Dieses Protokoll beschreibt eine skalierbare individuelle Grooming-Assay-Technik in Drosophila , die robuste, quantitative Daten liefert, um das Groomverhalten zu messen. Die Methode basiert auf dem Vergleich der Unterschied in der Farbstoff-Akkumulation auf die Körper von ungezügelten versus gepflegten Tiere über einen festgelegten Zeitraum.
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Methodenartikel
Quantifizierung von Drosophila Grooming Behavior
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Drosophila- Grooming-Verhalten ist ein komplexes, mehrstufiges Lokomotiv-Programm, das eine koordinierte Bewegung von Vorder- und Hinterbeinen erfordert. Hier stellen wir ein Grooming-Assay-Protokoll und ein neuartiges Kammerdesign vor, das kostengünstig und skalierbar ist für kleine oder große Studien der Drosophila- Pflege. Fliegen sind ganz über ihren Körper mit Brilliant Yellow Farbstoff und gegebene Zeit, um den Farbstoff aus ihren Körpern in der Kammer zu entfernen. Fliegen werden dann in einem eingestellten Volumen an Ethanol abgelagert, um den Farbstoff zu solubilisieren. Die relative spektrale Extinktion von Farbstoff-Ethanol-Proben für gepflegte und nicht geschliffene Tiere wird gemessen und aufgezeichnet. Das Protokoll liefert quantitative Daten der Farbstoffakkumulation für einzelne Fliegen, die leicht gemittelt und über Proben verglichen werden können. Dies ermöglicht es, dass experimentelle Entwürfe die Grooming-Fähigkeit für mutierte Tierversuche oder Schaltungsmanipulationen leicht auswerten können. Dieses effiziente Verfahren ist vielseitig und skalierbar. Wir zeigen wOrk-flow des Protokolls und Vergleichsdaten zwischen WT-Tieren und mutierten Tieren für den Drosophila Typ I Dopamin Rezeptor ( DopR ).
Einleitung
Grooming in Drosophila melanogaster ( D. melanogaster ) ist ein robustes angeborenes Verhalten, das die Koordination mehrerer unabhängiger motorischer Programme beinhaltet 1 . Fruchtfliegen reinigen ihre Körper von Staub, Mikroben und anderen Krankheitserregern, die die normale physiologische Funktion wie Seh- und Flucht behindern oder zu erheblichen Immun-Herausforderungen führen können. Beim Erfassen und Beantworten sowohl der mechanischen 2 als auch der immunen Aktivierung 3 reiben Fliegen wiederholt ihre Beine zusammen oder auf eine gezielte Körperregion, bis sie ausreichend....
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Protokoll
1. Vorbereitung
- Bereiten Sie einen Aspirator für das Bewegen von lebenden Drosophila aus einer Kulturfläschchen in die Putzkammer vor. Aspiratoren erlauben den Transfer von bewussten Tieren in die Verhaltenskammern, um sicherzustellen, dass die Anästhesie die nachfolgende Verhaltensbeobachtung nicht beeinträchtigt.
- Mit Schere schneiden 1.5 Meter von Tygon-Schlauch ID ⅛ ", OD ¼" .Schneiden Sie mindestens 1 Zoll von der Spitze einer 1 mL Einweg-Mikropipettenspitze. Halten Sie ein 1 cm großes Quadratnetz (Öffnung 0,196 Zoll) über die geschnittene Spitze.
ANMERKUNG: Die meisten 1mL Spitzen haben eine Abstufungslinie, i....
- Mit Schere schneiden 1.5 Meter von Tygon-Schlauch ID ⅛ ", OD ¼" .Schneiden Sie mindestens 1 Zoll von der Spitze einer 1 mL Einweg-Mikropipettenspitze. Halten Sie ein 1 cm großes Quadratnetz (Öffnung 0,196 Zoll) über die geschnittene Spitze.
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Ergebnisse
Der Grooming-Assay liefert quantitative Daten, um die Verhaltensfähigkeit zu bewerten, basierend auf dem relativen Rest des angesammelten Farbstoffs, der auf den Körper der Fliegen nach einer festgelegten Zeit der Messung für das Grooming (30 min) zurückgelassen wurde. Probenbilder der Gleitpflegekammergestaltung und Hauptschritte des Assays sind in Fig. 1 hervorgehoben . Fliegen aggregieren eine signifikante Menge an Farbstoff aus der sofortigen Staubbildung durch Vorte.......
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Diskussion
Der Grooming-Assay ist relativ einfach, aber wir würden den Experimentatoren vorsichtig sein, den folgenden Problemen besondere Aufmerksamkeit zu widmen. Eine dichte Abdichtung durch Anziehen der Schrauben an der Ober- und Unterseite nach dem Einführen von Fliegen und Farbstoff ist für reproduzierbare Ergebnisse unerlässlich. Der brillante gelbe Farbstoff ist sehr fein und lose Gelenke werden Verluste an Farbstoff aus den Kanten der Kammer ermöglichen. Die Unregelmäßigkeit des Farbstoffgehalts für jede Vertiefung könnte.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Danksagungen
Wir danken Brian Shepherd, Tat Udomritthiruj, Aaron Willey, Ruby Froom, Elise Pitmon und Rose Hedreen für die frühe Arbeit bei der Prüfung und Etablierung dieser Methodik und Kammermusik. Wir danken Kelly Tellez und Graham Buchan für das Lesen und Bearbeiten des Manuskripts. Wir danken Andrew Seeds und Julie Simpson für ihre Pionierarbeit und ihre Beratung und Unterstützung bei der Vorgabe der Verwendung von Brilliant Yellow Dye (Sigma). Diese Arbeit wird zum Teil von der Mary E. Groff Chirurgischen und medizinischen Forschung und Bildung Charitable Trust, dem Bronfman Science Center und dem Hellman Fellows Programm unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| High-Flex Tygon PVC Klarsichtschlauch | McMaster-Carr | 5229K54 | ID 1/8", OD 1/4", verwendet mit Mikropipettenspitzen und Netz zur Herstellung von Mundsaugern |
| Mikropipettenspitzen (1 mL und 200 μ L) | Genesee Scientific | 24-165, 24-150R | |
| Nylon-Mesh-Sieb, 2 x 2,6 " | McMaster-Carr | 9318T44 | Wird verwendet, um Pflegekammer- und Mundsauger |
| zu konstruieren Dumont # 5 Pinzette | Roboz Chirurgisches Instrument | RS-5050 | |
| Brilliant Yellow Dye | Sigma-Aldrich | 201375-25G | Wir empfehlen die Verwendung von Nitrilhandschuhen beim Umgang mit diesem Produkt |
| Vortexer | Fisher Scientific | 12-812 | auf "Touch" |
| -Ethanol | Carolina Biological Supply | 86-1282 | |
| 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen | VWR International | 10025-726 | |
| 0,65 mL Mikrozentrifugenröhrchen | VWR International | 20170-293 | Röhrchen können mit aufeinanderfolgenden Assays wiederverwendet werden |
| UV 96-Well-Platte | Corning | ||
| BioTek Synergy HTX | Platereader BioTek | muss den Katalog herunterladen, um auf die Produktnummer zugreifen zu | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview |
| Gen5 Microplate Reader und Imager Software | BioTek | ||
| Microsoft Excel | Microsoft | https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI.. ql4M2LoZBEhcBljvIA)() | |
| Drosophila Inkubator | Tritech | DT2-CIRC-TK | |
| 1/4" Acryl Kunststoff | McMaster-Carr | 8473K341 | |
| 8 - 32 Muttern | McMaster-Carr | 90257A009 | |
| 8 - 32 x 1" Sechskantschrauben | McMaster-Carr | 92185A199 | die Bodenplatte muss für diese Größe mit einem Gewinde versehen werden |
| Schraube 8 - 32 x 1/2" Sechskantschrauben | McMaster-Carr | 92185A194 | die zweite Platte von oben muss mit einem Gewinde versehen werden |
| 2 - 56 3/8" Flachkopf-Kreuzschlitzschrauben | McMaster-Carr | 91500A088 | diese halten die beiden mittleren Platten zusammen |
| 0,175" ID, 1/4" OD, 0,34" Aluminiumrohr | McMaster-Carr | 92510A044 | Hergestellt im eigenen Haus; Das angegebene Produkt hat ungefähr die gleichen Abmessungen und sollte für Schrauben der Größe 8 geeignet sein. Diese dienen als Hüllen für die 1"-Schrauben und setzen die Sechskantkappe leicht von der Oberfläche der Deckplatte ab |
Referenzen
- Szebenyi, A. L. Cleaning Behaviour in Drosophila-Melanogaster. Animal. Behaviour. 17, (1969).
- Corfas, G., Dudai, Y. Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila. J Neurosci. 9 (1), 56-62 (1989).
- Yanagawa, A., Guigue, A. M. A., Marion-Poll, F.
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Nachdrucke und Genehmigungen
