Visualisierung von Protein-Protein-Wechselwirkung in Kern- und Cytoplasma-Fraktionen durch Co-Immunpräzipitation und In Situ Nähe Ligatur Assay

Zusammenfassung

Protein-Wechselwirkungen können sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma einer Zelle auftreten. Um diese Wechselwirkungen zu untersuchen, werden die traditionelle Co-Immunpräzipitation und der moderne Proximity-Ligationsassay eingesetzt. In dieser Studie vergleichen wir diese beiden Methoden, um die Verteilung der NF90-RBM3-Wechselwirkungen im Zellkern und im Zytoplasma sichtbar zu machen.

Zusammenfassung

Protein-Wechselwirkungen sind an Tausenden von zellulären Prozessen beteiligt und treten in einem bestimmten räumlichen Kontext auf. Traditionell ist die Co-Immunpräzipitation eine beliebte Technik zum Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen. Die anschließende Western-Blot-Analyse ist die gebräuchlichste Methode zur Visualisierung von co-immunpräzipitierten Proteinen. In jüngster Zeit hat sich der Proximity-Ligationsassay zu einem leistungsfähigen Werkzeug entwickelt, um Protein-Protein-Wechselwirkungen in situ zu visualisieren und bietet die Möglichkeit, Protein-Protein-Wechselwirkungen mit dieser Methode zu quantifizieren. Ähnlich wie bei der konventionellen Immunzytochemie basiert auch die Proximity-Ligation-Assay-Technik auf der Zugänglichkeit von Primärantikörpern zu den Antigenen, aber im Gegensatz dazu detektiert der Proximity-Ligation-Assay Protein-Protein-Wechselwirkungen mit einer einzigartigen Technik, die die Rolling-Circle-PCR beinhaltet, während die konventionelle Immunzytochemie nur eine Co-Lokalisation von Proteinen zeigt.

Der nukleare Faktor 90 (NF90) und das RNA-bindende Motivprotein 3 (RBM3) wurden bereits als Interaktionspartner nachgewiesen. Sie sind überwiegend im Zellkern lokalisiert, wandern aber auch in das Zytoplasma und regulieren Signalwege im zytoplasmatischen Kompartiment. In dieser Arbeit verglichen wir die NF90-RBM3-Interaktion sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma mittels Co-Immunpräzipitation und Proximity-Ligation-Assay. Darüber hinaus diskutierten wir die Vorteile und Grenzen dieser beiden Techniken bei der Visualisierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in Bezug auf die räumliche Verteilung und die Eigenschaften von Protein-Protein-Wechselwirkungen.

Einleitung

Nuclear factor 90 (NF90) ist ein Multi-Isoform - Proteins mit zahlreichen Funktionen , einschließlich der Reaktion auf eine virale Infektion, die Regulierung von Interleukin-2 post-Transkription und Regulierung der miRNA Biogenese ^1-3. RBM3 ist ein RNA-bindendes Protein, involviert in Translation und miRNA Biogenese und kann durch verschiedene Stressoren einschließlich Hypothermie und Hypoxie ^4-6 induziert werden. Vor kurzem fanden wir NF90 und RBM3 in einem Proteinkomplex ^7. Das Zusammenspiel von NF90 und RBM3 ist essentielles Protein - Kinase - RNA-ähnliche Endoplasmatischen Retikulum - Kinase (PERK) Aktivität in ungefalteten Protein - Reaktion ⁷ zu modulieren. Sowohl NF90 und RBM3 befinden sich überwiegend im Kern aber einem geringen Anteil an NF90 und RBM3 Shuttle in das Zytoplasma und binden dort miteinander für bestimmte Funktionen, beispielsweise PERK Aktivität zu regulieren. Daher ist es wichtig, die Verteilung von NF90-RBM3 Wechselwirkungen in dem subzellulären Kompartiment zu visualisieren, die anzeigen kannihre verschiedenen Rollen in den jeweiligen Fach.

Vor Jahrzehnten, Hefe - Zwei - Hybrid (Y2H) wurde die Wechselwirkung zwischen zwei Proteinen ⁸ zu erkennen , entwickelt. Aufgrund künstliche Konstruktion von Fusionsproteinen, falsch-positive Ergebnisse haben die Anwendung dieses Verfahrens beschränkt. Für eine lange Zeit, Co-Immunpräzipitation war das Haupt Technik Protein-Protein - Wechselwirkungen, insbesondere in endogener Bedingungen ⁹ zu analysieren. Um die Co-immunpräzipitiert Proteinkomplex zu analysieren, Western-Blot ist die bequemste Methode, während der Massenspektrometrie verwendet wird, wenn Super Empfindlichkeit und Genauigkeit erwünscht sind. In den letzten Jahren Proximity Ligation Assay wurde als ein neues Verfahren entwickelt worden , Protein-Protein - Wechselwirkungen in beiden Zellen und Gewebe in situ ^10,11 zu erkennen.

Hier verglichen wir die beliebtesten Coimmunpräzipitation Verfahren und relativ neuartige Nähe Ligatur Testverfahren in NF9 Erfassung0-RBM3 Interaktion in subzellulären Fraktionen. Wir diskutierten auch die Vorteile und Grenzen beider Techniken.

Protokoll

1. Coimmunpräzipitation

1. Seed HEK293 Zellen bei 2 × 10 ⁵ Zellen pro Vertiefung in eine 6-Well - Platte in 2 ml nach Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) Nahrungsergänzungsmittel mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 100 U / ml Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep) .
2. Wachsen Zellen für 48 Stunden bei 37 ° C mit 5% CO _2.
3. Wasche die Zellen mit kalter Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) dreimal. Ernte die Zellen durch Zentrifugation bei 500 xg für 5 min bei 4 ° C.
4. Bereiten Sie Kern- und Cytoplasma-Fraktionen kommerziellen Kern und Cytoplasma-Extraktion unter Verwendung von Reagenzien. Folgen Sie Anweisungen des Herstellers mit einigen Modifikationen.
   1. Verwenden 3 x 10 ⁶ Zellen für einen Co-Immunpräzipitation Experiment (ungefähr 90% Konfluenz von 3 Vertiefungen einer Platte mit 6 Vertiefungen). In 300 ul kalten Cytoplasma-Extraktionslösung (CER I) und Vortex 15 Sekunden lang mit der höchsten Geschwindigkeit.
   2. Inkubieren für 30 Minuten auf Eis. Während der Inkubation Vortex für 5 s alle 10 min.
   3. In 16,5 ul kalt zytoplasmatischen Extraktionslösung II (CER II), Vortex für 5 Sekunden und Inkubation für 5 min auf Eis.
   4. Rührers 5 sec und Zentrifuge bei 16.000 × g für 5 min bei 4 ° C.
   5. Den Überstand (Zytoplasmaextrakt) in eine neue vorgekühlte Rohr und auf Eis halten, bis sie verwendet.
   6. Waschen Sie unlöslichen Pellets (mit Kernen) dreimal mit 1 ml kaltem PBS jedes Mal durch Auf- und Abpipettieren fünfmal. Entfernen PBS nach dem Waschen.
   7. In 150 ul kalten Kernextraktionslösung (NER), Vortex für 15 Sekunden und Inkubation 1 Stunde auf Eis. Während der Inkubation Vortex für 15 Sekunden und Pipette 10 mal mit einer 200 ul Spitze alle 10 min.
   8. Vortex für 15 s und Zentrifuge bei 16.000 xg für 10 min bei 4 ° C.
   9. Den Überstand (Kernextrakt) in eine neue vorgekühlte Röhrchen, auf Eis halten bis zur Verwendung.
5. Nehmen Sie 10% des Volumens der Kern- und Zytoplasmaextrakte jeweils als Eingänge.
6. EINdd kaltem PBS auf die verbleibenden Extrakte auf ein Endvolumen von 1 ml. Halten Sie sich auf Eis bis zum Gebrauch.
   HINWEIS: Pre-Clearing nicht wesentlich ist, wenn Protein G-konjugierten magnetischen Kügelchen verwendet wird. Wenn jedoch der Hintergrund hoch ist, führen Pre-Clearing von 40 & mgr; l Protein G-konjugierten magnetischen Kügelchen inkubiert (50% Slurry) und 1 ml für 30 min auf einem Rotator Lysat aus diesem Schritt bei 4 ° C verdünnt. Separate Überstand (bereits geklärten Lysat) von Perlen mit Magnethalter. Entsorgen Sie die Perlen.
7. Zu kuppeln primäre Antikörper mit Protein G-konjugierten magnetischen Kügelchen, inkubiere 40 & mgr; l Protein G-konjugierten magnetischen Kügelchen (50% ige Aufschlämmung) mit 4 & mgr; g Kaninchen-polyklonalen Anti-RBM3 Antikörper oder Kaninchen-IgG (negative Kontrolle) in 200 & mgr; l PBS plus Tween 20 Puffer (PBST, 0,02% Tween 20) bei Raumtemperatur (RT) für 40 min auf einem Rotator.
8. Separate Antikörper-gekoppelten Kügelchen und der Überstand mit einem Magnetträger, und den Überstand verwerfen. Waschen Sie die Perlen einmal mit 200 ul PBST (0,02%).
9. 1ml verdünnt Lysaten (oder, falls erforderlich, bereits geklärten Lysate) an die Kügelchen, und über Nacht bei 4 ° C auf einem Rotator inkubiert.
10. Am nächsten Tag, trennen Sie die Perlen und Überstand durch einen Magnetträger, und den Überstand verwerfen. Waschen 3 x 10 min mit 0,5 ml PBST (0,02%) für jedes Röhrchen bei 4 ° C auf einem Rotator mit einer festen Drehzahl von 20 Umdrehungen pro Minute.
11. Eluieren von Proteinen aus den Perlen durch 40 & mgr; l Probenpuffer Zugabe (1x Handelsprobenpuffer und 50 mM 1,4-Dithiothreitol (DTT)). Hitze bei 70 ° C für 10 min. Spin down und Übertragungsflüssigkeiten in ein neues 1,5-ml-Röhrchen.
12. Verdünnte Eingangs Lysate in Probenpuffer (Endkonzentration: 1x Handelsprobenpuffer und 50 mM DTT) und Wärme bei 70 ° C für 10 min. Lasteingänge und immunpräzipitiert Proteine ​​aus dem letzten Schritt zu einer vorgegossenen 4-12% Bis-Tris-Gel. Das Ladevolumen von jeder Vertiefung sollte nicht mehr als 20 & mgr; l nicht überschreiten. Führen Elektrophorese in 1x kommerziellen Laufpuffer auf Eis für 35 min.
    HINWEIS: Legen Sie nuklearen und Zytoplasmaextrakts in einem Verhältnis von 1: 2 (V / V), die den gleichen Anfangsmenge an Zellen widerspiegelt.
13. Transfer-Proteine ​​auf PVDF-Membran in 1x Handelstransferpuffer bei 30 V für 2 h bei 4 ° C.
14. Block-Membran mit 5% Magermilch in PBST (0,1% Tween 20) bei RT für 40 min auf einem Schüttler.
15. Inkubieren Membran mit primärem Antikörper (beide in einer Verdünnung von 1: 1000) in PBST (0,1%) bei 4 ° C über Nacht.
16. Waschen 3 x 10 min mit PBST (0,1%) bei RT auf einem Schüttler.
17. Inkubieren Membran mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) -konjugiertem Anti-Maus oder Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (beide in einer Verdünnung von 1: 5000) in PBST (0,1%) bei RT für 1 Std.
18. Waschen 3 x 10 min mit PBST (0,1%) bei RT auf einem Schüttler.
19. Verwenden 0,2 ml verstärkte Chemilumineszenz (ECL) Substratmischung pro cm ² Membran, inkubiere 5 min bei RT. Vermeiden Sie alles Licht von diesem Schritt ab, außer roten Ampeln.
20. Verwerfen Flüssigkeit und belichten zu einem Röntgenfilm in einer Filmkassette. Entwickeln Film einen automatischen Film pr mitHOLZBEARBEITUNGS- Maschine.

2. Immunzytochemie und Proximity Ligation Assay

1. Seed HEK293 - Zellen mit 1,5 × 10 ⁴ Zellen pro Kammer in einem 8-Kammer poly-D-Lysin beschichteten Objektträger in 0,4 ml DMEM mit 10% FBS ergänzt und 100 U / ml Pen-Strep.
2. Wachsen Zellen für 48 Stunden bei 37 ° C mit 5% CO _2.
3. Absaugen Medium und fixieren Zellen mit 4% Paraformaldehyd (PFA) für 10 min bei RT.
4. Absaugen PFA und waschen 3 x 10 min mit 0,5 ml PBS pro Kammer.
5. Permeabilisieren und Block-Zellen mit 0,5% Triton X-100 und 5% normalem Ziegenserum (NGS) in PBS bei RT für 1 Std.
6. Inkubieren mit primärem Antikörper in 0,1% Triton X-100 und 5% NGS in PBS auf einem Schüttler bei 4 ° C über Nacht. Verdünnte Maus monoklonaler anti-NF90 Antikörper und polyklonalem Kaninchen-anti-RBM3 Antikörper 1: 100 in PBS für Doppelfärbung. Für negative Kontrolle wegzulassen unabhängig eine der beiden primären Antikörper und wegzulassen beide Antikörper in einem dritten Steuer.
   HINWEIS: Verwenden Sie kommerzielle Blockierung und Verdünnungs Reagenzien verwenden nicht.
7. Waschen Sie 3 x 10 min mit 0,5 ml PBS pro Kammer.
8. Vorbehaltlich Immunzytochemie oder Nähe Ligatur Assay - Protokolle
   1. Immunzytochemie
      1. Inkubieren mit 1: 500 verdünnt grün fluoreszierender Farbstoff-gekoppelten anti-Maus und roten Fluoreszenzfarbstoff-gekoppelte Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper bei RT für 1 Std. Vermeiden Sie Licht, das von diesem Schritt ab.
      2. Gegenfärbung Kerne mit 4 ', 6-diamidin-2-phenylindol (DAPI), verdünnt 1: 5.000 in PBS bei RT für 10 min.
      3. Waschen Sie 3 x 10 min mit 0,5 ml PBS pro Kammer.
      4. Entfernen Sie die Kammern aus dem Glasträger und trocken. Montieren Sie mit 250 μ, Eindeckmedium pro Folie.
   2. Proximity-Ligation-Assay
      1. Bereiten Nähe Ligatur Assay-Sonden. Mischen und Verdünnen zwei Proximity Ligation Assay-Sonden (anti-Maus und Anti-Kaninchen-Sekundär mit verschiedenen Oligonukleotiden gebunden Antikörper, die th ligieren kannrough die Zugabe von zwei weiteren Oligonukleotiden in Ligationslösung) beide 1: 5 in 0,1% Triton X-100 und 5% NGS in PBS, mit einem Gesamtvolumen von 320 & mgr; l für eine 8-Kammerobjektträger (etwa 40 & mgr; l pro cm ²⁾ . 20 min bei RT inkubiert.
      2. Entfernen Sie die Kammern aus dem Objektträger aus Glas und fügen Sie die verdünnten Sonden. Inkubieren in einer feuchten Inkubator bei 37 ° C für 1 Stunde.
      3. Bereiten Sie Ligierungslösung. Mischen Sie 8 ul - Ligase, 64 ul 5 x Ligatur Lager und 248 & mgr; l H ₂ O.
      4. Abklopfen die Flüssigkeit aus der Folie, und waschen 2 x 5 min in 1x Waschpuffer A (versehen mit dem Kit).
      5. Hinzufügen Ligationslösung und Inkubieren in einer feuchten Inkubator bei 37 ° C für 30 min.
      6. Bereiten Sie Amplifikationslösung. Mix 4 ul - Polymerase, 64 & mgr; l 5x Verstärkung Lager und 252 & mgr; l H ₂ O Vermeiden Sie Licht von diesem Schritt ab.
      7. Abklopfen Flüssigkeit aus dem Schlitten und waschen 2 x 2 min in 1x Wash Buffer A.
      8. Fügen Sie den Verstärkerlification Lösung und für 100 min bei 37 ° C in einer dunklen Feuchte Inkubator inkubiert.
      9. Abklopfen die Flüssigkeit aus der Folie, und waschen 2 x 10 min in 1x Waschpuffer B (im Lieferumfang des Kits). Waschen Sie für 1 min in 0,01x Waschpuffer B.
      10. Trocknen Sie die Rutsche und Halterung mit 250 & mgr; l eines handelsüblichen Montagemedium (mit DAPI) pro Folie.
9. Untersuchen Sie Fluoreszenzsignale unter einem Mikroskop mit einem 10x Okular Objektiv und 20X Objektiv verwendet wird. Erwerben Sie Bilder von einer CCD-Kamera.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt , dass NF90 und RBM3 sind beide Kernproteine und nur ein kleiner Teil ist in das Zytoplasma. Bemerkenswert ist, gibt es drei verschiedene Bands für RBM3 positiv gefärbt. Die kleinste knapp unter 20 kDa die richtige Größe der RBM3 reflektiert (das vorhergesagte Molekulargewicht von RBM3 ist 17 kDa). Der Ursprung der beiden anderen Bänder noch untersucht werden. Co-Immunpräzipitationsexperimenten mit RBM3 als Köder-Protein ergab, dass NF90-RBM3 Wechselwir...

Diskussion

Es gibt mehrere Vorteile sowie Nachteile für beide Methoden. Als eine relativ neue Technik, ein offensichtlicher Vorteil Proximity Ligation Assay ist die Durchführbarkeit Protein-Protein-Wechselwirkungen auf Einzelzellebene statt einer Charge von heterogenen Zellen aufzuklären. Bilder mit hoher Auflösung und Größe (zB durch konfokale Mikroskop) bieten die Möglichkeit zur Quantifizierung von einzelnen fluoreszierenden Flecken zu zählen. Im Gegensatz dazu kann die herkömmliche Kombination von Co-Immunpräzipitatio...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Dulbeccos modifizierter Adler" s Medium (DMEM)	Sigma	D6429	Hoher Glukose 4.500 mg/l
Fötales Rinderserum (FBS)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10270106
Penicillin-Streptomycin (PenStrep)	BioConcept	4-01F00-H
NE-PER Reagenzien für die nukleare und zytoplasmatische Extraktion	Thermo Fisher Scientific	78833
1,4-Dithiothreitol (DTT)	Carl Roth	6908.3
Dynabeads Protein G	Novex, Thermo Fisher Scientific	10003D
DRBP76 (NF90/NF110) Antikörper	BD Transduction	612154	verwenden 1:1.000 für WB und 1:100 für ICC/PLA
RBM3 Antikörper	ProteinTech	14363-1-AP	1:1.000 für WB und 1:100 für ICC/PLA
Lamin A/C Antikörper	Cell Signaling Technology	#2032	1:1.000 für WB verwenden
Anti-GAPDH-Antikörper	Abcam	ab8245	Verwendung 1:1.000 für WB
normales Kaninchen-IgG	Santa Cruz	sc-2027
Anti-Kaninchen-IgG, HRP-verknüpfter sekundärer Antikörper	Cell Signaling Technology	#7074	Verwendung 1:5.000 für WB
Anti-Maus-HRP-Sekundärantikörper	Carl Roth	4759.1	Verwendung 1:5.000 für WB
Clarity Western ECL Blotting-Substrat	Bio-Rad	#1705060
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel	Novex, Thermo Fisher	Scientific NP0321BOX
NuPAGE LDS Probenpuffer (4x)	Novex, Thermo Fisher Scientific	NP0007
NuPAGE MES SDS Laufpuffer (20x)	Novex, Thermo Fisher Scientific	NP0002
NuPAGE Transfer Puffer (20x)	Novex, Thermo Fisher Scientific	NP00061
Amersham Hypond P 0,2 PVDF-Membran	GE Healthcare Life Sciences	10600021
Poly-D-Lysin 8 Well Culture Slide	Corning BioCoat	354632
Paraformaldehyd (PFA)	Sigma	P6148
Normales Ziegenserum (NGS)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	PCN5000
Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L-Antikörper), Alexa Fluor 488-Konjugat	Thermo Fisher Scientific	A-11001
Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L-Antikörper), Alexa Fluor 568-Konjugat	Thermo Fisher Scientific	A-11011
4′, 6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI)	Sigma	D9542
Duolink PLA-Sonde Anti-Maus PLUS	Sigma	DUO92001
Duolink PLA   Sonde Anti-Kaninchen MINUS	Sigma	DUO92005
Duolink Detektionsreagenzien Rot	Sigma	DUO92008
Duolink Waschpuffer Fluoreszenz	Sigma	DUO82049
Duolink Eindeckmedium mit DAPI	Sigma	DUO82040
Mowiol 4-88	Sigma	81381
Mikroskop	Olympus	AX-70
CCD-Kamera	SPOT	Insight 2MP Firewire
Röntgenfilm	Fujifilm	Super RX
Filmbearbeitungsmaschine	Fujifilm	FPM-100A