Methodenartikel

Differenzierung der Primitive und Definitive hämatopoetischen Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotente Stammzellen gerichtet

DOI:

10.3791/55196

⸱

1. November 2017

 , 
1Department of Internal Medicine, Hematology Division, Washington University in St. Louis

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier präsentieren wir menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSC) Kultur Protokolle verwendet, um hPSCs in CD34 unterscheiden+ hämatopoetischen Vorläuferzellen. Diese Methode nutzt Bühne-spezifische Manipulation von kanonischer WNT signalisieren Zellen ausschließlich entweder die definitive oder primitive hämatopoetischen Programm angeben.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eines der wichtigsten Ziele für die regenerative Medizin ist die Erzeugung und die Wartung von hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) aus menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSCs). Bis vor kurzem haben Anstrengungen zur hPSCs in HSCs differenzieren überwiegend hämatopoetische Vorläuferzellen generiert, die fehlen, HSC-Potenzial, und stattdessen ähneln Dottersack Hämatopoese. Diese resultierenden hämatopoetischen Vorläuferzellen können Dienstprogramm für in-vitro- Krankheit Modellierung von verschiedenen Erwachsenen hämatopoetischer Erkrankungen, insbesondere der lymphatischen Linien beschränkt haben. Allerdings haben wir vor kurzem beschrieben Methoden zum Generieren von Erythro-Myelo-lymphatischen multilineage endgültige hämatopoetischer Vorläuferzellen aus hPSCs mit einem Stadium-spezifische gerichtete Differenzierung-Protokoll, die wir hier erläutern. Durch enzymatische Dissoziation des hPSCs auf Basalmembran Matrix-beschichtete Plasticware Embryoid Körper (EBs) gebildet. EBs unterscheiden sich um Mesoderm durch rekombinante BMP4, die anschließend von der GSK3β-Inhibitor, CHIR99021 zum endgültigen hämatopoetischen Programm angegeben ist. Alternativ wird primitive Blutbildung durch den PORCN-Inhibitor, IWP2 angegeben. Hämatopoese wird weiter durch die Zugabe von rekombinanten VEGF und unterstützende hämatopoetischen Zytokinen angetrieben. Die daraus resultierende hämatopoetischen Vorfahre generiert, mit dieser Methode haben das Potenzial für Krankheiten und Entwicklungsstörungen Modellierung, in Vitroverwendet werden.

Einleitung

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Menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSCs) sind definiert als mit humanen embryonalen Stammzellen (HES) und menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSCs) und haben die einzigartige Fähigkeit, nicht nur in der Selbsterneuerung unter geeigneten Wachstumsbedingungen, aber auch die Fähigkeit, sich in alle Zelltypen differenzieren abgeleitet aus den drei Mikrobeschichten: Entoderm, Mesoderm und Ektoderm1. Aufgrund dieser einzigartigen Fähigkeiten halten hPSCs große Verheißung für die regenerative Medizin, Krankheit Modellierung und zellbasierte Therapien2. Während mehrere Zelltypen erfolgreich von hPSCs unterschieden wurde, ist eine große Herausforderung der in-vitro- Spezifikation ausschließlich Erwachsenen-wie hPSC hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) und definitive hämatopoetischen Vorläuferzellen.

Eine wahrscheinlich Hindernis für die Entwicklung der menschlichen HSCs aus hPSCs ist das Vorhandensein von mehreren hämatopoetischen Programmen innerhalb der menschlichen Embryos3. Das erste Programm, das entsteht, "primitive Hämatopoese," bezeichnet, entsteht im Gewebe extraembryonic Dottersack und zeichnet sich durch seine vorübergehende Produktion von Erythroblast Vorfahren (EryP-CFC), Makrophagen und Megakaryozyten am besten. Vor allem, dieses Programm gibt keinen Anlass, HSCs, noch gibt es Anlass zu T- und B lymphoiden Vorläuferzellen. Allerdings der Dottersack vorübergehend eingeschränkt definitive hämatopoetischen Vorfahren, wie z. B. der Erythro-myeloischen Vorläuferzellen (EMP4,5,6,7,8) hervorrufen und die erythroiden-defizienten lymphatischen grundiert multipotenten Vorläuferzellen (LMPP9). Jedoch sind weder EMPs noch LMPPs, voll multipotenten oder HSC-ähnliche Engraftment in Erwachsenen Empfänger in der Lage. Im Gegensatz dazu wird später in der Entwicklung, das klassisch definierte "definitive" hämatopoetische Programm im Großraum Aorta-Gonade-Wachstum des Embryos richtige, was zu allen Erwachsenen hämatopoetischen Linien, einschließlich der HSC angegeben. Die Spezifikation dieser intra embryonalen definitive hämatopoetischen Zellen tritt in einer Kerbe-abhängigen Weise über eine endotheliale-hämatopoetischen Übergang von Hemogenic Endothel (er)3,10,11 ,12,13,14. Abgesehen von Rekonstitution Kapazität Multilineage potenzielle und Notch-Abhängigkeit von diesen Zellen lässt sich diese endgültige hämatopoetischen Vorläuferzellen aus der EMP und die LMPP (rezensiert in Referenzen3,13 unterscheiden ).

Verständnis der Mechanismen für primitiv und definitive hämatopoetischen Spezifikation von hPSCs dürfte für die reproduzierbare Produktion von definitive hämatopoetischen Vorläuferzellen über eine Vielzahl von hPSC Linien von entscheidender Bedeutung. Bis vor kurzem existierten hPSC Differenzierung Protokolle, die multipotente primitive und definitive hämatopoetische Vorläuferzellen trennen konnte nicht15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25. Viele Ansätze mit fetalen bovine Serum (FBS) und/oder Stromazellen Kokultur zuerst umrissen der hämatopoetische Potenzial der hPSC Differenzierung, mit einer Mischung aus primitiven und endgültige hämatopoetischen potenzielle15,16, 17,19,22,23,25. Weitere, viele serumfreien hämatopoetischen Protokolle haben die Signal-Anforderungen für die Spezifikation von Mesoderm aus hPSCs, die blutbildenden potenzielle18,20,21, birgt beschrieben 24. wie diese Methoden noch heterogene Mischungen beider Programme hervorbrachte, deren Einsatz in klinische Anwendungen und Entwicklungsmechanismen Verständnis kann jedoch begrenzt.

Wir haben vor kurzem auf diesen Studien aufgebaut haben skizziert die Bühne-spezifische Signal Anforderungen an ACTIVIN/NODAL und WNT signalisieren in primitive und endgültige hämatopoetischen Spezifikation vom hPSC abgeleitet Mesoderm18,26 . Letzteres war besonders einzigartig, da die Nutzung der Bühne-spezifische WNT Signalmanipulation für die Spezifikation von ausschließlich primitiv oder ausschließlich endgültige hämatopoetischen Vorläuferzellen26ermöglicht. Während Mesoderm-Spezifikation, die Hemmung der kanonischen WNT signalisieren mit dem PORCN-Inhibitor IWP2 führt bei der Spezifikation von CD43+ EryP-CFC und myeloischer Vorläuferzellen mit kein nachweisbar lymphoide Potenzial. In scharfem Kontrast, Stimulation der kanonischen WNT-Signal mit dem GSK3β-Inhibitor, CHIR99021, in der gleichen Phase der Differenzierung führte in die völlige Abwesenheit von nachweisbaren CD43+ EryP-CFC, während gleichzeitig führt zu den Spezifikation der CD34+CD43− HE. Diese Bevölkerung besaß myeloische, HBG-erythroiden und T-lymphatischen Potenzial zum Ausdruck bringt. Spätere Analysen identifiziert, das er als Ausdruck CD7327,28 und CD18428und sein hämatopoetischen Potential fehlt Kerbe-abhängige28war. Weitere, einzellige klonale Analysen gezeigt, dass diese endgültige hämatopoetischen Linien von multipotenten Einzelzellen28abgeleitet werden können. Zusammen genommen, zeigen diese Studien, dass die Bühne-spezifische WNT signalisieren Manipulation pur primitive hämatopoetischen Vorläuferzellen oder multipotenten Kerbe-abhängige definitive hämatopoetischen Vorläuferzellen angeben kann.

Hier beschreiben wir unsere Differenzierungsstrategie, die ausschließlich primitive oder endgültige hämatopoetischen Stammväter, durch Manipulation der kanonischen WNT signalisieren während mesodermalen Musterung und ihre nachgelagerten hämatopoetischen Linie Assays ergibt. Dieses Protokoll ist von großem Wert für die Ermittler, die die Produktion von entweder primitiv oder endgültige hämatopoetischen Vorläuferzellen aus hPSCs für regenerative Medizin Anwendungen interessiert sind.

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Protokoll

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1. Reagenzien

  1. erhalten Zelle Linien embryonaler oder HiPSCs 1, Maus embryonalen Fibroblasten (MEFs) 29, OP9 DL4 Stroma 30 , 31.
  2. Reagenz Vorbereitung
    1. bereiten die 0,1 % w/V Lösung von Gelatine in PBS. Sterilisieren durch Autoklavieren und nach Aliquotierung bei 4 ° C lagern.
      1. Bereiten die Gelatine beschichtet Plastikwaren. Mantel 6-Well-Platten mit 1,5 mL 0,1 % Gelatine-Lösung. 15 min bei Raumtemperatur inkubieren. Unmittelbar vor der Anwendung, Aspirieren verbleibenden Gelatinelösung.
    2. Bereiten die MEF-Medien durch die IMDM mit 15 % V/V FBS und 1 X Antibiotika. Ergänzen mit 2 mM L-Glutamin und 400 µM Monothioglycerol (MTG) vor der Verwendung und Lagerung bei 4 ° c
    3. Vorbereitung der hPSC Nährmedien als Lösung der DMEM/F12 mit 20 % V/V Ko Serum Ersatz (KOSR), 1 X nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA), 1 X Antibiotika, 55 µM β-Mercaptoethanol, 2 mM L-Glutamin und 10 ng/mL bFGF. Filter mit 2 µm Filter zu sterilisieren und Lagerung im Dunkeln bei 4 ° c
    4. Vorbereitung der serumfreien Wash Medien als eine Lösung mit 5 % V/V KOSR DMEM/F12 und 4 mM HCl. Filter mit 2 µm Filter, Aliquoten, sterilisieren und Lagerung im Dunkeln bei 4 ° c
    5. Machen eine 1 mg/mL DNase ich Lösung durch Auflösen der DNase I für 3-4 h in eiskaltem, sterilen deionisiertes Wasser auf Eis. Filter mit 2 µm Filter zu sterilisieren und speichern Aliquote bei-20 ° c
    6. Bereiten die STOP-Lösung mit WASH Medien: Fügen Sie 10 % FBS und 10 µg/mL DNase ich. Die Stopplösung sollten bereit sein, unmittelbar vor der Benutzung.
    7. Vorbereitung die Basalmembran Matrix (z. B. Matrigel, genannt Matte hereon) Mischung Lösung.
      Hinweis: Alle Schritte Vorbereitung und Verwendung der Matten Mischung sollte durchgeführt werden, auf Eis oder bei 4 ° C. Thaw Matte im Eis bei 4 ° C über Nacht gefroren. MAT 1:1 zu verdünnen, durch Zugabe von 10 mL eiskaltes IMDM und Chill im Eis bei 4 ° C über Nacht. Verdünnen Sie MAT Mischung mit einem zusätzlichen 20 mL eiskaltes IMDM und Chill im Eis bei 4 ° C über Nacht. Aliquot in vorgekühlt Tuben und Speicher bei-20 ° C bis zur Verwendung. Wenn Sie bereit sind für den Einsatz, tauen Sie MAT Mischung über Nacht bei 4 ° C.
      1. Mantel der Matte Kultur Zellplatten.
        Hinweis: Alle Schritte des MAT Lackplatten sollte auf Eis durchgeführt werden. Pre-chill 6-Well und 24-Well-Platten bei-20 ° C für mindestens 1 h. Wenn Sie Fell Platten fertig sind, legen Sie sie auf dem Eis. Jedes gut mit 4 X verdünnt Matte entfernen und die Wiederverwendung von jede überschüssige Lösung zu beschichten. Lassen Sie für 30-60 min auf Eis und aspirieren Sie überschüssige Matte. Trocknen Sie die Matten beschichteten Platten in einem 37 ° C 5 % CO 2 Inkubator für ein Minimum von 3 h. Verwendung innerhalb von 72 h Beschichtung.
    8. Bereiten Sie die Lösung 10 % Bovine Serum Albumin (BSA) durch Auflösen von 10 % w/V BSA im eiskalten, destilliertem, entionisiertem Wasser bei 4 ° C für ca. 3-4 h Filter mit 2 µm Filter in einer lichtundurchlässigen Flasche und speichern bei 4 sterilisieren ° C.
    9. Bereiten Sie die Ascorbinsäure-Lösung. Lösen Sie langsam eine 5 mg/mL Lösung von L-Ascorbinsäure in eiskalten, destilliertem, entionisiertem Wasser auf Eis für 3-4 h Wirbel gelegentlich bis aufgelöst auf. Filter mit 2 µm Filter zu sterilisieren und speichern Aliquote bei-20 ° c
    10. Serumfreien Differenzierung (SFD) Medien vorbereiten, indem man eine Lösung von 75: 25 von IMDM:Ham ' s f-12, dann fügen Sie 0,5 % BSA, 1 x B27 und 0,5 x N2 Ergänzungen. Bei 4 ° C. Add 1 x L-Glutamin, 50 µg/mL Ascorbinsäure 400 µM MTG und 150 µg/mL Holo-Transferrin unmittelbar vor der verwenden.
    11. Bereiten serumfreien Stammzellen Nährmedien (z. B. StemPro, genannt SP34 hereon) pro Hersteller ' Anweisungen. Bei 4 ° C. Add 1 x L-Glutamin, 50 µg/mL Ascorbinsäure 400 µM MTG und 150 µg/mL Holo-Transferrin unmittelbar vor der verwenden.
    12. 0,2 % Kollagenase II Lösung durch auflösende Kollagenase II, eine Endkonzentration von 0,2 % w/V in 1:4 FBS:PBS Lösung zubereiten. Lösen sich im Wasserbad 37 ° C für mindestens 15 min. Filter Lösung mit 2 µm Filter zu sterilisieren und speichern Aliquote bei-20 ° c
    13. Bereiten die Fluoreszenz aktiviert Zelle sortieren (FACS) Puffer als eine Lösung von 5 % FBS in IMDM unmittelbar vor der verwenden.
    14. Bereiten OP9 Medien als Lösung der α-MEM, 20 % FBS, 2 mM L-Glutamin und 1 X Antibiotika. Filter mit 2 µm Filter zu sterilisieren und Lagerung bei 4 ° c
    15. Zu Methylcellulose-basierte Medien (z. B. MethoCult, als MeC hereon bezeichnet) erhalten, als Pre-regelmÄÑig 3 mL Mengen oder als einen 100-mL-Flasche. Wenn die 100 mL MeC, bei der Ankunft, mit Teilen in 2,5 mL Aliquots in 14 mL konische Röhrchen.
      Hinweis: Alle Aliquote lagern Sie bei-20 ° c MeC mittleren Aliquote sollte unmittelbar vor dem Auftauen verwenden.

2. Mesoderm Differenzierung der hPSCs

  1. wachsen der hPSC Zelllinien auf MEFs zu 70-80 % Konfluenz in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % CO 2.
    Hinweis: Sollte die hPSCs scharfe, undifferenzierte Grenzen haben.
  2. Bereiten Matte beschichtet Plasticware 24 h vor der hPSCs Passagierung.
    Hinweis: Die Gesamtzahl der Matte beschichtet 6 wohlen Teller variiert hPSC Linien. In der Regel genügen drei 6-wohlen Teller pro 6-Well Schale von konfluierende hPSCs auf MEFs.
    1. Perform Freiung Feeder-Erschöpfung mit unterschiedlichen Seitenverhältnissen konfluierende hPSCs:MAT Wells (1:4, 1:3, 1:2, etc.) vor der ersten Differenzierung bestimmen, wieviele Matte beschichtet 6 wohlen Teller für nachfolgende Differenzierungen verwendet werden sollen.
      Hinweis: sollte 24 h nach der Beschichtung auf Matte, die hPSCs 80-90 % Zusammenfluss mit Zelle Klumpen von ca. 10-20 Zellen in der Größe sein.
  3. Aspirieren hPSC Medien und 1 mL 37 ° C 0,25 % Trypsin-EDTA zu jedem gut für 1 min. Absaugen und fügen Sie 1 mL STOP Medien in jede Vertiefung. Mit einem Zelle Schaber, kratzen Sie die Zellen aus der Platte. Fügen Sie 1 mL Waschpuffer in jede Vertiefung.
    1. Mit einer 2 mL serologische pipettieren, genannte 3 - 5 Mal zu brechen große Klumpen von Zellen und die Zellen auf ein 50 mL konische Rohr übertragen. Zentrifuge hPSCs 330 X g für 5 min.
  4. Aufschwemmen der Zellen in einem Gesamtvolumen von hPSC Medien entspricht 2 mL pro Well von der Matte beschichtet Kunststoffteile verwendet werden. Die Kunststoffteile 2 mL/Brunnen des hPSCs hinzu und inkubieren Sie über Nacht in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % CO 2.
  5. 24 h später, aspirieren Sie die Medien und ersetzen Sie mit 37 ° C 0,05 % Trypsin-EDTA für 1 min. Aspirieren Trypsin-EDTA und 1 mL STOP Medien hinzufügen. Kratzen Sie die Zellen kräftig mit einer Zelle-Spachtel. Fügen Sie 1 mL WASH Medien in jede Vertiefung. Mit einer 2 mL serologische Pipettieren genannte Zellen 1-2 Mal und auf eine 50 mL konische Rohr übertragen. Zentrifugieren Sie Zellen bei 220 X g für 5 min.
    Hinweis: Die Länge der Zeit von Trypsin-EDTA Behandlung shouLD werden durch den Prüfarzt für jede hPSC Zeile bestimmt. Die Trypsin-Behandlung sollte so lange wie möglich angewendet werden, ohne dass einzellige Dissoziation. Dieser Schritt sollte lösen alle hPSCs von den MAT-beschichteten Platten, aber nicht in einzelne Zelle Dissoziation führen. Daraus resultierende EBs sollte im Durchschnitt 6-10 Zellen,.
  6. Aspirieren der Medien. Mit einer 5 mL serologische pipettieren, sanft Aufschwemmen der Zellen in 20 mL WASH Medien. Zentrifuge bei 220 X g für 5 min.
  7. Sanft Aufschwemmen der EBs im Tag 0 Medien (Tabelle 1). 2 mL der Differenzierung Medien mit EBs in jede Vertiefung eine 6-Well Low-anhaftende Zelle Kulturschale mit einer 10 mL serologische Pipettieren zu verzichten. Platz in einem 37 ° C 5 % CO 2 5 % O 2 (Multi-Gas) Inkubator.
    Hinweis: Tag 0 Medien: SFD Medien ergänzt mit 10 ng/mL BMP4 (Tabelle 1). Für jeden zwei Platten aus hPSCs, verwenden Sie ein 6-Well Low-anhaftende Zelle Kulturschale.
  8. 24 h später hinzufügen 2 mL Tag1 Medien (Tabelle 1). Die Zellen über Nacht in einem Multi-Gas-Inkubator inkubieren.
    Hinweis: Tag 1 Medien: SFD Medien ergänzt um 10 ng/mL BMP4 und 10 ng/mL bFGF in jede Vertiefung (Tabelle 1).
  9. 18 h später sanft ernten die EBs mit 5 mL serologische pipettieren und Spin 100 X g für 5 min. Waschen und die gesamte Kultur mit 10 mL IMDM kombinieren. Spin 100 X g für 5 min. Aspirat Medien.
    Hinweis: Schmutz gibt es in den Kulturen. Dieser Zentrifugationsschritt bei niedriger Drehzahl (100 X g) werden die Trümmer entfernt.
  10. Sanft Aufschwemmen der EBs in SFD Medien ergänzt mit Tag2 Medien (Tabelle 1) und dann 2 mL pro Bohrloch in 6-Well Low-anhaftende Zellplatten Kultur zu verzichten. Brüten in einem 37 ° C-Multi-Gas-Inkubator für 30 h
    Hinweis: Tag 2 Medien: 10 ng/mL BMP4, und 5 ng/mL bFGF und die entsprechenden WNT Agonist oder Antagonist (Tabelle 1).
    1. Add 3 µM CHIR99021 endgültige hämatopoetische Vorläuferzellen angeben. Alternativ fügen Sie 3 µM IWP2 und 1 ng/mL Activin A primitive hämatopoetische Vorläuferzellen angeben.
  11. Weiter zu Abschnitt 3 für Angabe der hämatopoetischen Vorläuferzellen.

3. Spezifikation von CD34 + hämatopoetischen Vorläuferzellen

  1. nach 30 h, isolieren die EBs mit einer 2 mL serologische Pipettieren am Tag3 der Differenzierung. Übertragen auf ein 50 mL konische Rohr und Zentrifugieren bei 330 X g für 5 min. sanft Aufschwemmen und waschen mit 10 mL IMDM. Zentrifugieren Sie die Zellen wieder bei 330 X g für 5 min.
  2. Aufschwemmen der EBs in Tag3 Medien (Tabelle 2) und 2 mL in jede Vertiefung des Low-Anhänger 6-Well Platten zu verzichten. Inkubieren Sie Zellen in einem 37 ° C-Multi-Gas-Inkubator für 72 h
    Hinweis: Tag 3 Medien: SP34, ergänzt mit 15 ng/mL VEGF und 5 ng/mL bFGF (Tabelle 2). Fügen Sie mehr Medien pro Bohrloch hinzu, wenn der pH-Wert des Mediums, geerntet am Tag3 der Differenzierung (d.h., gelb-Orange-Medien) erheblich verändert hat. Alternativ verwenden Sie weniger EBs pro Bohrloch am Tag 0.
  3. Nach 72 h Inkubationszeit, fügen Sie 2 mL Tag 6 Medien (Tabelle 2) in jede Vertiefung. Brüten in einem 37 ° C-Multi-Gas-Inkubator für weitere 48 h
    Hinweis: Tag 6 Medien: SP34 Medien ergänzt mit 15 ng/mL VEGF, 5 ng/mL bFGF, 200 ng/mL SCF, 4 IU EPA, 20 ng/mL IL-6, 10 ng/mL IL-11 und 50 ng/mL IGF-1 (Tabelle 2). Wenn mehr Medien in Schritt 3.1 hinzugefügt wurde, fügen Sie die entsprechende Menge an Medien in Schritt 3.2 so dass die endgültige Zytokin-Konzentrationen unverändert.
  4. Isolieren der CHIR99021 behandelt EBs am 8. Tag der Differenzierung. Fahren Sie mit Abschnitt 4.
  5. IWP2-behandelten EBs am 8. Tag der Differenzierung in ein 50 mL konische Röhrchen geerntet werden. Zentrifuge bei 330 X g für 5 min. sanft Aufschwemmen in Tag 8 Medien (Tabelle 2). 24 h in einem 37 ° C 5 % CO 2 Inkubator in niedrigen anhaftende Gerichte inkubieren. Fahren Sie mit Abschnitt 4.
    Hinweis: Tag 8 Medien: SP34 Medien ergänzt mit 100 ng/mL SCF 2 IU EPA, 10 ng/mL IL-6, 5 ng/mL IL-11, 25 ng/mL IGF-1, 30 ng/mL TPO, 10 ng/mL Flt3-L und 30 ng/mL IL-3 (Tabelle 2).

4. Enzymatische Dissoziation der EBs und hämatopoetischen Vorläuferzellen Isolation

  1. isolieren die EBs mit einer serologischen Pipettieren in ein 50 mL konische Rohr. Zentrifuge bei 330 X g für 5 min. Aspirat aus der Überstand.
  2. 2 mL 0,25 % Trypsin-EDTA hinzufügen der EBs. Vortex für 5 S. Inkubation bei 37 ° C Wasserbad für 8 min. hinzufügen 5 mL Stopp-Lösung. Zentrifuge bei 330 X g für 5 min. Aspirat aus der Überstand.
  3. Aufschwemmen der EBs in 5 mL Kollagenase II. Wirbel für 5 s und im Wasserbad 37 ° C inkubieren. Nach 60 min, Wirbel für 5 s und 5 mL Stopp-Lösung. Drehen mit 330 X g für 5 min. Aspirat aus der Überstand.
  4. In 1 mL des Puffers FACS, Aufschwemmen der Zellen. Ein 40 µm-Sieb Zelle durchlaufen Sie Zellen. Dies entfernt alle undissoziierten Zelle Klumpen.
  5. Zählen die Zellen. Aliquoten 1 x 10 6 Zellen in ein 14 mL konische Rohr. Drehen der Zellen bei 330 X g für 5 min. Aufschwemmen der Zellen in einer Konzentration von 5 x 10 6 Zellen/mL in Puffer FACS. Aliquoten und Pool 10 % der Zellen in jedem Zustand für Ablaufsteuerungen durchflusszytometrischen Farbe. Die Zellen Antikörper für 30 min auf Eis, im Dunkeln inkubieren.
    Hinweis: Siehe Fluorophor Kombinationen in Tabelle Materialien vorgeschlagen.
    1. Für IWP2-behandelten Zellen verwenden Antikörper Anti-CD34 und Anti-CD43.
    2. Für CHIR99021-behandelten Zellen verwenden Sie Anti-CD34, Anti-CD43, Anti-CD73 und Anti-CD184 Antikörper.
  6. Die Zellen zweimal mit FACS Puffer spülen. Drehen sich mit 330 X g für 5 min. Aufschwemmen der Zellen auf eine Endkonzentration von 5 x 10 6 Zellen/mL.
  7. Analysieren oder Isolat Zellen durch Durchflusszytometrie. Analysieren Sie für primitive hämatopoetischen Vorläuferzellen die CD34 und CD43 Ausdruck ( Abbildung 2A). Für definitive hämatopoetischen Vorläuferzellen, isolieren das HE (CD34 + CD43 − CD73 − CD184 −) durch FACS ( Abb. 2 b). Sammeln Sie die Zellen in Röhrchen mit gekühlten FACS Puffer.
  8. Zu beurteilen, das definitive hämatopoetische Potenzial von isolierten HE, weiter zu Abschnitt 5 für den Endothelzellen, hämatopoetischen Übergang oder Abschnitt 7 für T-lymphatischen Assay. Weiterhin für primitive hämatopoetischen CFC-Assays, Abschnitt 6.

5. Endothelial-hämatopoetischen Übergang

  1. Spin der isolierten CD34 + CD43 − CD73 − CD184 − Zellen bei 330 X g für 5 min. Aufschwemmen Zellen in er Medien bei 200.000 Zellen/mL ( Tabelle 2). Verteilen Sie die Zellen in 50 µL-Aliquots in eine 96-Well Low-anhaftende Zellplatte Kultur. Die Zellen über Nacht in einem 37 ° C 5 % CO 2 5 % O 2 Multi-Gas Inkubator inkubieren.
    Hinweis: Er Medien: SP34 Medien ergänzt mit 5 ng/mL VEGF, 5 ng/mL bFGF, 100 ng/mL SCF, 2 IU EPA 10 ng/mL IL-6, 5 ng/mL IL-11, 25 ng/mL IGF-1, 30 ng/mL TPO, 10 ng/mL FLT3-L, 30 ng/mL IL-3, 10 ng/mL BMP4, 20 ng/mL SHH, 10 µg/mL Angiotensin II und 100 µM Losartan Kalium bei 2 x 10 5 Zellen/mL (Tabelle 2).
  2. Bereiten Sie die 24-Well MAT-beschichtete Platten (siehe Schritt 1.2.7.1),.
  3. Werden die Zellen über Nacht in Klumpen von 6-10 Zellen aggregieren. Übertragen Sie für jede 50 µL Volumen von reaggregated Zellen sanft die Zellen in der Mitte einer 24-Well MAT-beschichtete Platte am nächsten Morgen. Sanft lege Platte in 37 ° C Multi-Gas Inkubator für 4-6 h, bis die Zellen verbunden sind.
  4. Add 1 mL frisch HE Medien in jede Vertiefung, nachdem die Zellen verbunden sind. Die Zellen in einem 37 ° C 5 % CO 2 5 % O 2 Multi-Gas Inkubator inkubieren, bis die blutbildenden Zellen sichtbar sind (in der Regel 5-7 Tage; Abb. 2D). Weniger als 100 X Vergrößerung mit einem Lichtmikroskop zu visualisieren.
  5. Ernten die definitive hematopoietic Vorfahre indem Sie sanft den HE-Medien aus Zellen. Dieses Medium durch ein 40 µm Zelle Sieb passieren und sammeln. Adhärenten Zellen in den Brunnen, hinzufügen 0,5 mL 0,25 % Trypsin-EDTA, Zellen und Inkubation bei 37 ° C für 5 min. hinzufügen 0,5 mL Stopplösung in jede Vertiefung. Durchlaufen Sie die Zellen durch die gleichen 40 µm Zelle Sieb, alle Anhänger zu bündeln und nicht anhaftende Zellen zusammen. Drehen mit 330 X g für 5 min.
    1. Um die CFC-Potenzial dieser Massen-Kultur zu beurteilen, fahren Sie mit Abschnitt 6.
  6. Zellen zweimal im FACS Puffer zu waschen. Drehen mit 330 X g für 5 min.
  7. Aufschwemmen der Zellen in FACS Puffer 5 x 10 6 Zellen/ml. Die Zellen mit Anti-CD45 und Anti-CD34 Antikörper für 30 min auf Eis im Dunkeln Fleck (vorgeschlagen Fluorophore sind in der Tabelle der Werkstoffe).
  8. Waschen die Zellen zweimal in FACS-Puffer. Drehen mit 330 X g für 5 min.
  9. Isolieren die CD34 + CD45 + Zellen durch FACS ( Abbildung 2E). Sortieren Sie die Zellen in gekühlten FACS Puffer.
  10. Bewerten die definitive CD34 + CD45 + hämatopoetischen Vorläuferzellen als benötigte (CFC Assay in Abschnitt 6, lymphatischen Potenzial in Abschnitt 7 oder eine andere wissenschaftsinitiierten Assay).

6. CFC-Assay

  1. tauen Aliquote des MeC für jede Probe für die CFC-Assay verwendet.
  2. Der Zellen zu definierten (Schritte 4.5, 4.7, 5.5 oder 5,9) in MeC hinzufügen. Vortex gründlich und lassen Sie die MeC-Kulturen für 5-10 min, stehen bis Luftblasen zu, gemäß der Hersteller zerstreuen ' Anweisungen. Mit einem 16 ½ gauge Nadel auf eine 3 mL Spritze, entfernen Sie vorsichtig die MeC 2 mL.
    Hinweis: Typische Beschichtung dichten reichen von 1.000-20.000 Zellen/mL, abhängig von der Häufigkeit der erwarteten Vorläuferzellen.
  3. Verzichten, sorgfältig, 1 mL MeC Zelle Mischung in jedem der zwei 35 mm Gewebekultur Schalen. Verteilen Sie gleichmäßig die MeC in den 35 mm-Gerichten durch sanft klopfen und drehen der Schale. Legen Sie jedes der oben genannten Gerichte in einem 15 cm Gewebekultur Schüssel mit Wasser gefüllt. In einem 37 ° C 5 % CO 2 Inkubator inkubieren.
  4. Visualisieren die MeC-Kulturen mit einem Licht Mikroskop 40 X Vergrößerung. Quantifizieren Sie die verschiedenen FCKW erhalten. Analysieren Sie die primitiven CFC-Assays 8-10 Tage nach der Beschichtung ( Abbildung 2). Analysieren Sie die Definitive CFC-Assays 14 Tage nach der Beschichtung. Repräsentative CFC Assay Kolonie Morphologien sehen Sie in Abbildung 2F.

7. T-Zell-Assay etablieren Definitive hämatopoetischen Potenzial

  1. , wachsen die OP9 DL4 Zellen bis zum Zusammenfluss in 100 mm Gewebekultur Gericht 30 31 , 32.
    1. Tauwetter OP9-DL4 Zellen 72-96 h vor der Beschichtung der T-Zell-Assays. Aufschwemmen Sie OP9 DL4 Zellen in 10 mL OP9 Medien und in einem 10 cm Teller zu verzichten. Wachsen in einem 37 ° C 5 % CO 2 Inkubator bis 70-90 % Zusammenfluss.
    2. Bis zur Ernte der OP9 DL4 Zellen aus einer Schüssel 100 mm entfernen Sie das Medium und 5 mL 0,25 % Trypsin-EDTA 5 min. stoppen die Trypsin-Aktivität mit 5 mL OP9 Medien. Drehen der Zellen bei 330 X g für 5 min. Aufschwemmen Zellen in 1 mL OP9 Medien und die Zellen zu zählen.
      Hinweis: Ein 10 cm Teller konfluierende OP9 DL4 Zellen ergibt ca. 10 x 10 6 OP9 DL4 Zellen.
    3. 48 h vor der T-Zell-Test, Platte 2 x 10 6 Zellen in 12 mL OP9 Medien in einer 24-Well-Schale (0,5 mL/Na). Wachsen in einem 37 ° C 5 % CO 2 Inkubator.
  2. 1 von OP9 DL4 Zellen in OP9 Medien ergänzt mit gut 2.000-10.000 Zellen untersucht werden (wie in den Schritten 4.5, 4.7, 5.5 oder 5,9) hinzufügen: 30 ng/mL SCF (ersten 6 Tage nur), 5 ng/mL IL-7 und 5 ng/mL FLT3-L. Inkubation bei 37 ° C 5 % CO 2 inc Ubator. Keine Medien Änderungen bei diesem Schritt.
  3. Alle 4 - 5 Tage, passage die T Zelle Vorfahre auf Frischzellen OP9 DL4 Stromatumoren in einer 6-Well-Schale. Genannte Zellen mit einer 1 mL pipettieren und durchlaufen einen 40 µm-Filter um Klumpen zu entfernen. Drehen Sie mit 330 X g für 5 min. Absaugen aus den Medien. Aufschwemmen der Zellen in 2 mL frische OP9 Medien ergänzt mit 5 ng/mL IL-7 und 5 ng/mL Flt3-L und auf Frischzellen OP9 DL4.
    Hinweis: 48 h vor Passagierung, Platte 2 x 10 6 OP9 DL4 Frischzellen in 12 mL OP9 Medien und 2 mL/Brunnen in 6-wohlen Teller verteilen.
  4. Nach mindestens 21 Tagen Kokultur genannte Zellen kräftig und durchlaufen einen 40 µm-Filter, Zelle Ablagerungen zu entfernen. Mit 330 X g für 5 min drehen und aspirieren des Überstands.
  5. Waschen die Zellen zweimal im kalten FACS-Puffer. Drehen mit 330 X g für 5 min.
  6. Aufschwemmen der Zellen in FACS Puffer 5 x 10 6 Zellen/ml. Fleck-Zellen mit Anti-CD45, Anti-CD56, Anti-CD4 und CD8-Anti Antikörper für 30 min auf Eis im Dunkeln (empfohlene Fluorophor sind Kombinationen in Table of Materials). Wenden Sie einen lebenden/Toten Zelle Fleck (DAPI, etc.) um Schmutz aus der Analyse.
  7. Waschen die Zellen zweimal in FACS-Puffer. Drehen mit 330 X g für 5 min.
  8. Analysieren die Zellen mit einem Durchflusszytometer um zu beurteilen, das Vorhandensein von T-Lymphozyten Stammväter ( Abbildung 3).

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Ergebnisse

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Eine schematische Darstellung der Induktions von primitiven und endgültige hämatopoetischen Vorläuferzellen aus hPSCs ist in Abbildung 1dargestellt. Mesoderm Musterung von kanonischer WNT signalisieren, während der 2. und 3. Tag der Differenzierung, gefolgt von hämatopoetischen Vorläuferzellen Spezifikation auftritt.

Repräsentative durchflusszytometrischen Analyse und koloniebildenden Methylcellulos...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt eine rasche, Serum-frei, Stroma Methode für die Differenzierung von primitiven oder definitive hämatopoetischen Vorläuferzellen. Mesodermalen Spezifikation der primitiven oder definitive hämatopoetischen Vorläuferzellen kann zuverlässig mit unserem Protokoll, welches eindeutig niedermolekularer Hemmer der kanonischen WNT signalisieren nutzt erreicht werden. Bühne-spezifische WNT Aktivierung durch den GSK3β-Inhibitor CHIR9902133 gibt Anlass zu endgültigen hämatopoetische...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde von der Abteilung für Innere Medizin, Abteilung Hämatologie, Washington University School of Medicine unterstützt. CD wurde von T32HL007088 von der National Heart, Lung and Blood Institute unterstützt. CMS wurde von einer amerikanischen Gesellschaft von Hämatologie Scholar Award unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMD)Corning10-016
Fetales Rinderserum (FBS), ES-Zell-bewertetGemini Bioproducts100-500
Fötales Rinderserum (FBS)HyklonSH30396,03
L-Glutamin, 200 mM LösungLife Technologies25030-081
Penicillin-StreptomycinLeben Technologies15070-063
0,25 % Trypsin-EDTALife Technologies25200056
0,05 % Trypsin-EDTALife Technologies25300054
Gelatine, Schweinehaut, Typ ASigma-AldrichG1890
Alpha-MEMLife Technologies12000-022
DMEM-F12Corning10-092-CV
Knock-out-SerumersatzLife Technologies10828028"KOSR"
Nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA)Life Technologies11140050
b-Mercaptoethanol, 55 mM LösungLife Technologies21985023
SalzsäureSigma-AldrichH1758
Fraktion V, RinderserumalbuminFisher ScientificBP1605
Ham's F12Corning10-080
N2 SupplementLife Technologies17502048
B27 Supplement, kein Vitamin ALife Technologies12587010
Stempro-34 (SP34)Life Technologies10639011"SP34"
Wachstumsfaktor reduziert MatrigelCorning354230"MAT"
L-absorbierbare SäureSigma-AldrichA4403
HumanserumtransferrinSigma-Aldrich10652202001
Monothioglycerin (MTG)Sigma-AldrichM6145
Kollagenase BRoche11088831001
Kollagenase IILife Technologies17101015
DNaseICalbiochem260913
phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Life Technologies14190144
bFGFR& D Systems233-FB
BMP4F& Technik D Systems314-BP
Activin AF& T D Systems338-AC
VEGFF& Technik D Systems293-VE
SCFF& Technik D Systems255-SC
IGF-1F& Technik D Systems291-G1
IL-3F& Technik D Systems203-IL
IL-6R& D Systems206-IL
IL-7F& Technik D Systems207-IL
IL-11R& D Systems218-1L
TPOF& Technik D Systems288-TP
EPOPeprotech100-64
Flt-3 Ligand (FLT3-L)R& D Systems308-FK
CHIR99021Tocris4423
IWP2Tocris3533
Angiotensin IISigma-AldrichA9525
Losartan KaliumTocris3798
CD4 PerCP Cy5.5 Klon RPA-T4BD Biosciences560650Verdünnung 1:100; T-Zell-Assay
CD8 PE Klon RPA-T8BD Biosciences561950Verdünnung 1:10; T-Zell-Assay
CD34 APC Klon 8G12BD Biosciences340441Verdünnung 1:100; EHT-Assay
CD34 PE-Cy7 Klon 8G12BD Biosciences348801Verdünnung 1:100; Hämogenes Endothel
CD43 FITC Klon 1G10BD Biosciences555475Verdünnung 1:10; Hämogenes Endothel
CD45 APC-Cy7 Klon 2D1BD Biosciences557833Verdünnung 1:50; T-Zell-Assay
CD45 eFluor450 Klon 2D1BD Biosciences642284Verdünnung 1:50; EHT-Assay
CD56 APC Klon B159BD Biosciences555518Verdünnung 1:20; T-Zell-Assay
CD73 PE Klon AD2BD Biosciences550257Verdünnung 1:50; Hämogenes Endothel
CD184 APC Klon 12G5BD Biosciences555976Verdünnung 1:50; Hämogenes Endothel
4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)BD Biosciences564907Verdünnung 1:10.000; T-Zell-Assay
OP9 DL4 ZellenHolmes, R. und J.C. Zuniga-Pflucker. Kalte Quelle Harb Protoc, 2009. 2009(2): p. pdb prot5156
MethoCult H4034Stemcell Technologies4034"MeC"
Milli-Q WasseraufbereitungssystemEMD Millipore
5% CO2-InkubatorSet bei 37 C
Multigas-InkubatorSet bei 37 C, 5% CO2, 5% O2
6-Well-GewebekulturplatteCorning353046
24-Well-GewebekulturplatteCorning353226
6-Well-Gewebekulturplatte mit geringer AdhärenzCorning3471
24-Well-Gewebekulturplatte mit geringer AdhärenzCorning3473
35-mm-GewebekulturschalenCorning353001
Nadel mit stumpfem Ende, 16-Gauge-Corning-Spritzen
ccCorning309657
5 mL Polypropylen ReagenzglasCorning352063
5 mL Polystyrol ReagenzglasCorning352058
15 mL Polypropylen konischCorning430791
50 mL Polypropylen konischCorning430921
2 mL serologische PipetteCorning357507
5 mL serologische PipetteCorning4487
10 mL serologische PipetteCorning4488
25 mL serologische PipetteCorning4489
ZellschaberCorning353085
2,0 mL KryofläschchenCorning430488
5 mL Reagenzglas mit 40 & Mikro; M ZellensiebCorning352235
40 µ M ZellsiebCorning352340
Zellkulturzentrifuge
Biosicherheitshaube
FACS AriaII oder gleichwertig
LSRii oder gleichwertig
FlowJo SoftwareTreeStar
WasserbadSet bei 37 °C
0,22 &Mikro; M FiltersystemCorning
Autoklav
4 C Kühlschrank-20
C Gefrierschrank-80
C Gefrierschrank
305198 3

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Embryoid Body FormationMesoderm SpecificationGSK3 InhibitorPORCN InhibitorVEGF TreatmentFACS IsolationFlow Cytometry

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