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1. Aufbau der Magneteinrichtungen
HINWEIS: Die Vorrichtungen zur Zellbesiedelung verwendet , variieren je nach der Anwendung (Abbildung 1). Aggregat zu bilden, wird die Anzahl der Zellen auf 2,5 × 10 5 / Aggregat begrenzt, so dass die magnetischen Spitzen sehr dünn sein muss (750 & mgr; m im Durchmesser). Um das 1,8 cm 2/7 mm dickes Scaffolds Saatgut, müssen die Magnete größer (3 mm im Durchmesser) , und werden die Zellmigration durch die Poren des Gerüsts gewährleisten.
- Aufbau einer Vorrichtung mit Mikromagnete für Aggregatbildung (1A)
- Make Mikrolöcher mit einem 0,8-mm-Bohrer durch Aluminiumbleche (3 cm im Durchmesser und 6 mm dick).
- Legen Sie eine magnetische Spitze (750 & mgr; m im Durchmesser) in jedes Loch der Platte.
- Diese Scheibe über einen Permanentmagnet Neodymium, die Magnetisierung bis zur Sättigung gewährleistet.
- Aufbau einer Vorrichtung für Gerüst Aussaat ( 1B)
- Schneidet harten Polystyrol in 2,4 cm 2 Quadrate.
- Einsatz 9 kleine Magnete (3 mm im Durchmesser, 6 mm lang) in einem gleichen Abstand über eine Fläche von 1,6 cm 2.
- Dieses Gerät über einen permanenten Neodym-Magneten.
2. Stem Cell Labeling
HINWEIS: Es wurden Stammzellen mit 0,1 mM magnetischen Nanopartikeln für 30 min (2,6 ± 0,2 pg Eisen / Zelle) markierte Aggregate zu bilden, während sie mit 0,2 mM magnetischen Nanopartikeln für 30 min (5 ± 0,4 pg Eisen / Zelle) markiert wurden auf Saatgut Gerüste. Diese Nanopartikel - Konzentrationen und Inkubationszeiten wurden bereits veröffentlicht und für MSC und anderen Zellen 18, 19, verwendet , und es bestimmt wurde , dass Nanopartikel beeinflusst weder die Lebensfähigkeit der Zellen noch MSC Differenzierungsfähigkeit. Die Eisenmasse von den Stammzellen eingebracht wurde mittels Single-ce gemessenll Magnetophorese 19, 20.
- Kultur von humanen mesenchymalen Stammzellen (MSC) in komplettem mesenchymalen Stammzellwachstumsmedium (MSCGM) bei 37 ° C und 5% CO 2 , bis nahe zur Konfluenz (~ 90%).
- Bereiten Sie die magnetische Markierungslösung durch Mischen von 0,1 oder 0,2 mM Maghemit Citrat beschichteten Eisenoxid (γFe 2 O 3; Kern: 8 nm Durchmesser) in serumfreien 5A Medium McCoy modifizierte bei Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ohne Glutamin und enthaltend 5 mM Natriumcitrat.
- Entsorgen des Mediums, spülen Sie die Zellen mit serumfreiem RPMI - Medium ohne Glutamin und 10 ml Eisenoxid - Nanopartikel - Lösung pro 150 cm 2 Kulturkolben, dem minimalen Volumen benötigt , um alle Zellen zu bedecken.
- Inkubieren für 30 min bei 37 ° C und 5% CO 2 und dann die Nanopartikel - Lösung verwerfen. Spülen für 5 Minuten mit serumfreiem RPMI-Medium ohne Glutamin nan das internalisierenoparticles noch an die Plasmamembran gebunden.
- Verwerfen Sie den RPMI-Medium und 25 ml komplettes Medium MSCGM pro Kolben. Inkubiere über Nacht bei 37 ° C und 5% CO 2.
3. Magnetische Zell Seeding
- Frisch bereiten das chondrogenen Medium nach Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit hohem Glucose mit L-Glutamin durch Zugabe von 50 & mgr; M L-Ascorbinsäure-2-phosphat, 0,1 & mgr; M Dexamethason, 1 mM Natriumpyruvat, 0,35 mM L-Prolin, 1% universelle Kultur Ergänzung mit Insulin, Transferrin und menschliche Selenige Säure (ITS-Premix) und 10 ng / ml transformierender Wachstumsfaktor-beta 3 (TGF-β3).
- Lösen sie die magnetischen Zellen unter Verwendung von 8 ml 0,05% Trypsin-EDTA pro 150 cm 2 Kulturkolben und zentrifugieren Sie die dissoziierten Zellen bei 260 × g für 5 min. Anzusaugen, das Medium und zähle die resuspendierten Zellen.
- Eine Glasboden-Zellkultur-Petrischale (35 mm) auf der Oberseite der beiden Magnetvorrichtungen.
- Um magnetically Aggregate bilden, 3 ml chondrogenen Medium zu der Petrischale hinzuzufügen und sanft das kleinste Volumen möglich ist (nicht mehr als 8 & mgr; l) , die 2,5 × 10 5 Zellen pro Aggregat markierten Ablagerung (bis zu 16 Aggregaten abgelagert werden kann). Lassen Sie die Petrischale für 20-30 min ohne ihn zu bewegen, so dass es Sphäroide zu bilden, und dann das komplette Gerät, einschließlich der Petrischale mit 16 die Aggregate in den Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Formsteuer Aggregate nach dem gleichen Protokoll und ersetzen das gesamte Medium mit chondrogenen Medium ohne TGF-β3.
- Um das 3D-Aggregat-Konstrukt zu erzeugen, legen zwei Aggregate in Kontakt am Tag 8-8 Dubletten zu bilden und die Fusion einzuleiten. Am Tag 11, fusionieren 2 Dubletten 4 Vierlinge zu bilden. Schließlich verschmelzen die vier Vierlinge am Tag 15 die endgültige Struktur zu erhalten.
- Zur gleichen Zeit bilden sich Aggregate von 2,5 x 10 5 Zentrifugieren markierten Stammzellen bei 26015; g für 5 min in 15-ml-Röhrchen mit 1,5 ml chondrogenen Medium mit oder ohne TGF-β3 (für die Probe und die Kontrolle, jeweils).
- Magnetisch seed Scaffolds Platzieren jedes getrocknetes Gerüst in eine Petrischale. Verwenden Polysaccharid poröse Gerüste aus Pullulan / Dextran - 21. Für jedes Gerüst, verdünnte 2 × 10 6 markierte Stammzellen in 350 & mgr; l von chondrogenen Medium ohne TGF-β3 und sorgfältig die Zellen auf das Gerüst pipettieren.
- bei 37 ° C für 5 min inkubieren Vollzellpenetration innerhalb des Gerüsts zu ermöglichen, und fügen Sie dann vorsichtig 3 ml chondrogenen Medium mit oder ohne TGF-β3 (für die Probe oder Kontrolle, jeweils), um die Petrischale.
- Inkubiere das cellularized Gerüst an seiner Magnetvorrichtung bei 37 ° C und 5% CO 2 für 4 Tage für Zellmigration durch die Poren und das Gerüstes Confinement zu ermöglichen.
- Zur gleichen Zeit, Samen Gerüste mit 2 x 10 6 markierte Stammzellen nach dem gleichen Verfahren und Inkubieren ohne die Magneten gleichmäßig seeded Gerüste als positive Kontrollen zu erhalten.
4. Differenzierung in Chondrozyten
HINWEIS: Nach 4 Tagen Inkubation entfernen, die Magnete und weiterhin die chondrogene Reifung entweder in einer Petrischale (statische Bedingungen) oder in einem Bioreaktor (dynamische Bedingungen). Negative Kontrollproben werden in statischen Bedingungen mit chondrogenen Medium ohne TGF-β3 gereift.
- In statischen Bedingungen halten die cellularized Gerüste oder Aggregate in der gleichen Petrischale. Ändern Sie den chondrogenen Medium zweimal pro Woche für 21 Tage.
- In dynamischen Bedingungen, bereitet den Bioreaktor.
- Schneiden Silikonschlauch an der entsprechenden Länge entsprechend dem Protokoll des Herstellers.
- Autoklaviert alle Materialien: 500 ml Kulturkammer, Schläuche, 2-Wege-Rotatoren und Käfige.
- Legen Sie die Bioreaktor Teile in einen sterilen microbiologische Sicherheit Station. Schließen Sie den Schlauch an den 2-Wege-Rotatoren und in die Kulturkammer nach den Anweisungen des Herstellers.
- übertragen sorgfältig die cellularized Scaffolds in sterilisierte Käfigen einem sterilen Spatel verwendet wird. Platz 2 Gerüste pro Käfig. Wenn die Käfige bereit sind, legen Sie sie in die Nadeln des Deckels, damit sie nicht während der weiteren Drehung bewegt. Füllen der Kulturkammer mit chondrogenem Medium und schließen, wobei der Deckel die Käfige enthalten.
- Schalten Sie die peristaltische Pumpe den Schlauch mit chondrogenem Medium zu füllen und Luftblasen zu beseitigen.
- Und sichern die gefüllte Kammer in den Motor des Bioreaktors und schalten auf dem Computer, der die Drehungen steuert sowohl des Armes und der Kammer.
- Anwenden einer Rotationsgeschwindigkeit von 5 Umdrehungen pro Minute (rpm), die beide auf dem Arm und der Kammer. Stellen Sie die peristaltische Pumpe bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 10 Umdrehungen pro Minute für die kontinuierliche Zuführung der cellularized Gerüste.
5. RNA-Extraktion und Genexpressionsanalyse
HINWEIS: Vor der RNA-Extraktion, verdaut die Gerüste mit einer enzymatischen Lösung.
- Herstellung von 1 ml Enzymlösung durch Zugabe von 100 & mgr; l von Pullulanase (40 U / ml) und 50 ul Dextranase (60 mg / ml) zu 850 ml serumfreiem DMEM Medium.
- Spülen Sie die Gerüste zweimal mit serumfreiem DMEM-Medium, entsorgen Sie das Medium, und fügen Sie 800 ul der Enzymlösung pro Gerüst. Inkubieren für 15-30 min bei 37 ° C unter leichtem Schütteln.
- Wenn das Gerüst vollständig gelöst ist, werden die Lösung um die Zellen in ein 1,5-ml-Röhrchen, Zentrifuge bei 300 × g für 10 min enthält, sorgfältig das Medium absaugen, spült zweimal mit steriler 1 × Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), Zentrifuge bei 300 × g für 10 min und erneut suspendieren die Zellen in der RNA-Isolierungslösung.
- Um die RNA aus den Aggregaten zu extrahieren, legen Sie die Sphäroiden in der RNA-Isolationslösung undvollständig zerquetscht sie mit einem Homogenisator RNA-Extraktion vor der Durchführung.
- Isolieren Sie die RNA ein Kit zur Gesamt-RNA-Extraktion unter Verwendung nach den Anweisungen des Herstellers.
- Synthetisieren komplementärer DNA von 400 ng Gesamt-RNA unter Verwendung von reverser Transkriptase gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung von 250 ng-Zufallsprimer, 1 & mgr; l dNTP-Mix (jeweils 10 mM) und 40 U / ml RNase-Inhibitor; Das Endvolumen der Reaktion beträgt 20 & mgr; L. Am Ende der Reaktion, fügen 80 ul destilliertes Wasser, um ein Endvolumen von 100 & mgr; l zu erhalten.
- Für eine quantitative Polymerase-Kettenreaktion (PCR), mit einem PCR-Gemisch ein fluoreszierendes Reagens enthält, um die relative Expression der Gene von Interesse, wie Aggrecan (AGC) und Kollagen II (Col II) quantitativ zu bestimmen, das mit 10 × verdünnt cDNA. Normalisieren des Niveaus der Genexpression mit dem Referenz-Genen ribosomale Protein, Groß, P0 (RPLP0). Führen Sie die Berechnungen mit der 2 - ΔΔCT FormelGegebenen ΔΔCT = ACT von differenzierten Zustand - bedeuten ACT der Kontrollbedingung, und jeder ACT stellt die CT des Gens von Interesse - die CT des Referenzgens (RPLP0).
- Bestimmen, statistische Messungen als Mittelwert, die Standardabweichung des Mittelwerts (SEM) ±. Führen Sie die Analyse mit n ≥ 2 unabhängigen Experimenten. Verwenden Sie T-Test die statistischen Unterschiede zwischen zentrifugierten Pellets und magnetischen Fusionen (* p <0,05) zu analysieren. Bestimmen Sie die Bedeutung mit Kruskal-Wallis-Test (one-way ANOVA nichtparametrischer) statistisch signifikante Unterschiede zwischen differenzierten Gerüsten und mit dem Steuer Gerüst (* p <0,05) zu analysieren.
6. Die histologische Analyse
- Spülen Sie die cellularized Gerüste oder Aggregate mit sterilem 1 × PBS, fixieren sie in 10% Formalin-Lösung für 1 h bei Raumtemperatur und spült mit 1 × PBS.
- Entfernen Sie die PBS, bettet die Proben in optimaler cutting Temperatur Verbindung (OCT), und sie in einem Bad Isopentan in flüssigen Stickstoff getaucht einzufrieren. Lagern Sie die Probe bei -20 ° C. Schneiden Sie die Proben mit einem Kryostat-8 & mgr; m Kryoschnitte für die Aggregate oder 12 & mgr; m für die cellularized Gerüste zu erhalten.
- Verfärbung die Kryoschnitte mit 0,5% Toluidinblau-Lösung für 2 min, Spülen in Leitungswasser, Entwässern mit 100% Ethanol, Toluol klären, und montieren die Objektträger mit einem Befestigungsmittel für die Lichtmikroskopie.