Notch-Signalisierung ist eine Form der zellulären Kommunikation, die auf direktem Kontakt zwischen Zellen beruht. Um den Notch-Signalweg in vitro korrekt zu induzieren, müssen Notch-Liganden den Zellen in einem immobilisierten Zustand präsentiert werden. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur in vitro Stimulation des Notch-Signalwegs in Maus-Osteoklasten-Vorläufern.
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Methodenartikel
Die Stimulation der Notch-Signalweg in Maus-Osteoklasten Precursors
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Notch-Signalübertragung ist eine Schlüsselkomponente mehrerer physiologischer und pathologischer Prozesse. Die Art des Notch-Signalwegs macht jedoch die In-vitro-Untersuchung seiner unterschiedlichen und manchmal widersprüchlichen Rollen zu einer Herausforderung. Als Bestandteil der direkten Zell-Zell-Kommunikation sowohl mit Rezeptoren als auch mit Liganden, die an die Plasmamembran gebunden sind, kann der Notch-Signalweg in vitro nicht durch einfache Zugabe von Liganden zu Kulturmedien aktiviert werden, wie es bei vielen anderen Signalwegen möglich ist. Stattdessen müssen Notch-Liganden den Zellen in einem immobilisierten Zustand präsentiert werden.
Variationen in den Methoden der Aktivierung des Notch-Signalwegs können in kultivierten Zellen zu unterschiedlichen Ergebnissen führen. Insbesondere bei Osteoklastenvorläufern haben Unterschiede in den Methoden der Notch-Stimulation und der Kultur und Differenzierung von Osteoklastenvorläufern zu Uneinigkeit darüber geführt, ob der Notch-Signalweg ein positiver oder negativer Regulator der Osteoklastendifferenzierung ist. Während nähere Vergleiche der Osteoklastendifferenzierung unter verschiedenen Notch-Stimulationsbedingungen in vitro und genetische Modelle die Kontroverse um den Notch-Signalweg und Osteoklasten weitgehend beigelegt haben, könnten standardisierte Methoden zur kontinuierlichen und temporären Stimulation des Notch-Signalwegs in kultivierten Zellen solche Diskrepanzen in Zukunft verhindern.
Dieses Protokoll beschreibt zwei Methoden zur Stimulierung des Notch-Signalwegs speziell in kultivierten Maus-Osteoklasten-Vorläufern, obwohl diese Methoden mit geringfügigen Anpassungen auf jeden adhärenten Zelltyp anwendbar sein sollten. Die erste Methode erzeugt eine kontinuierliche Stimulation der Notch-Signalgebung und beinhaltet die Immobilisierung des Notch-Liganden auf einer Gewebekulturoberfläche vor der Aussaat der Zellen. Die zweite, bei der ein Notch-Ligand verwendet wird, der an Agarosekügelchen gebunden ist, ermöglicht eine vorübergehende Stimulation der Notch-Signalgebung in Zellen, die bereits an einer Kulturoberfläche haften. Dieses Protokoll umfasst auch Methoden zum Nachweis der Notch-Aktivierung in Osteoklasten-Vorläufern sowie repräsentative transkriptionelle Marker für die Aktivierung des Notch-Signalwegs.
Einleitung
Die Säuger Notch - Signalwegs ist homolog zu den gleichen Stoffwechselweg in Drosophila melanogaster und besteht aus vier transmembranen Notch - Rezeptoren (Notch1-4) und fünf membrangebundenen Liganden der Jagged (JAG1 & JAG2) und Delta-like (DLL1, 3, & 4) Familien 1. Notch - Signal wird eingeleitet , wenn Notch - Rezeptor auf einer Empfangszelle , die durch Liganden auf einer Sendezelle 2 gebunden ist. Während dieser trans-Aktivierung, die membrangebundene erzeugt Notch - Liganden eine Streckkraft auf die Membran-gebundenen Notch - Rezeptor 3, 4. Die ....
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Protokoll
Alle Forschung Wirbeltiere wurde in Übereinstimmung mit Protokollen, die von der University of Pennsylvania Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) genehmigt durchgeführt.
1. Kultur Nährmedienzubereitung
- Bereiten α-MEM mit Minimum Essential Medium (MEM) -Pulver und 1,9 g Natriumbicarbonat in 900 ml H 2 O und ergänzt mit 2 mM L-Glutamin Auflösen, 100 Einheiten / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 100 ml hitze- inaktiviertes fötales Rinderserum. Sterilisieren einen 0,22 um Polyethersulfon (PES) Filter.
- Bereiten Sie Makrophagen-Medium durch Ergänzung α-MEM mit 35 ng / ml rekombinantem Maus....
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Ergebnisse
Das Ziel dieser Methode ist es, Kultur und Notch-Signalweg in Osteoklasten-Vorläufer zu stimulieren. Wenn sie richtig kultiviert weisen Osteoklastenvorläufer eine hauptsächlich längliche spindelförmige Morphologie mit glatten Zytoplasma (1A). Sorgfalt sollte immunologische Aktivierung der Osteoklastenvorläufer zu vermeiden. Nach der Aktivierung aus und werden dabei Vorstufen mit schaumigen Zytoplasma abgeflacht (1B). Diese "Spiegelei" Zellen si.......
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Diskussion
Kritische Schritte innerhalb des Protokolls
Kultur und in vitro Differenzierung von Osteoklasten - Vorläufer liefert eine nützliche Plattform für die Untersuchung von molekularen Mechanismen der osteoclastogenesis und Identifizierung von therapeutischen Ziele für die Knochenregeneration und die Erhaltung der Knochenmasse. Wenn Maus Osteoklastenvorläufer Kultivierung ist das wichtigste Element Wartung von Vorläufern in einem naiven Zustand. Als Makrophagen-ähnliche Zellen werden Osteokl.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde unterstützt durch das University of Pennsylvania Center for Musculoskeletal Disorders (5 P30 AR050950-09), ein Stipendium der AO Foundation (S-16-12A), das Philadelphia VA Medical Center Translational Musculoskeletal Research Center und einen intramuralen Forschungsentwicklungsfonds für orthopädische Chirurgie. JWA wird durch das PENN-PORT-Stipendium der University of Pennsylvania Postdoctoral Opportunities in Research and Teaching (PENN-PORT) unterstützt, das vom National Institute of General Medical Sciences Institutional Research and Career Development Award (IRACDA; 5 K12 GM081259-08) finanziert wird.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Rekombinante Maus M-CSF | Biolegend | 576402 | Von mehreren Lieferanten erhältlich, Testaktivität vor Experimenten |
| Rekombinante Maus RANKL | Shenandoah Biotechnology | 200-04 | Von mehreren Lieferanten erhältlich, Testaktivität vor Experimenten |
| Rekombinante humane Jagged1-Fc | R& D Systems | 1277-JG-050 | Von mehreren Lieferanten erhältlich, Testaktivität vor Experimenten |
| Protein G Agarosekügelchen | InvivoGen | gel-agg-2 | |
| Ziege anti-human IgG Fc | Jackson ImmunoResearch | 109-001-008 | |
| Minimum Essential Medium Pulver | Sigma-Aldrich | M0894 | |
| Reagenz für die Accutase-Zelldissoziation | ThermoFisher | A1110501 | Wird zum Heben von Osteoklastenvorläufern |
| verwendet Saure Phosphatase, Leukozyten (TRAP) Kit | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | Wird verwendet, um differenzierte Osteoklasten zu färben |
Referenzen
- Harper, J. A., Yuan, J. S., Tan, J. B., Visan, I., Guidos, C. J. Notch signaling in development and disease. Clin Genet. 64 (6), 461-472 (2003).
- Andersson, E. R., Sandberg, R., Lendahl, U. Notch signaling: simplicity in design, versatility in function. Development. 138 (17), 3593-3....
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Nachdrucke und Genehmigungen
