinträchtigt ist, können mit herkömmlichen Chromosomenfärbetechniken leicht identifiziert werden. Der Nachweis stabiler Aberrationen, bei denen genetisches Material ausgetauscht oder translokiert wird, ohne dass die Chromosomenmorphologie wesentlich verändert wird, erfordert jedoch ausgeklügelte Chromosomenmaltechniken, die auf der In-situ-Hybridisierung von fluoreszenzmarkierten DNA-Sonden beruhen, einer Chromosomenmaltechnik, die im Volksmund als Fluoreszenz in situ bekannt ist Hybridisierung (FISH). FISH-Sonden können spezifisch für ganze(s) Chromosom(en) oder für präzise Unterregionen auf Chromosom(en) sein. Die Methode ermöglicht nicht nur die Visualisierung stabiler Aberrationen, sondern auch den Nachweis des Chromosoms bzw. der spezifischen DNA-Sequenzen, die an einer bestimmten Aberrationsbildung beteiligt sind. In der Zytogenetik steht eine Vielzahl von Chromosomenmaltechniken zur Verfügung; hier werden zwei hochempfindliche Methoden, die multiple Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (mFISH) und die spektrale Karyotypisierung (SKY), diskutiert, um interchromosomale stabile Aberrationen zu identifizieren, die sich in den Knochenmarkzellen von Mäusen nach Ganzkörperbestrahlung bilden. Obwohl beide Techniken auf fluoreszenzmarkierten DNA-Sonden beruhen, unterscheiden sich die Detektionsmethode und der Prozess der Bildaufnahme der Fluoreszenzsignale. Diese beiden Techniken wurden in verschiedenen Forschungsbereichen eingesetzt, wie z.B. in der Strahlenbiologie, der Krebszytogenetik, der retrospektiven Strahlenbiodosimetrie, der klinischen Zytogenetik, der evolutionären Zytogenetik und der vergleichenden Zytogenetik.

Introduction

Die beiden zuverlässigsten Methoden zur Identifizierung strahleninduzierter interchromosomaler stabiler Aberrationen sind die multiple Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (mFISH), die die gleichzeitige Bemalung von zwei oder mehr Chromosomen ermöglicht, und die spektrale Karyotypisierung (SKY), die jedem homologen Chromosomenpaar im Genom eine eindeutige Farbe verleiht. Im Gegensatz zu instabilen Aberrationen sind stabile Aberrationen von Natur aus persistent und können sich über mehrere Generationen in bestrahlten Populationen vermehren¹ und gelten als kritische molekulare "Signaturen" für strahleninduzierte zytogenetische Läsionen². Stu....

Protocol

Alle Tierversuche wurden in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt. Das Tier Protokoll wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee der University of Arkansas for Medical Sciences genehmigt. 15 Stundentakt von frischer Luft und den freien Zugang zu Standard-Nagerfutter und Wasser - Alle Tiere wurden mit 10 bei 20 ± 2 ° C unter Standard klimatisierten Tieranlage untergebracht. Bei der Ankunft wurden die Mäuse für 1 Woche in Quarantäne gehalten und zertifiziertes Nagerfutter zur Verfügung gestellt.

1.Radiation Belichtu....

Results

Gesamtkörperbestrahlung induziert zahlreiche Chromosomenaberrationen in den Knochenmarkzellen von bestrahlten Mäusen. Das aktuelle Protokoll wird für die in - vivo - mitotischen Arrest von Knochenmarkzellen nach Strahlenexposition optimiert, Ernte von Knochenmarkszellen von den Hinterbeinen von bestrahlten Mäusen, die Isolierung von Knochenmark mononukleären Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation, die Vorbereitung der Metaphase Zelle ausbreitet, und die anschließen.......

Discussion

Mehrere wichtige Schritte bestimmen den Erfolg von MFISH und SKY. Der erste und wichtigste Schritt ist es, die Colchicin - Behandlung für in vivo mitotischen Arrest der Knochenmark mononukleäre Zellen zu optimieren. Die Colchicin Konzentration und die Behandlungszeit der mitotischen Index sowie Chromosomenkondensation-zwei wichtige Voraussetzungen für eine effektive chromosome painting einzeln oder gemeinsam bestimmen. Eine hohe Konzentration Colchicin oder längere Behandlungszeit führt zu hoch kondensierter Ch.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formamid	Sigma-Aldrich	221198-100ML
SSC Puffer 20 x Konzentrat	Sigma-Aldrich	S6639-1L
SKY Laborreagenz für	Maus Applied Spectral Imaging	FPRPR0030/M40
CAD - Konzentriertes Antikörper-Detektionskit	für angewandte spektrale Bildgebung	FPRPR0033
einzelnen Farben kundenspezifisch - 3 Farben; Maus-Chromosom 1: Rot, Maus-Chromosom 2: Grün, Maus-Chromosom 3: Aqua	Applied Spectral Imaging	FPRPR0182/10
Glas-Deckgläser	Fisher Scientific	12-545B
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-100
Salzsäure, 37%, Acros Organics	Fisher Scientific	AC45055-0025
Fisherbrand Glasfärbeschalen  mit Schraubverschluss	Fisher Scientific	08-816
KaryoMAX Kaliumchlorid-Lösung	Life Technologies	10575-090
Fisherbrand Superfrost Plus Objektträger	Fisher Scientific	12-550-15
Colcemid Pulver	Fisher Scientific	50-464-757
Histopaque-1083	Sigma-Aldrich	10831
Shepherd Mark I, Modell 25 137Cs Bestrahlungsgerät	J. L. Shepherd & Associates	Model 484B
Spritze 1 mL	BD Biosciences	647911
Ethylalkohol, 200 Proof	Fisher Scientific	MEX02761
PBS, (1x PBS Liq.), ohne Calcium und Magnesium	Fisher Scientific	ICN1860454
fötales Rinderserum	Fisher Scientific	10-437-010
Methanol	Fisher Scientific	A454SK-4
Eisessig	Fisher Scientific	AC295320010
Zeiss Mikroskop	Zeiss	AXIO Imager.Z2