Methodenartikel

Ein Fluoreszenz-basierte Lymphocyte Assay geeignet für Hochdurchsatz-Screening von kleinen Molekülen

DOI:

10.3791/55199

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10. März 2017

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1Department of Microbiology, Infectiology and Immunology, Université de Montréal, 2Department of Pharmacology and Physiology, Université de Montréal, 3Molecular Biology Program, Université de Montréal

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir präsentieren in der aktuellen Studie eine neuartige fluoreszenzbasierten Assays von einer transgenen Maus abgeleiteten Lymphozyten. Dieser Assay ist für Hochdurchsatz-Screening (HTS) von kleinen Molekülen dotiert mit einer Kapazität von entweder Hemmung oder Förderung der Lymphozytenaktivierung geeignet.

Zusammenfassung

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High-Throughput-Screening (HTS) ist derzeit die Hauptstütze für die Identifizierung chemischer Einheiten fähig biochemischer Reaktionen oder zellulärer Prozesse zu modulieren. Mit der Weiterentwicklung der Biotechnologien und der hohen translationale Potenzial von kleinen Molekülen, eine Reihe von innovativen Ansätzen in der Wirkstoffforschung entwickelt haben, die den wieder auflebenden Interesse an der Verwendung von HTS erklärt. Die Onkologie Bereich ist derzeit der aktivste Forschungsgebiet für Wirkstoff-Screening, ohne großen Durchbruch für die Identifizierung neuer immunmodulatorischer Verbindungen Targeting Transplantation Komplikationen im Zusammenhang mit oder Autoimmunerkrankungen gemacht. Hier stellen wir ein neues in vitro murine fluoreszenzbasierten Lymphozyten - Assay zur Identifizierung neuer immunmodulatorischen Verbindungen leicht angepasst. Dieser Assay verwendet T- oder B-Zellen von einer transgenen Maus abgeleitet ist, in dem der Promotor Nur77 GFP-Expression auf T- oder B-Zellen-Rezeptor-Stimulation steuert. Da die GFP Intensität spiegelt dieAktivierung / transkriptionale Aktivität der Zielzelle, unser Test definiert einen neuen Werkzeug, um die Wirkung der gegebenen Verbindung (en) auf die zelluläre / biologische Reaktionen zu untersuchen. Verwendung von 4.398 Verbindungen in Abwesenheit eines "Zielhypothese" wurde zum Beispiel ein primäres Screening durchgeführt, die auf die Identifizierung von 160 potentiellen Treffer anzeigt immunmodulatorischen Aktivitäten führte. Somit ist die Verwendung dieses Assays für die Wirkstoffforschung Programme Erforschung großer chemischer Bibliotheken vor geeignet , um in vitro / in - vivo - Validierungsstudien fördern.

Einleitung

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Hochdurchsatz-Screening (HTS) ist eine bewährte Strategie weithin für die Identifizierung neuer therapeutischer Moleküle oder für die Neupositionierung von FDA-zugelassenen Medikamente in neuen medizinischen Indikationen angenommen. 1 Bisher kann die erzielte HTS Erfolg durch die Fülle der bisher entdeckten Drogen gemessen werden. Zum Beispiel verwendet der Tyrosinkinaseinhibitor lapatinib für die Behandlung von Brustkrebs, sitagliptin; ein Dipeptidyl-Peptidase-4 (DPP-4) Inhibitors als antihyperglykämischen Medikament, und die orale Bcr-Abl-Tyrosinkinase-Inhibitor dasatinib für die Behandlung von chronischer myeloischer Leukämie stellen einige Beispiele für eine lange Liste von zugelassenen Medikamente ursprünglich entdeckt, verwendet durch HTS. 2 Obwohl die Produktivität der pharmazeutischen Industrie in letzter Zeit von einem Mangel in der Entdeckung neuer chemischer Einheiten erlitten hat, kann die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Wirkstoffforschung durch eine Erhöhung der Anzahl der vorklinischen Candida verbessert werdentes Anzeige modulierende biologische / biochemische Eigenschaften. Dementsprechend könnte die Entwicklung von neuen HTS-Assays zur phänotypischen Screening angepasst bieten das Potential wichtige pharmakologische Werkzeuge zur Entdeckung neuer Medikamente Treffern zu liefern. 3, 4, 5, 6 Darüber hinaus HTS kann nun in einem schnelleren Tempo durchgeführt werden aufgrund erheblichen technologischen Veränderungen in den letzten Jahren mit speziell entwickelten flexiblen Roboterinstallationen, neue Auslesetechnologien und umfassende Miniaturisierung. 2, 7 Unter den Faktoren , die zu dem wachsenden Interesse an der Verwendung von phänotypischen Screening (auch bekannt als Vorwärts-Pharmakologie) ist die Wahrnehmung beitragen , dass eher als vereinfachend reduktionistischen Annahmen über funktionale Effekte konzentriert in Bezug auf molekulare Targets (Zielbasierte Screening / biochemische Reaktionen) wahrscheinlicher ist , zu sho w klinische Wirksamkeit. Somit hält phänotypischen Screening versprechen neue potentiell therapeutischen Verbindungen und molekularen Mechanismen von derzeit unheilbar Krankheiten aufzudecken. 2

Um richtig Inhibitoren oder Aktivatoren für eine gegebene molekulare Ziel oder die Zellfunktion zu identifizieren, ein hoch empfindlicher und zuverlässiger Assay erforderlich ist, um zwischen bona fide - Hits und Fehlalarme zu unterscheiden. Also, was macht einen guten Test? Die Qualität eines gegebenen Assay müssen zunächst durch das Signal-zu-Rausch-Verhältnis beurteilt werden (durch einen Z-Faktor reflektiert). 8 Zweitens ist die gezielte Wirkung oder das Ziel des Bildschirms sollte eindeutig festgelegt. Zum Beispiel, funktionale zellbasierte Ansätze können erhebliche Vorteile für die Rezeptor-Screening bieten als die Bindung an einen Assay spezifisch zu beurteilen Ligand-Rezeptor entworfen gegenüber. Der Grund dafür ist, dass der letztgenannte Ansatz nicht zwischen Agonisten- und Antagonisten-Liganden unterscheiden.ss = "xref"> 9 Im Gegensatz dazu ist eine zellbasierte Ansatz ist wahrscheinlich (, Zellzyklusarrest, Apoptose und / oder Differenzierung Proliferation) zu sein , kann effektiver als Rezeptor - Funktion direkt in einem biologischen Phänotyp beurteilt werden. Es muss jedoch beachtet werden, daß biochemische Assays wesentliche Vorteile gegenüber phänotypischen Assays stellen können, da sie auf einem spezifischen intrazellulären Ziel verletzen. Eine gut optimierte biochemische Assays haben in der Regel weniger Datenstreuung als eine phänotypische Screening während danach Untersuchungen zum Drogen molekularen Wirkmechanismus der im Zusammenhang zu vereinfachen. Jedoch ist der Hauptnachteil der zielbasierten oder biochemischen Assays die Wahrscheinlichkeit, die Rate falsch positiver Treffer Amplifizieren die unspezifischen Targets beeinflussen können, wenn sie in einem biologischen System (Verlust der Spezifität ursprünglich untersucht in der biochemischen Assay) getestet. 10 Obwohl ein gut etabliertes Grenzpunkt zwischen negativen und positiven Treffer können die Anzahl der Fehlalarme zu minimieren in die primäre Screening, die Verwendung eines physiologisch relevanten System die nativen zellulären Umgebung wie intakte Zellen, Gewebe oder ganzen ganze Tier nachahmt bleibt der Kern des Assaydesigns Pendels. Daher ermöglicht phänotypischen Screening Leitstruktursuche mit wünschenswerten biologischen / phänotypischen Wirkungen für Krankheiten, bei denen keine Angriffspunkte für Medikamente ohne vorherige Kenntnis der Verbindung der Aktivität oder Wirkungsweise aufweist. 11

Die hierin Studie bezieht sich auf die Entwicklung und Erprobung eines optimierten und reproduzierbaren Screening phänotypische basiert auf zwei wichtigen Komponenten: eine handelsübliche Maus-Modell und einem gruppierten Unterfamilie von chemischen Verbindungen. In Bezug auf das Tiermodell beruht der Test auf der Verwendung von Lymphozyten aus einer Maus - Stamm abgeleitet (Nur77 GFP) ein bakterielles künstliches Chromosom beherbergt eine Kassette enthält , in dem die Expression des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) von th angetrieben wirde Nur77-Promotor. 12 Das Kennzeichen dieser Stimulation basiert auf der Tatsache , dass Nur77 ein immediate early Gens hochreguliert folgenden T-Zell - Rezeptor (TCR) oder B-Zell - Rezeptor (BCR) Stimulation. 12 Wie für das Screening - Verfahren selbst wurde ein Ansatz verwendet , um das Screening von trivialen Analoga zu helfen , zu vermeiden , während die Zeit eine große chemische Bibliothek zu beurteilen , zu minimieren benötigt (> 10 5 Verbindungen). Dazu wählte eine Datenbank von chemischen Verbindungen, die durch medizinischen Chemikern virtuelles Screening-Tools wurde ausgebeutet zu identifizieren topologisch ähnliche Verbindungen bekannten aktiven Samenstrukturen als Referenzen. Dieser Ansatz erlaubt uns 4398 Verbindungen Einheiten vertreten, eine Gesamt Bibliothek von über 136.000 chemischen Bildschirm.

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Protokoll

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Alle Tier Protokolle wurden von der Animal Care Committee der Université de Montréal genehmigt. Die Mäuse wurden durch allmähliche Einatmen von CO 2 , bis keine Vital eingeschläfert wurden durch Genickbruch folgte beobachtet. Das Verfahren wurde von einem zertifizierten Person durchgeführt, um sicherzustellen, dass die Tiere auf humane Weise eingeschläfert wurden und entsprechend den Empfehlungen des Canadian Council on Animal Care.

1. Herstellung von Splenozyten-Medium und Durchflusszytometrie-Puffer

  1. Führen Sie alle Schritte unter einem 70% igem Ethanol gereinigt biologische Kapuze.
  2. Entfernen Sie 70 ml vorgewärmtes Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 1x Medium (im Handel erhältlich und in gefiltertem Volumen von 500 ml sterile Flaschen geliefert) und in einem sterilen Röhrchen. Das entfernte Medium wird später in dem Protokoll verwendet werden.
  3. Ergänzen die restlichen 430 ml RPMI 1640 1x mit 50 ml inaktiviertes fötales Rinderserum (FBS), 5 ml Penicillin / Streptomycin, 5ml HEPES, 5 ml nicht-essentielle Aminosäuren, 5 ml Natriumpyruvat und 0,05 mL filtriert (1M) 2-Mercaptoethanol.
    HINWEIS: vorwärmen Splenozyten- Medium ein Wasserbad gesetzt bei 37 ° C unter Verwendung von Hitze schockierend Zellen zu vermeiden. Dies ist wichtig, die Induktion von zellulärer Apoptose zu vermeiden.
  4. Um die Durchflusszytometrie-Puffer vorzubereiten, fügen Sie 2 ml FBS bis 98 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und im Kühlschrank aufbewahren bis zur Verwendung (vorzugsweise innerhalb von drei Tagen).

2. Erzeugung von Splenozyten- Zellsuspension von Nur77 GFP - Maus Milzen

  1. Ein isolieren septisch die Milz einer 6-8 Wochen alten weiblichen Nur77 GFP - Maus.
    1. Um dies zu erreichen, arbeiten unter sterilen Haube. Weichen Sie die Maus geopfert Fell, Schere und Pinzette in 70% Ethanol.
    2. Legen Sie die Maus auf der rechten Seite, schneiden Sie die Haut und Muskeln im oberen linken Bauch. Untersuchen Sie den Schnittbereich zu sichtbar die Milz suchen Sie dann schneiden Sie es aus. Halten Sie die Milzin Splenozyten- Medium auf Eis, bis sie bereit, den nächsten Schritt auszuführen.
  2. Legen Sie die Milz (n) in einem 10 cm 2 Zellkulturpetrischale mit 5 ml vorgewärmten Splenozyten- Medium.
  3. Mash die Milz eine sterile Spritzenkolben mit, bis die Lösung trüb ist. Eine Milz Kollagenmatrix sollte Ende des Verfahrens verbleiben.
  4. Nach umfangreichen Maischen in Splenozyten- Medium, sammeln Sie die Zellsuspension und führt es durch eine 70 um Zelle Sieb auf einem Rohr 50 ml platziert filter aus jeglichen Schmutz oder Klumpen.
  5. Zentrifuge bei 500 × g für 5 min. das Zellpellet in 2-3 ml in-house produziert oder kommerziellen roten Blutkörperchen Lysepuffer Nach Verwerfen des Überstandes, wieder aussetzen. Nach Pipettieren (2-3 mal) die Aussetzung Rest für 20-30 s lassen.
  6. 5 ml PBS oder einem geeigneten Puffer der Wahl dann die Zellsuspension bei 500 für 5 min zentrifugieren x g.
  7. Entfernen Sie den Überstand (sollte in der Farbe rot sein, wie es rot b lysiert enthältlood Zellen) und resuspendieren das Zellpellet in 2 ml Splenozyten-Medium.
  8. Mit Hilfe einer Zählkammer, zählen die Anzahl der mit Trypanblau gefärbten Zellen zwischen lebenden und toten (nekrotischen) Zellen zu unterscheiden.

3. T-Zell-Isolation von der Splenozyten- Zellsuspension

  1. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension für 5 Minuten bei 500 x g. Resuspendieren der Zellen in serumfreiem RPMI - Medium (50 ml aus Schritt 1.3) eine zelluläre Konzentration von 10 x 10 6 Zellen / ml zu erhalten.
  2. Übertragen Sie die Zellen in ein 5 ml Polystyrolröhrchen und beiseite stellen eine 100-ul-Aliquot von Splenozyten für Reinheit Beurteilung / Vergleich am Ende des Reinigungsschrittes.
  3. Hinzufügen normale Rattenserum zu der Zellsuspension bei 50 & mgr; l / ml, gefolgt von T-Zell-Isolierung Antikörper-Cocktail (50 ul / ml).
  4. Mischen Sie die Zellsuspension und lassen Sie es für 10 Minuten ruhen. Dieser Schritt erlaubt es dem Antikörper-Cocktail alle unerwünschten Zellen zu binden.
  5. Fügen Sie die Streptavidin schnelle Kugeln (Magnetic Perlen) für 2,5 min, bringen dann das Volumen auf 2,5 ml Serum-freien Medium.
  6. Das Röhrchen wird in einer Zellisolierung Magnet für 3 min.
  7. Übertragen Sie die T-Zellsuspension in ein neues Polystyrolröhrchen durch den Magneten halten und die Lösung in einem Zug Ausgießen.
    HINWEIS: Die isolierte Suspension enthält die gereinigten T-Zellen. Alle unerwünschten Zellen werden auf der Seite des an die magnetischen Streptavidin-Kügelchen gebunden Rohr gehalten.
  8. Zählen Sie die isolierten T - Zellen unter Verwendung von Trypanblau und einer Zählkammer.
    HINWEIS: Bei diesem Schritt kann die Reinheit der isolierten T - Zellen überprüft (optional) werden , indem der Prozentsatz von CD3 + Ereignisse Analyse vor und nach der T - Zell - Isolierung durch Durchflusszytometrie. 13
    1. Kurz gesagt, Zentrifuge 1 ml Splenozyten Zellsuspension bei 500 x g. Überstand verwerfen und die Zellen in Durchflusszytometrie - Puffer bei einer Konzentration von 1 x 10 6 Zellen / ml.
    2. In fluoreszierend-markierte anti-mouse CD3-Antikörper in einer Konzentration von 1: 100. für 30 min bei 4 ° C inkubieren. Waschen Sie einmal, Zentrifuge und resuspendieren in Durchflusszytometrie-Puffer (400 ul) für die Analyse durch Durchflusszytometrie.

4. B-Zell-Isolation von der Splenozyten- Zellsuspension

  1. Folgen Sie dem gleichen Protokoll wie für T - Zellen beschrieben (Schritte 3,1-3,8) , aber eine B-Zell - Isolation - Kit. Für Reinheit Beurteilung, verwenden Sie den CD19 - Antikörper anstelle des CD3 - Antikörper. 13
    1. Für Reinheit Beurteilung (optional), verwenden Sie den CD19-Antikörper anstelle des CD3-Antikörper. Zentrifuge 1 ml Splenozyten-Zellsuspension bei 500 x g. Überstand verwerfen und die Zellen in Durchflusszytometrie - Puffer bei einer Konzentration von 1 x 10 6 Zellen / ml.
    2. Hinzufügen fluoreszierend markierte anti-Maus-CD19-Antikörper in einer Konzentration von 1: 100 und Inkubieren bei 4 ° C für 30 min. Waschen Sie einmal, Zentrifuge und resuspendieren in Durchflusszytometrie-Puffer (400 ul) for Analyse durch Durchflusszytometrie.

5. T-Zell-Aktivierung und die Induktion der GFP-Expression

  1. Samen der T - Zellen, in Suspension, in einen Rundboden 96-Well - Platte in einer Konzentration von 2,5 x 10 5 Zellen / Vertiefung.
  2. Hinzufügen rekombinantem Interleukin (IL) -7 bei 2 ng / mL und CD3 / CD28 Magnetkügelchen (25 & mgr; l / 10 6 Zellen). Halten eines Teils der T-Zellen unbehandelt mit Kügelchen als negative Kontrolle für die spätere Messungen zu dienen, die nicht-aktivierte T-Zellen darstellt.
  3. Zwölf Stunden später ernten die T-Zellen aus der 96-Well-Platte durch vorsichtiges Pipettieren der Zellsuspension in jede Vertiefung nach oben und unten keine Wulst-Zell-Komplex / Aggregate zu brechen. Sammeln Sie die Suspension aus allen Vertiefungen in eine 5 ml Polystyrolröhrchen.
  4. Das Röhrchen wird die Suspension innerhalb der gleichen Zellisolierung Magnet enthält, die zuvor für die Reinigung von T- oder B-Zellen verwendet, und lassen Sie es für 5 Minuten ruhen.
  5. Übertragen Sie die T-Zell-Suspension intoa neuen Polystyrolröhrchen durch den Magneten halten und die Lösung in einem Zug Ausgießen.
  6. Zentrifugieren der Zellen bei 500 xg für 5 min. Wieder die Zellen in frischem Splenozyten- Medium mit einer Konzentration von 2 x 10 6 Zellen / ml zu erhalten.
  7. Beurteilen Sie die GFP-Expression Intensität durch Durchflusszytometrie (optional für die Qualitätskontrolle) bei 12 bis 24 h nach der Stimulation im Vergleich zu nicht-aktivierten T-Zellen. 12
    HINWEIS: Die GFP - Fluoreszenz auf die Nur77 GFP - T - Zellen zu eigen ist und wird bei erfolgreicher Aktivierung des TCR manifestiert. 12
  8. Für die Beurteilung der Lebensfähigkeit und Aktivierung (optional) durch Mikroskopie, färben die aktivierten Zellen mit 30 Hoechst min vor der Analyse bei einer Konzentration von 0,2 ug / ml. In adäquates Volumen der Zellsuspension auf eine Abdeckschlitten oder zu einer Vertiefung einer mit flachem Boden schwarz seitige 384-Well-Platte und untersuchen unter dem Fluoreszenzmikroskop lebenden Zellen zu beurteilen. Tote Zellen werden nicht behalten KernFärbung. 14

6. B-Zell-Aktivierung und die Induktion der GFP-Expression

  1. Mit einem T-25 Kulturflasche, erneut zu suspendieren die isolierten B - Zellen bei 1 × 10 6 Zellen / ml.
  2. Hinzufügen anti-Maus-IgG / IgM (H + L) bei 10 & mgr; l / ml und rekombinante CD40L bei einer Konzentration von 200 ng / mL. Halten eines Teils der B-Zellen unbehandelt als Negativkontrolle zu dienen für die spätere Messungen (die nicht-aktivierte B-Zellen).
  3. Beurteilen GFP-Expressionsintensität durch Durchflusszytometrie bei 12 oder 24 h nach der Stimulation im Vergleich zu nicht-aktivierten B-Zellen.
    HINWEIS: Die GFP - Fluoreszenz ist untrennbar mit dem Nur77 GFP B - Zellen und wird nach erfolgreicher Aktivierung des BCR manifestiert. 12
  4. Für die Beurteilung der Lebensfähigkeit und Aktivierung (optional) durch Mikroskopie, färben die aktivierten Zellen mit 30 Hoechst min vor der Analyse bei einer Konzentration von 0,2 & mgr; g / mL. Hinzufügen ausreichenden Volumen der Zellsuspensionein Deckglas oder eine Vertiefung einer flachen Boden schwarz seitige 384-Well-Platte und untersuchen unter einem Fluoreszenzmikroskop lebenden Zellen zu beurteilen. Tote Zellen werden nicht Kernfärbung behalten. 14

7. High Throughput Screening kleiner Moleküle

  1. Vorbereitung einer Zellsuspension mit 2 x 10 6 Zellen / ml der aktivierten T oder B - Zellen (Magnetkügelchen oder Antikörper / CD40L) oder nicht-aktivierten Gruppen.
  2. Platte 75.000 Zellen / Vertiefung in einer 384-Well-Platte (Volumen von 40 & mgr; l). Verwenden Sie einen flachen Boden schwarz seitige 384-Well-Platte oder ein Mikroskop Abdeckschlitten für die Lebensfähigkeit und die Aktivierung Beurteilung durch Fluoreszenzmikroskopie (optional Schritt der Qualitätskontrolle vor der HTS) unter Verwendung von Hoechst-Färbung (siehe Schritte 5.8 und 6.4 für Details). 14
  3. Manuell oder ein automatisiertes System verwenden, fügen Sie die Medikamente der Wahl (in 0,5% DMSO gelöst) in jede Vertiefung.
  4. Fügen Sie das Fahrzeug (DMSO) zu positiv (aktiviert) und negativen (nicht aktiviert) Kontrollvertiefungen. Einstellen DMSO-Konzentration bis zu einem Maximum von 0,5%.
  5. Inkubieren der Platten für 24 h (oder Inkubationszeit von choice) bei 37 ºC und 5% CO 2.
  6. Am Tag des Screenings, verdünnen die Hoechst 33342 Färbelösung (1:. 3333; für zB 10 & mgr; l - Platten zu den Zellen in den 384-Well -Unternehmen ein Gesamtvolumen von 50 & mgr; l zu erzeugen). Fleck 30 min vor der Analyse durch Zugabe von GFP Hoechst-Lösung mit einer Konzentration von 0,2 ug / ml zu erreichen.
  7. Pipette die Zellen vorsichtig nach oben und unten eine homogene Verteilung in jeder Vertiefung zu erhalten.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig im Falle der Medikamente Abgabe (Schritt 7.3), ein automatisiertes System verwendet, wenn die Zellen an einer Seite des Schachts zu akkumulieren neigen, entgegengesetzt zur Richtung der Strömung.
  8. Drehen die Platten bei 45 × g für 3 min bei Raumtemperatur.
  9. Lassen Sie die Platten ruhen für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
  10. Führen Platte (n) Auslesen, die automatisierten konfokalen hohen Gehalt scre mitkung (HCS) System. 15 Legen Sie die Platte an der Maschine. Stellen Sie das Ziel bei 40-facher oder höherer Vergrößerung. Verwenden Sie die Kamera # 4 für Hoechst (UV-Lampe) und Kamera # 1 für GFP (Laser 488). Stellen Sie das Gerät auf 6-10 Felder pro Vertiefung lesen. Stellen Sie die Maschine bei 488 nm zwei aufeinanderfolgenden Messungen pro Feld zu tun (zu lesen GFP) und UV-Licht (zu lesen Hoechst). Stellen Sie das Ziel bei 40-facher oder höherer Vergrößerung.
    HINWEIS: Das System ein computerisiertes Mikroskop ist, der keine Anpassungen erfordert. Die Brennweite, die Intensität des einfallenden Lichts und die Belichtungszeit sind alle Setup automatisch von der Maschine.

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Ergebnisse

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Entwurf des HTS-Assay

Zwei wichtige Faktoren wurden berücksichtigt, wenn die hierin Fluoreszenztest zu entwerfen. Zuerst mussten wir einen physiologischen Zustand zu replizieren , in der T- oder B - Zell - Aktivierung eine Krankheit (zB graft-versus-host disease) darstellen würde. Zweitens sollte die Beurteilung der zellulären Aktivierung durchgeführt werden, um eine empfindliche und quantitative Methode. Die Fluoreszenz...

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Diskussion

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Mehrere Ausleseverfahren wurden für die Entwicklung von empfindlichen und zuverlässigen HTS-Assays genutzt werden. Dazu gehören kolorimetrischen, lumineszente oder Fluoreszenzmethoden. Obwohl farbmetrischen Methoden einfach einzurichten sind, benötigen sie mehrere Zugaben von Chemikalien, die getestet stören oder unterbrechen können wobei die Zellen. 23 Darüber hinaus sind sie erlauben keine dynamische Bewertung einer biologischen Reaktion , wie die pharmakologische Wirkung zu einem bestimmten En...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde von der Merck Frosst Startkapital zur Verfügung gestellt von der Université de Montréal unterstützt. Wir möchten Drs Jean Duchaine und Dominic Salois aus der Hochdurchsatzplattform am Institut für Forschung in der Immunologie und Krebs für ihre Diskussion, Kommentare und Feedbacks zu danken. Moutih Rafei hält einen Fonds de la Recherche en Santé du Québec Junior 1 Auszeichnung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Nur77GFP MäuseDer Jackson Laboratory MausstammNr. 016617In unserer Tieranlage wurde eine hauseigene Kolonie gegründet 
96 Wells-U Kulturplatten, sterilVWR International10062-902T-Zell-Aktivierung mit den magnetischen Kügelchen
70 µ m-Zell-Sieb, sterilCorning Inc.352350Generation von Splenozyten-Zellsuspension
5 ml Polystyrol-Rundbodenröhrchen, sterilCorning Inc.352058Generation von Splenozyten-Zellsuspension
50 ml Polypropylen-Röhrchen mit konischem Boden, sterilVWR International89039-656 Erzeugung von Splenozyten-Zellsuspension
10 ml Spritze ohne Nadel, sterilBecton, Dickinson and Company305482Zum Zerdrücken der Milz
T-25 KulturkolbenGreiner Bio-One690 175Zum Einrühren von B-Zellen während der Aktivierung
5 ml Zellkulturschale, sterilGreiner Bio-One627 160Zum Zerdrücken der Milz
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)WISENT Inc.450-200-EL   Bestandteil des Splenozytenmediums
RPMI 1600 mit Natriumbicarbonat und L-GlutaminWISENT Inc.350-002-CL Bestandteil des Splenozytenmediums
MEM nicht-essentielle AminosäurenWISENT Inc.321-010-EL Bestandteil des Splenozytenmediums
HEPES freie Säure 1 MWISENT Inc.330-050-EL Bestandteil des Splenozytenmediums
Natriumpyruvatlösung (100mM)WISENT Inc.600-110-EL Bestandteil des Splenozytenmediums
Fötales Rinderserum (FBS)WISENT Inc.080-910 Bestandteil des Splenozytenmediums und des Durchflusszytometrie-Puffers
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)WISENT Inc.311-010-CLBestandteil des Durchflusszytometrie-Puffers
2-Mercaptoethanol (55 mM)Thermo Fisher Scientific21985-023Bestandteil des Splenozytenmediums
T-Zellen IsolationskitStemcell Technologies19851Zur Isolierung von T-Zellen
B-Zellen IsolationskitStemcell Technologies19854Zur Isolierung von B-Zellen
Maus T-Aktivator CD3/CD28 superparamagnetisch KügelchenThermo Fisher Scientific11452DZur Aktivierung von T-Zellen 
ZellisolationsmagnetStemcell Technologies18000Zur Isolierung von T-Zellen und zur Entfernung der magnetischen Kügelchen 
AffiniPure F(ab')2 Fragment Ziege Anti-Maus IgG + IgM (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.115-006-068Zur Stimulierung von B-Zellen
Rekombinante Maus IL-7Peprotech217-17 Zur Unterstützung des Überlebens der T-Zellen während der Aktivierung
Rekombinantes CD40LR& R D Systems8230-CL/CFZur Stimulation von B-Zellen
Anti-Maus-CD3-AntikörperBD Pharmingen561799Zur Färbung von T-Zellen für die Durchflusszytometrie
Anti-Maus-CD19-AntikörperBD Pharmingen553786Zur Färbung von B-Zellen für die Durchflusszytometrie
Biomek FXpPerkinElmer Inc.A31842Zur Resuspendierung von Zellen nach 24 h Inkubation
Opera Phenix High Content Screening SystemPerkinElmer Inc.HH14000000Zur Analyse des GFP/Hoechst-Signals
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Referenzen

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  1. Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).
  2. Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 188-195 (2011).
  3. Lokey, R. S. Forward chemical genetics: progress and obstacles on the path to a new pharmacopoeia. Curr Opin Chem Biol. 7 (1), 91-96 (2003).
  4. Hall, S. E. Chemoproteomics-driven drug discovery: addressing high attrition rates. Drug Discov Today. 11 (11-12), 495-502 (2006).
  5. Pruss, R. M. Phenotypic screening strategies for neurodegenerative diseases: a pathway to discover novel drug candidates and potential disease targets or mechanisms. CNS Neurol Disord Drug Targets. 9 (6), 693-700 (2010).
  6. St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism. Molecules. 17 (11), 13098-13115 (2012).
  7. Houston, J. G., Banks, M. N., Binnie, A., Brenner, S., O'Connell, J., Petrillo, E. W. Case study: impact of technology investment on lead discovery at Bristol-Myers Squibb. Drug Discov Today. 13 (1-2), 44-51 (2008).
  8. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  9. Walters, W. P., Namchuk, M. Designing screens: how to make your hits a hit. Nat Rev Drug Discov. 2 (4), 259-266 (2003).
  10. Zheng, W., Thorne, N., McKew, J. C. Phenotypic screens as a renewed approach for drug discovery. Drug Discov Today. 18 (21-22), 1067-1073 (2013).
  11. Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).
  12. Moran, A. E., et al. T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse. J Exp Med. 208 (6), 1279-1289 (2011).
  13. Kovacic, N., Müthing, J., Marusic, A. Immunohistological and Flow Cytometric Analysis of Glycosphingolipid Expression in Mouse Lymphoid Tissues. J Histochem Cytochem. 48, 1677-1689 (2000).
  14. Shapiro, H. M. Flow cytometric estimation of DNA and RNA content in intact cells stained with hoechst 33342 and pyronin Y. Cytometry. 2, 143-150 (1981).
  15. Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotechnol. 28 (5), 237-245 (2010).
  16. An, W. F. Fluorescence-based assays. Methods Mol Biol. 486, 97-107 (2009).
  17. Kishimoto, H., Sprent, J. Strong TCR ligation without costimulation causes rapid onset of Fas-dependent apoptosis of naive murine CD4+ T cells. J Immunol. 163 (4), 1817-1826 (1999).
  18. Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrancois, L. Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nat Immunol. 1 (5), 426-432 (2000).
  19. Jiang, Q., et al. Cell biology of IL-7, a key lymphotrophin. Cytokine Growth Factor Rev. 16 (4-5), 513-533 (2005).
  20. Koenen, P., et al. Mutually exclusive regulation of T cell survival by IL-7R and antigen receptor-induced signals. Nat Commun. 4, 1735(2013).
  21. Vella, A., Teague, T. K., Ihle, J., Kappler, J., Marrack, P. Interleukin 4 (IL-4) or IL-7 prevents the death of resting T cells: stat6 is probably not required for the effect of IL-4. J Exp Med. 186 (2), 325-330 (1997).
  22. Hawkins, C. J., Vaux, D. L. The role of the Bcl-2 family of apoptosis regulatory proteins in the immune system. Semin Immunol. 9 (1), 25-33 (1997).
  23. Sumantran, V. N. Cellular chemosensitivity assays: an overview. Methods Mol Biol. 731, 219-236 (2011).
  24. Huh, S., et al. A cell-based system for screening hair growth-promoting agents. Arch Dermatol Res. 301 (5), 381-385 (2009).
  25. Weiss, A. TCR signal transduction: opening the black box. J Immunol. 183 (8), 4821-4827 (2009).
  26. Noel, P. J., Boise, L. H., Green, J. M., Thompson, C. B. CD28 costimulation prevents cell death during primary T cell activation. J Immunol. 157 (2), 636-642 (1996).
  27. Michels, A. W., et al. Structure-based selection of small molecules to alter allele-specific MHC class II antigen presentation. J Immunol. 187 (11), 5921-5930 (2011).

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Fluorescence based Lymphocyte AssayHigh throughput ScreeningT Cell IsolationB Cell IsolationNur77 GFP MouseMagnetic Bead SeparationGFP Expression AnalysisSmall Molecule ScreeningImmunomodulatory Compound IdentificationCell Culture Incubation

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