Chondrogenese aus Stammzellen erfordert Feinabstimmung der Kulturbedingungen. Hier präsentieren wir einen magnetischen Ansatz für Zellen Kondensation, ein wesentlicher Schritt Chondrogenese zu initiieren. Darüber hinaus zeigen wir, dass dynamische Reifung in einem Bioreaktor mechanische Stimulation auf die Zellkonstrukte und verbessert knorpelige extrazelluläre Matrixproduktion gilt.
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Methodenartikel
3D Magnetic Stem Cell Aggregation und Bioreactor Ausreifung für Knorpelregeneration
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Cartilage Engineering bleibt eine Herausforderung aufgrund der Schwierigkeiten in einer in - vitro - Funktions Implantat ähnlich dem nativen Gewebe zu schaffen. Ein Ansatz vor kurzem für die Entwicklung von autologem Ersatz erforscht beinhaltet die Differenzierung von Stammzellen in Chondrozyten. Zur Einleitung dieses Chondrogenese, einen Verdichtungsgrad der Stammzellen erforderlich ist; Somit haben wir gezeigt, die Machbarkeit der magnetisch Kondensieren Zellen sowohl innerhalb dicken Gerüste und Gerüstfrei, unter Verwendung von miniaturisierten Magnetfeldquellen als Zell Attraktoren. Dieser magnetische Ansatz wurde auch zur Führung Aggregat Fusion verwendet und gerüstfrei organisiert, dreidimensionale (3D) Gewebe mehr Millimeter groß zu bauen. Zusätzlich zur Bereitstellung einer verbesserten Größe aufweist, wobei die durch magnetische angetriebene fusion gebildete Gewebe stellte eine signifikante Zunahme der Expression von Kollagen II, und ein ähnlicher Trend wurde für Aggrecan Expression beobachtet. Da die nativen Knorpel wurde Kräfte t ausgesetztHut seine 3D-Struktur, dynamische Reifung beeinflusst wurde ebenfalls durchgeführt. Ein Bioreaktor, die mechanischen Reiz liefert wurde, um die magnetisch ausgesät Gerüste über einen Zeitraum von 21 Tagen zur Kultur verwendet. Bioreactor Reifung weitgehend Chondrogenese in die cellularized Gerüste verbessert; die extrazelluläre Matrix unter diesen Bedingungen erhalten wurde, war reich an Kollagen II und Aggrecan. Diese Arbeit beschreibt das innovative Potential der magnetischen Kondensation von markierten Stammzellen und dynamischer Reifung in einem Bioreaktor für eine verbesserte chondrogene Differenzierung, beide Gerüstfrei und innerhalb Polysaccharid Gerüste.
Einleitung
Magnetische Nanopartikel ist bereits in der Klinik als Kontrastmittel für die Magnetresonanztomographie (MRI) verwendet wird, und die therapeutischen Anwendungen weiter wachsen. Zum Beispiel hat es vor kurzem , dass markierte Zellen in vivo unter Verwendung eines externen Magnetfeld manipuliert werden können , gezeigt worden und können an einer definierten Stelle der Implantation 1, 2, 3 gerichtet und / oder aufrechterhalten werden. In der regenerativen Medizin, können sie organisierte Gewebe in vitro 4, einschließlich Gefäßgewebe
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Protokoll
1. Aufbau der Magneteinrichtungen
HINWEIS: Die Vorrichtungen zur Zellbesiedelung verwendet , variieren je nach der Anwendung (Abbildung 1). Aggregat zu bilden, wird die Anzahl der Zellen auf 2,5 × 10 5 / Aggregat begrenzt, so dass die magnetischen Spitzen sehr dünn sein muss (750 & mgr; m im Durchmesser). Um das 1,8 cm 2/7 mm dickes Scaffolds Saatgut, müssen die Magnete größer (3 mm im Durchmesser) , und werden die Zellmigration durch die Poren des Gerüsts gewährleisten.
- Aufbau einer Vorrichtung mit Mikromagnete für Aggregatbildung (1A)
- Make Mikrolöcher mit einem ....
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Ergebnisse
Erstens können Aggregate gebildet werden , einzeln Mikromagnete unter Verwendung von 2,5 x 10 5 markierten Stammzellen (2A) abzuscheiden. Diese einzelnen Aggregate (~ 0,8 mm groß), kann dann in größeren Strukturen durch sequenzielle, magnetisch induzierte Fusion fusioniert werden. Zum Beispiel am Tag 8 der chondrogenen Reifung wurden Aggregate in Kontakt paarweise angeordnet Dubletts zu bilden; Vierlinge wurden am Tag versammelt 11 von 2 Dubletten vermischt; u.......
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Diskussion
Erstens, weil die hier vorgestellten Techniken auf der Internalisierung von magnetischen Nanopartikeln beruhen, ein wichtiges Thema ist das Ergebnis der Nanopartikel, wenn sie innerhalb der Zellen zu lokalisieren. Es ist wahr , dass Eisen - Nanopartikeln potenzielle Toxizität oder beeinträchtigter Differenzierung Kapazität auslösen können je nach ihrer Größe, Beschichtungs- und Belichtungszeit 19, 22. Jedoch haben mehrere Studien keinen Einfluss auf die Zellphys.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Die Autoren möchten sich QuinXell Technologies und CellD, insbesondere Lothar Grannemann und Dominique Ghozlan für ihre Hilfe mit dem Bioreaktor bestätigen. Wir danken Catherine Le Visage, die uns mit den Pullulan / Dextran-Polysaccharid-Gerüste zur Verfügung gestellt. Diese Arbeit wurde von der Europäischen Union (ERC-2014-Cog Projekt MATISSE 648.779) und von der AgenceNationalede la Recherche (ANR), Frankreich (MagStem Projekt ANR-11 SVSE5) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Eisenoxid (Maghemit) Nanopartikel (γ-Fe2O3) | PHENIX - Universität Paris 6 | Hergestellt und gegeben von C. Mé nager | Mittlerer Durchmesser von 8,1 nm und negativer Oberflächenladung |
| Polysaccharid Pullulan/Dextran-Gerüste | LIOAD - Universität Nantes | Hergestellt und gegeben von C. Le Visage | Hergestellt aus einer 75:25-Mischung von Pullulan/Dextran unter alkalischen Bedingungen (10 M NaOH). Porosität: 185-205 &Mikro; m; Dicke: 7 Mm; Fläche: 1,8 cm2. |
| TisXell Regenerationssystem | QuinXell Technologies | QX900-002 | Biaxialer Bioreaktor mit 500 mL Kulturkammer |
| Käfig für Gerüste: Histosette II M492 | VWR | 720-0909 | |
| Mesenchymale Stammzelle (MSC) | Lonza | PT-2501 | wurden drei unabhängige Chargen verwendet |
| MSCGM BulletKit Medium | Lonza | PT-3001 | Für das vollständige Medium fügen Sie das mitgelieferte BulletKit (enthält Serum, Glutamin und Antibiotika) zum MSCGM Medium |
| DMEM mit Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | hinzu Kein Natriumpyruvat, kein HEPES |
| RPMI-Medium 1640, kein Glutamin | Life Technologies | 31870-025 | Kein Natriumpyruvat, kein HEPES |
| PBS ohne CaCl2 ohne MgCl2 | Life Technologies | 14190-094 | |
| 0,05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin (10.000/nbsp; U/mL) / Streptomycin (10.000 &Mikro; g/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) | Corning | 354352 | |
| Natriumpyruvatlösung 100 mM | Sigma | S8636 | |
| L-Ascorbinsäure 2-phosphat | Sigma | A8960 | Bereiten Sie die konzentrierte Lösung (25 mM) in destilliertem Wasser extemporan |
| L-Prolin | Sigma | P5607 | vorDie 175 mM Stammlösung in destilliertem Wasser verdünnt zubereiten und bei 4 ° C |
| Dexamethason | Sigma | D4902 | Bereiten Sie die 1 mM Stammlösung zu 100% in Ethanol verdünnt vor und lagern Sie sie bei -20 ° C |
| TGF-beta 3 Eiweiß 10 &Mikro; g | Interchim | 30R-AT028 | |
| Trinatriumcitrat | VWR | 33615.268 | Bereiten Sie die 1 M Stammlösung in destilliertem Wasser verdünnt und bei 4 ° C |
| Pullulanase aus Bacillus acidopullulyticus | Sigma | P2986 | |
| Dextranase aus Chaetomium erraticum | Sigma | D0443 | |
| NucleoSpin RNA Extraction Kit | Macherey-Nagel | 740955.5 | |
| SuperScript II Reverse Transkriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| Zufällig Grundierung - Hexamer | Promega | C1181 | 500 & Mikro; g/ml: Verwenden Sie verdünnt 1/2 und geben Sie 1 & Mikro; L pro Probe |
| Rekombinante RNAs im Ribonuklease-Inhibitor | Promega | N2511 | 40 U/µ L: 1 & Mikro setzen; L pro Probe |
| PCR-Nukleotid-dNTP-Mix (10 Roche | 10842321 | ||
| SyBr Green PCR Master Mix | Life Technologies | 4368708 | |
| Step One Plus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4381792 | |
| Formalinlösung 10% neutral gepuffert | Sigma | HT5012 | |
| OCT Lösung | VWR | 361603E | |
| Isopentan | Sigma | M32631 | |
| Toluidinblau O | VWR | 1.15930.0025 | |
| Ethanol absolut | VWR | 20821.310 | |
| Toluol | VWR | 1.08323.1000 | |
| Einbettmedium Pertex | Histolab | 840 | |
| RPLP0 Primer für qPCR | Eurogentec | 5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCATCAT-3'; 5'-AAGGTGTAATC CGTCTCCACAGA-3'Aggrecan | |
| Primer für qPCR | Eurogentec | 5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3'; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5'Kollagen | |
| II Primer für qPCR | Eurogentec | 5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3'; 3'-TCCATGTTGGAGAAAACCTTCA-5' |
Referenzen
- Naumova, A. V., Modo, M., Moore, A., Murry, C. E., Frank, J. A. Clinical imaging in regenerative medicine. Nat Biotechnol. 32 (8), 804-818 (2014).
- Edmundson, M., Thanh, N. T., Song, B. Nanoparticles based stem cell tracking in regenerative medicine. Theranostics. 3 (8), 573-582 (2....
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Nachdrucke und Genehmigungen
