Visualisierung von Protein-Protein-Wechselwirkung in Kern- und Cytoplasma-Fraktionen durch Co-Immunpräzipitation und<em&gt; In Situ</em&gt; Nähe Ligatur Assay

Xinzhou Zhu; Andrea Zelmer; Sven Wellmann

doi:10.3791/55218

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Methodenartikel

Visualisierung von Protein-Protein-Wechselwirkung in Kern- und Cytoplasma-Fraktionen durch Co-Immunpräzipitation und

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DOI:

10.3791/55218

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16. Januar 2017

Xinzhou Zhu¹ , Andrea Zelmer¹ , Sven Wellmann¹^,²

¹University Children's Hospital Basel (UKBB), University of Basel, ²Department of Clinical Research, University of Basel

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Protein-Wechselwirkungen können sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma einer Zelle auftreten. Um diese Wechselwirkungen zu untersuchen, werden die traditionelle Co-Immunpräzipitation und der moderne Proximity-Ligationsassay eingesetzt. In dieser Studie vergleichen wir diese beiden Methoden, um die Verteilung der NF90-RBM3-Wechselwirkungen im Zellkern und im Zytoplasma sichtbar zu machen.

Zusammenfassung

Protein-Wechselwirkungen sind an Tausenden von zellulären Prozessen beteiligt und treten in einem bestimmten räumlichen Kontext auf. Traditionell ist die Co-Immunpräzipitation eine beliebte Technik zum Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen. Die anschließende Western-Blot-Analyse ist die gebräuchlichste Methode zur Visualisierung von co-immunpräzipitierten Proteinen. In jüngster Zeit hat sich der Proximity-Ligationsassay zu einem leistungsfähigen Werkzeug entwickelt, um Protein-Protein-Wechselwirkungen in situ zu visualisieren und bietet die Möglichkeit, Protein-Protein-Wechselwirkungen mit dieser Methode zu quantifizieren. Ähnlich wie bei der konventionellen Immunzytochemie basiert auch die Proximity-Ligation-Assay-Technik auf der Zugänglichkeit von Primärantikörpern zu den Antigenen, aber im Gegensatz dazu detektiert der Proximity-Ligation-Assay Protein-Protein-Wechselwirkungen mit einer einzigartigen Technik, die die Rolling-Circle-PCR beinhaltet, während die konventionelle Immunzytochemie nur eine Co-Lokalisation von Proteinen zeigt.

Der nukleare Faktor 90 (NF90) und das RNA-bindende Motivprotein 3 (RBM3) wurden bereits als Interaktionspartner nachgewiesen. Sie sind überwiegend im Zellkern lokalisiert, wandern aber auch in das Zytoplasma und regulieren Signalwege im zytoplasmatischen Kompartiment. In dieser Arbeit verglichen wir die NF90-RBM3-Interaktion sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma mittels Co-Immunpräzipitation und Proximity-Ligation-Assay. Darüber hinaus diskutierten wir die Vorteile und Grenzen dieser beiden Techniken bei der Visualisierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in Bezug auf die räumliche Verteilung und die Eigenschaften von Protein-Protein-Wechselwirkungen.

Einleitung

Nuclear factor 90 (NF90) ist ein Multi-Isoform - Proteins mit zahlreichen Funktionen , einschließlich der Reaktion auf eine virale Infektion, die Regulierung von Interleukin-2 post-Transkription und Regulierung der miRNA Biogenese ^1-3. RBM3 ist ein RNA-bindendes Protein, involviert in Translation und miRNA Biogenese und kann durch verschiedene Stressoren einschließlich Hypothermie und Hypoxie ^4-6 induziert werden. Vor kurzem fanden wir NF90 und RBM3 in einem Proteinkomplex ^7. Das Zusammenspiel von NF90 und RBM3 ist essentielles Protein - Kinase - RNA-ähnliche Endoplasmatischen Retikulum - Kinase (PERK) Aktivität in ungefalteten Protei....