Ein Aptamer-basierten Sensor für unchelatisierte Gadolinium (III)

Zusammenfassung

Die Verwendung von Polydesoxynukleotid-Molekülen (44-mer-Aptamer) zur Erfassung von unchelatierten Gadolinium(III)-Ionen in einer wässrigen Lösung wird beschrieben. Das Vorhandensein des Ions wird über eine Erhöhung der Fluoreszenzemission des Sensors detektiert.

Zusammenfassung

Ein Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins von unchelatierten dreiwertigen Gadolinium-Ionen (Gd³⁺) in wässriger Lösung wird demonstriert. Gd³⁺ ist häufig in Proben von gadoliniumbasierten Kontrastmitteln als Ergebnis unvollständiger Reaktionen zwischen dem Liganden und dem Ion oder als Dissoziationsprodukt vorhanden. Da das Ion giftig ist, ist sein Nachweis von entscheidender Bedeutung. Darin werden der Aufbau und die Verwendung eines Aptamer-basierten Sensors (Gd-Sensor) für Gd³⁺ beschrieben. Der Sensor erzeugt eine Fluoreszenzänderung als Reaktion auf steigende Konzentrationen des Ions und hat eine Nachweisgrenze im nanomolaren Bereich (~100 nM mit einem Signal-Rausch-Verhältnis von 3). Der Assay kann in einem wässrigen Puffer bei einem Umgebungs-pH-Wert (~7 - 7,4) in einer 384-Well-Mikroplatte durchgeführt werden. Der Sensor reagiert relativ unempfindlich auf andere physiologisch relevante Metallionen wie Natrium-, Kalium- und Calciumionen, obwohl er nicht spezifisch für Gd³⁺ gegenüber anderen dreiwertigen Lanthanoiden wie Europium(III) und Terbium(III) ist. Dennoch sind die Lanthanide in Kontrastmitteln oder den biologischen Systemen nicht häufig zu finden, so dass der Sensor zur selektiven Bestimmung von unchelatiertem Gd³⁺ unter wässrigen Bedingungen verwendet werden kann.

Einleitung

Die zunehmende Bedeutung der Kernspintomographie (MRI) in der klinischen Diagnose, die durch die inhärente Empfindlichkeit der Technik begrenzt ist, hat in dem schnellen Wachstum der Forschung in die Entwicklung von neuartigen Gadolinium-Kontrastmitteln (GBCAs) ¹ geführt. GBCAs sind Moleküle , die verabreicht werden , um die Bildqualität zu verbessern, und sie haben typischerweise die chemische Struktur eines dreiwertigen Gadolinium - Ion (Gd ³⁺⁾ zu einem mehrzähnigen Liganden koordiniert. Diese Komplexbildung ist von entscheidender Bedeutung , da unchelatisierten Gd ³⁺ ist giftig; es wurde bereits ² in der Entwicklung von nephrogener systemische Fibrose bei einigen Patienten mit Nierenerkrankung oder Versagen gebracht. Folglich wird die wäßrige freie Ionen Erfassungs dazu bei, die Sicherheit der GBCAs gewährleisten. Die Anwesenheit von unchelatisierten Gd ³⁺ in GBCA Lösungen ist oft das Ergebnis einer unvollständigen Reaktion zwischen dem Liganden und dem Ion, Dissoziation des Komplexes oder displacement durch andere biologische Metallkationen ^3.

Unter den verschiedenen Techniken , die derzeit zur Bestimmung der Anwesenheit von Gd ^3+, diejenigen , die sich auf Chromatographie und / oder Spektrometrie Rang höchsten in Bezug auf Vielseitigkeit und Anwendbarkeit ^4. Unter ihren Stärken sind eine hohe Empfindlichkeit und Genauigkeit, die Fähigkeit , verschiedene Matrices (einschließlich humanem Serum ^5, Urin und Haar ^6, Abwasser ⁷ und Kontrastmittelformulierungen ⁸⁾ und die gleichzeitige Quantifizierung von mehreren Gd ³⁺ Komplexe (eine Auflistung zu analysieren vor dem Jahr 2013 von Studien in einer umfassenden Überprüfung von Telgmann et al.) ^4. Der einzige Nachteil ist , dass mehrere dieser Verfahren erfordern Instrumentierungen (wie induktiv gekoppelter Plasma-Massenspektrometrie) ⁴ , dass einige Laboratorien haben möglicherweise keinen Zugriff auf. Im Rahmen der neuen GBCA Entdeckung an der Forschung und Proof-of-Concept-Ebenen, arelatively bequemer, schneller und kostengünstiger spektroskopischen-basierte Verfahren (wie UV-Vis-Absorption oder Fluoreszenz) kann als eine wertvolle Alternative dienen. Mit diesen Anwendungen im Blick, ein fluoreszierendes Aptamer-basierten Sensor für wässrige Gd ³⁺ wurde ⁹ entwickelt.

Das Aptamer (Gd-Aptamer) ist ein 44-Basen langen einzelsträngigen DNA - Moleküls mit einer bestimmten Sequenz von Basen , die durch den Prozess der systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung (SELEX) ⁹ isoliert. Um das Aptamer in einen Fluoreszenzsensor anzupassen, ein Fluorophor an das 5' - Ende des Stranges befestigt sind , die dann mit einem Quenching Strang (QS) über 13 komplementären Basen (Abbildung 1) hybridisiert ist. Der QS ist mit einem dunklen Quencher-Molekül am 3'-Terminus markiert. In der Abwesenheit von Gd ^3+, dem Sensor (Gd-Sensor), einer 1 umfasste: 2 - Molverhältnis von Gd-Aptamer und QS bzw. haben, minimale Fluoreszenzemission aufgrund to Energieübertragung von dem Fluorophor zu dem Quencher. Die Zugabe von wässrigem Gd ³⁺ das QS vom Gd-Aptamer, was zu einem Anstieg in der Fluoreszenzemission verdrängen.

Abbildung 1. Der Sensor (Gd-Sensor), der mit Fluorescein (ein Fluorophor) und dem langen Lösch Strang (QS) getaggt mit Dabcyl (ein dunkler Löscher) 13-Basis (Gd-Aptamer) markiert 44-base lange Aptamer besteht . In Abwesenheit von unchelatisierten Gd ^3+, die Fluoreszenz des Sensors ist minimal. Mit Zugabe von Gd ^3+, Verschiebung des QS auftritt und eine Erhöhung der Fluoreszenzemission beobachtet. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Es ist derzeit, eine häufig verwendete spektroskopische basiertes Verfahren zur Erkennunging wässrigen Gd ^3+. Dieser Assay verwendet das Molekül Xylenolorange, die 433 bis 573 nm auf Chelatisierung an die Ionen ¹⁰ eine Verschiebung der maximalen Absorptionswellenlänge unterzogen wird . Das Verhältnis dieser zwei Absorptionsmaxima können verwendet werden , um die Menge des unchelatisierten Gd ³⁺ zu quantifizieren. Das Aptamer Sensor ist eine Alternative (kann auch komplementär sein) an den Xylenolorange-Test, als die beiden Verfahren unterschiedliche Reaktionsbedingungen (wie beispielsweise pH und der Zusammensetzung der Pufferlösungen verwendet wird) haben, Ziel Selektivitäten, linearen Bereichen der Quantifizierung und Erfassungsmodalitäten ^9.

Protokoll

HINWEIS: die Molekularbiologie Wasser wird in allen Puffer und Lösungs-Präparate eingesetzt. Alle Einweg-Röhrchen (Mikro und PCR) und Pipettenspitzen sind DNase- und RNase-frei. Bitte beachten Sie die Sicherheitsdatenblatt (MSDS) für alle Chemikalien vor der Verwendung. Einsatz einer persönlichen Schutzausrüstung (PSA) wird dringend empfohlen.

1. Herstellung der Stammlösungen Aptamer

1. kommerziell Kauf 2 Stränge von Polydesoxynukleotid-. Um beide Stränge mit Reinigung durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC).
   Strand 1 (Gd-Aptamer):
   5 '- / 56-FAM / AGGCTCTCGGGACGACCAGTTGGTCCCGCTTTATGTGTCCCGAG-3'
   Strand 2 (QS):
   5'-GTCCCGAGAGCCT / 3Dab / -3 '
2. Man löst jeder Strang in Wasser auf 100 & mgr; M einzelnen Stammlösungen des Gd-Aptamer und dem QS machen.
3. Bewahren Sie diese Lösungen bei -20 ° C. Die Lösungen sind stabil bisher, für 3 Jahre.
4. Zur Minimierung der freeze-Auftau-Zyklen, speichern Sie die Stammlösungen in 10 & mgr; l-Aliquots.

2. Herstellung des 2x Gd-Sensorlösung

1. Vorbereitung der Testpuffer (20 mM HEPES, 2 mM MgCl _2, 150 mM NaCl, 5 mM KCl). Stellen Sie den pH-Wert auf ~ 7,4 mit NaOH und HCl, und filtriert durch sterile Einwegflasche Top-Filter mit 0,2 um PES-Membran. Lagern Sie in sterile Flaschen. Wenn filtriert und richtig gespeichert (bei Raumtemperatur), ist der Puffer bisher stabil, für 2 Jahre.
2. Verdünnen Sie 1 ul des Gd-Aptamer-Stammlösung (aus Schritt 1.2) und 2 ul der QS-Stammlösung (aus Schritt 1.2) in 497 & mgr; l Testpuffer. Gut mischen einen Wirbel verwenden. Ihre Konzentrationen in der 2x Gd-Sensorlösung werden 200 nM und 400 nM.
   HINWEIS: Das Volumen des 2x Gd-Sensorlösung in diesem Schritt hergestellt wird , ist 500 & mgr; L, der 6 zu testen ausreicht - 7 verschiedene Konzentrationen von Gd ³⁺ für die Kalibrierungskurve und der Kontrastmittel - Lösungen(Schritt 3). Jede Probe geben Dublikatmulden in einer 384-Well-Platte.
   1. Stellen Sie die Lautstärke des 2x Gd-Sensorlösung entsprechend der Anzahl von Gd ³⁺ Lösungen , die getestet werden muss.
3. Übertragen Sie die 2x Gd-Sensorlösung in 9 PCR-Röhrchen, mit 50 & mgr; l in jedes Röhrchen. Die Röhrchen in einen Thermocycler.
4. Stellen Sie das Programm in den Thermocycler die Lösung in den Rohren bis 95 ° C zu erhitzen, Halten für 5 min und dann langsam abkühlen, die Lösungen auf 25 ° C über ca. 15 min (mit einer Rate von ~ 0,05-0,1 ° C / s). Die Heiz- und Kühlkreislauf ist eine optimale Hybridisierung zwischen dem Gd-Aptamer und dem QS zu gewährleisten. Teilhybridisierungsergebnisse in unvollständigem Abschrecken und eine höhere Hintergrundfluoreszenz des Sensors. Wenn ein Thermocycler nicht verfügbar ist, führen Sie diesen Prozess stattdessen ein heißes Wasserbad.
5. Nach dem Abkühlen auf 25 ° C, verwenden Sie sofort die Lösung, oder halten Sie in den Thermocycler (bis ca. 2 h), bis sie bereit zu seinbenutzt. Wenn ein Wasserbad für die Heizung verwendet wird, lassen Sie die Rohre im Bad, da das Wasser kühlt langsam auf Raumtemperatur.

3. Konstruieren der Fluoreszenz - Kalibrierungskurve und Nachweis der Anwesenheit von unchelatisierte Gd ³⁺ in einer Lösung von Gd Kontrastmittel

1. Man löst GdCl ₃ Feststoff in dem Testpuffer (den gleichen Puffer , wie in Schritt 2.1).
2. Durch Reihenverdünnung, Herstellung von 100 & mgr; l von jeweils 6 verschiedenen Gd ³⁺ Lösungen in Mikrozentrifugenröhrchen bei Doppel der endgültigen gewünschten Konzentrationen für die Eichkurve (2x Lösungen).
   1. Um zum Beispiel eine Kalibrierung für 0 (nur Puffer ohne GdCl ₃₎ zu konstruieren, 50, 100, 200, 400 und 800 nM von Gd ^3+, werden die Lösungen , die 0, 100, 200, 400, 800 und 1600 nM des Ions. Achten Sie darauf, immer auch die 'blank' mit 0 nM Gd ³⁺ als negative Kontrolle.
3. Man löst das Kontrastmittel-Test zu seinin dem Assaypuffer ed. Bereiten 2 oder 3 verschiedenen Konzentrationen der Kontrastmittel-Lösungen über serielle Verdünnung.
   HINWEIS: Test 3 verschiedenen Konzentrationen des Kontrastmittellösung empfohlen. Damit soll sichergestellt werden, dass diese Konzentrationen im linearen Bereich liegen. Wenn die getesteten Proben keine lineare Beziehung anzuzeigen, verwendet, um die Konzentrationen des Kontrastmittels verringern.
4. Nehmen Sie die PCR-Röhrchen, die 2x Gd-Sensor-Lösung aus Schritt 2.5 aus dem Thermocycler enthält.
5. In 50 ul jeder Gd ³⁺ Lösung aus Schritt 3.2 in 6 der 9 PCR - Röhrchen , die 2x Gd-Sensorlösung enthält. Mischen durch Pipettieren von oben und unten. Jedes PCR - Röhrchen enthält nun die gewünschte Konzentration von Gd ³⁺ getestet werden, 100 nM Gd-Aptamer und 200 nM QS.
6. Zu der verbleibenden PCR-Röhrchen die 2x Gd-Sensorlösung enthält, werden 50 ul der Kontrastmittel-Lösungen aus Schritt 3.3. Gut mischen durch Pipettieren nach oben und unten ein paar Mal.
7. Inkubieren Sie die solutions in den PCR-Röhrchen ca. 5 min bei Raumtemperatur. Sie können bis zu 30 Minuten stehen gelassen werden.
8. Übertragen Sie 45 ul jeder Röhre in eine 384-Well-Platte. Jedes PCR-Röhrchen geben Dublikatmulden.
9. Notieren Sie sich die Fluoreszenz von jeder Vertiefung auf einem Plattenleser. Das Fluorophor (FAM), die in dem Gd-Sensor-Design hat Anregungs- und Emissionsmaxima von 495 und 520 nm sind, wie auf der Website des Herstellers aufgeführt. Wählen geeigneten Anregungs- und Emissionswellenlängen oder Filter abhängig davon, ob der Plattenleser ist monochromator- oder Filterbasis.
10. Zeichnen Sie die graphische Darstellung der Fluoreszenz in willkürlichen Fluoreszenzeinheiten (AFU) gegen die Konzentration von Gd ^3+.
11. Zeichnen Sie die Grafik als Fluoreszenz - fache Veränderung gegen die Konzentration von Gd ^3+. Berechnen Sie die Fluoreszenz - fache Veränderung durch das AFU jeder Konzentration durch das AFU des 'leeren' Lösung Teilen (mit 0 nM von Gd ^3+). Die Fluoreszenz-fache Änderung wird für die n erlaubenormalization der Ergebnisse sollte die AFU Display einige periodische (verschiedene Tage, etc.) Variationen.
12. Vergleichen der Fluoreszenzemission der Lösung des Kontrastmittels und die "leere" enthalten, die die Lösung ist , die 0 nM GdCl ₃ (nur Puffer).
    HINWEIS: Eine höhere Fluoreszenz der GBCA Lösung impliziert die Anwesenheit von unchelatisierten Gd ^3+, die weitere Reinigung des Kontrastmittels erforderlich machen kann. Die Menge an unchelatisierte Gd ³⁺ vorhanden kann in Schritt 3.10 oder 3.11 konstruiert unter Verwendung der Eichkurve abgeschätzt werden.

Ergebnisse

Eine typische Fluoreszenzänderung des Gd-Sensorlösung in Gegenwart von unchelatisierten Gd ³⁺ ist in Abbildung 2 dargestellt. Die Emission kann als die Fluoreszenz - fache Veränderung (2A) oder die rohe Fluoreszenzablesen (2B) in willkürlichen Einheiten aufgetragen werden (AFU). Beide Diagramme ergeben sehr ähnliche Eichkurven mit einem linearen Bereich für die Konzentration von Gd ³⁺ unter 1 & mgr; M und der Sä...

Diskussion

Verwendung der Aptamer-basierten Gd-Sensor, ein Anstieg in der Fluoreszenzemission , die auf die Konzentration des unchelatisierten Gd ³⁺ proportional ist beobachtet wird . Um die Menge der Probe zu minimieren verwendet wird, kann der Test in einem 384-Well-Mikroplatten mit einer Gesamtprobenvolumen von 45 & mgr; l pro Vertiefung ausgeführt werden. In dieser Konstruktion ist die Wahl von Fluorescein (FAM) und DABCYL (Dab) wurde auf die Kosten der Reagenzien basieren in erster Linie; die Emissionswellenlän...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Gd-Aptamer	IDTDNA	Eingangssequenz und Fluorophormodifikation in der Ordnungsform	Es kann ein Fluorophor mit einer anderen Emissionswellenlänge verwendet werden. Das Aptamer kann auch bei einem anderen Unternehmen bestellt werden.
Abschreckstrang	IDTDNA	Inputsequenz und Quenchermodifikation in der Ordnungsform	Es kann ein anderer Quencher für einen optimalen Energietransfer aus dem Fluorophor verwendet werden. Das Aptamer kann auch bei einem anderen Unternehmen bestellt werden.
		in molekularbiologischer Qualität	Kein bestimmter Hersteller, sowohl DEPC- als auch nicht DEPC-behandelte Produkte funktionieren gleich gut
Gadolinium(III)-chlorid wasserfreies	Strem	936416
Toxisches HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
Magnesiumchlorid wasserfrei	MP Biomedicals	0520984480 - 100 g
Natriumchlorid	Acros Organics
Kaliumchlorid	Fisher Scientific	P333-500
Natriumhydroxid, Pellets	Fisher Scientific	BP359	Korrosive
Salzsäure	Fisher Scientific	SA49	Giftige und korrosive
384-Well-Platten aus schwarzem Polystyrol mit flachem Boden und niedrigem Flansch	Corning	3575	Platten, die für Fluoreszenz geeignet sind Lektüre sind erforderlich.
Nalgene Rapid-Flow steriler Einweg-Flaschenaufsatzfilter	Thermo Scientific	5680020	Der Flaschendeckel ist mit einer 0,2-Mikron-PES-Membran ausgestattet
Sterile Einwegflaschen 250 mL	Corning	430281	Es kann eine größere oder kleinere Flasche verwendet werden
1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen			Kein bestimmter Hersteller, solange es sich um DNAse- und RNAse-freie
0,2 mL PCR-Röhrchen			handeltKein bestimmter Hersteller, solange es sich um DNAse und RNAse-freie
Mikropipetten			Kein bestimmter Hersteller
Pipettenspitzen (ohne Filter) in entsprechenden Größen			Kein bestimmter Hersteller, solange sie DNAse und RNAse-frei sind
Equipment
Plattenleser	Biotek Synergy H1		Plattenleser anderer Hersteller würden genauso gut funktionieren