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Methodenartikel

Mit Zebrabärbling Modelle menschlicher Influenza-A-Virus-Infektionen Virostatika auf Bildschirm und Host-Immun-Zell-Antworten Charakterisieren

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DOI:

10.3791/55235

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20. Januar 2017

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1Department of Molecular and Biomedical Sciences, University of Maine, 2Graduate School of Biomedical Sciences and Engineering, University of Maine, 3School of Biology and Ecology, University of Maine, 4Division of Intramural Research, Immunity, Inflammation and Disease Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, NIH, 5Department of Chemical and Biological Engineering, University of Maine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Systemische und lokalisierte Zebrafisch-Infektionsmodelle für humane Influenza-A-Viren werden demonstriert. Unter Verwendung eines systemischen Infektionsmodells kann der Zebrafisch zum Screening von antiviralen Medikamenten verwendet werden. Unter Verwendung eines lokalisierten Infektionsmodells kann der Zebrafisch zur Charakterisierung der Immunzellreaktionen des Wirts verwendet werden.

Zusammenfassung

Jedes Jahr haben saisonale Grippeausbrüche tiefgreifende Auswirkungen auf die Gesellschaften weltweit. Trotz weltweiter Bemühungen bleibt die Grippe eine hartnäckige Belastung für das Gesundheitswesen. Die wichtigste Strategie zur Eindämmung von Infektionen ist die jährliche Impfung. Bei Personen, die sich mit Influenza infiziert haben, können antivirale Medikamente die Symptome lindern. Es besteht ein klarer und ungedeckter Bedarf, alternative Strategien zur Bekämpfung der Grippe zu entwickeln. Es wurden mehrere Tiermodelle erstellt, um Wirt-Influenza-Interaktionen zu modellieren. In diesem Artikel werden Protokolle zur Generierung von Zebrafischmodellen für systemische und lokalisierte Infektionen mit dem humanen Influenza-A-Virus (IAV) beschrieben. Mit Hilfe eines systemischen IAV-Infektionsmodells können kleine Moleküle mit potenzieller antiviraler Aktivität gescreent werden. Als Proof-of-Principle wird ein Protokoll beschrieben, das die Wirksamkeit des antiviralen Medikaments Zanamivir bei IAV-infizierten Zebrafischen demonstriert. Es wird gezeigt, wie Krankheitsphänotypen quantifiziert werden können, um die relative Wirksamkeit potenzieller antiviraler Medikamente bei IAV-infizierten Zebrafischen zu bewerten. In den letzten Jahren wurde die entscheidende Rolle, die Neutrophile bei der Reaktion des menschlichen Wirts auf eine Influenzainfektion spielen, zunehmend anerkannt. Der Zebrafisch hat sich als unverzichtbares Modell für die Erforschung der Biologie von Neutrophilen erwiesen, mit direkten Auswirkungen auf die Humanmedizin. Es wird ein Protokoll zur Erzeugung einer lokalisierten IAV-Infektion in der Tg(mpx:mCherry)-Zebrafischlinie zur Untersuchung der Biologie von Neutrophilen im Rahmen einer lokalisierten Virusinfektion beschrieben. Die Rekrutierung von Neutrophilen an lokalisierten Infektionsherden bietet einen zusätzlichen quantifizierbaren Phänotyp für die Beurteilung experimenteller Manipulationen, die therapeutische Anwendungen haben könnten. Beide beschriebenen Zebrafischprotokolle rekapitulieren Aspekte der menschlichen IAV-Infektion. Das Zebrafischmodell besitzt zahlreiche inhärente Vorteile, darunter eine hohe Fruchtbarkeit, optische Klarheit, Zugänglichkeit für das Wirkstoffscreening und die Verfügbarkeit transgener Linien, einschließlich solcher, in denen Immunzellen wie Neutrophile mit fluoreszierenden Proteinen markiert sind. Die hier beschriebenen Protokolle nutzen diese Vorteile und haben das Potenzial, wichtige Einblicke in die Wirt-IAV-Interaktionen zu liefern, die sich letztendlich auf die Klinik übertragen lassen.

Einleitung

Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation (WHO), infizieren Influenzaviren 5-10% der Erwachsenen und 20-30% der Kinder jährlich und verursachen 3,5 Millionen Fälle von schwerer Krankheit und bis zu 500.000 Todesfälle weltweit 1. Jährliche Impfungen gegen Influenza bleiben die beste Option, Krankheit zu verhindern. Die Bemühungen wie der WHO Global Action Plan haben saisonale Impfstoff Gebrauch Impfstoff Produktionskapazität erhöht und die Forschung und Entwicklung wirksamer Impfstoff Strategien, um die Morbidität und Mortalität im Zusammenhang mit saisonalen Influenza - Ausbrüche 2 zu reduzieren. Antivirale Medikamente wie Neuraminidase - Inhibitoren (zB Zanamivir und Oseltamivir) sind in einigen Ländern verfügbar und haben bei der Milderung Symptome wirksam erwiesen, wenn 3 innerhalb der ersten 48 Stunden nach Auftreten verabreicht, 4, 5. Trotz weltweiten Bemühungen, Eindämmung der saisonalen Grippe outbreaks bleibt eine große Herausforderung zu diesem Zeitpunkt, wie Influenzavirus Antigendrift oft Strom Fähigkeiten überschreitet 6 an den sich ändernden Genom des Virus anzupassen. Impfstrategien neue Stämme des Virus Targeting muss im Voraus entwickelt werden und sind manchmal weniger gemacht als optimal wirksam durch unvorhergesehene Änderungen in der Art der Stämme, die schließlich in einer Influenza-Saison überwiegen. Aus diesen Gründen ist ein eindeutiger Bedarf für die Aufnahme Infektionen alternative therapeutische Strategien zu entwickeln, und die Verringerung der Mortalität. Durch Erreichen Interaktion ein besseres Verständnis der Wirt-Virus kann es möglich sein , neue anti-Influenza - Medikamente zu entwickeln und adjuvante Therapien 7, 8.

Der menschliche Wirt-Influenza-A-Virus (IAV) Interaktion ist komplex. Mehrere Tiermodelle menschlicher IAV-Infektion haben, um einen Einblick in die Wirt-Virus-Interaktion, includ entwickelting Mäuse, Meerschweinchen, Baumwolle Ratten, Hamster, Frettchen und Makaken 9. Während wichtige Daten bietet, die das Verständnis der Wirt-IAV Dynamik verbessert haben, besitzt jedes Modellorganismus erhebliche Nachteile, die berücksichtigt werden müssen, wenn die Ergebnisse in der Humanmedizin zu übersetzen versucht. Zum Beispiel Mäuse, die die am weitesten verbreitete Modell sind, entwickeln sich nicht leicht-IAV induzierte Symptome der Infektion , wenn sie mit menschlichen Influenza - Isolaten 9 infiziert. Dies liegt daran , Mäuse die natürliche Tropismus für Influenza beim Menschen fehlt isoliert da Zellen Maus epithelialen α-2,3 Sialinsäure - Bindungen exprimieren , anstelle der α-2,6 Sialinsäure - Bindungen , bezogen auf die menschlichen Epithelzellen 10. Die Hämagglutinin - Proteine in menschlichen IAV - Isolate positiv binden und Wirtszellen tragen α-2,6 Sialinsäure - Bindungen durch rezeptorvermittelte Endozytose 9, 11, geben Sie 12, 13. Als Folge wird nun angenommen, dass Mausmodelle für menschliche Influenza bei der Entwicklung darauf geachtet werden, muss die entsprechende Belastung der Maus mit dem entsprechenden Influenza-Stamm, um zu paaren Krankheitsphänotypen zu erreichen, die Aspekte der menschlichen Krankheit rekapitulieren. Im Gegensatz dazu besitzen Epithelzellen in den oberen Atemwegen von Frettchen α-2,6 - Bindungen , die Sialinsäure menschlichen Zellen 14 ähneln. Infizierte Frettchen teilen viele der pathologischen und klinischen Merkmale bei der menschlichen Krankheit beobachtet, darunter die Pathogenität und Übertragbarkeit von Mensch und Vogelgrippeviren 14, 15. Sie sind auch auf die Wirksamkeit des Impfstoffes Studien sehr zugänglich. Dennoch hat das Frettchen Modell für die menschliche Influenza hauptsächlich einige Nachteile in Bezug auf ihre Größe und die Kosten der Haltung, die Akquisition von statistisch signifi machenkippe Daten herausfordernd. Darüber hinaus haben Frettchen angezeigt zuvor Unterschiede in der Arzneimittel Pharmakokinetik, Bioverfügbarkeit und Toxizität, die Prüfung der Wirksamkeit erschweren. Zum Beispiel Frettchen Toxizität für den M2 - Ionenkanal - Inhibitor Amantadin 16 aufweisen. Somit ist es klar, dass ein Tiermodell bei der Wahl Fragen über die menschliche IAV-Infektionen zu untersuchen, ist es wichtig, die besonderen Vorteile und Einschränkungen zu berücksichtigen, und den Aspekt des Wirt-Virus-Interaktion, die untersucht wird.

Der Zebrabärbling, Danio rerio, ist ein Tiermodell , das für die Untersuchung von mikrobiellen Infektion einzigartige Möglichkeiten bietet, Immunantwort Host und potentielle Arzneimitteltherapien 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28. Die Anwesenheit von α-2,6-verknüpften Sialinsäuren an der Oberfläche von Zellen in der Zebrabärbling vorgeschlagen seine Anfälligkeit für IAV, die 19 wurde in Infektionsstudien und abgebildet in vivo unter Verwendung eines Fluoreszenz - Reporter - Stamm von IAV bestätigt. In IAV-infizierten Zebrabärbling erhöhte Expression der antiviralen ifnphi1 und mxa Transkripte zeigten , dass eine angeborene Immunantwort stimuliert worden waren, und die von der IAV-infizierten Zebrabärbling angezeigt Pathologie, einschließlich Ödemen und Gewebezerstörung, war ähnlich wie in der menschlichen Influenza - Infektionen beobachtet . Darüber hinaus 19 der IAV antivirale Neuraminidasehemmer Zanamivir begrenzte Mortalität und reduziert die Virusreplikation in Zebrabärbling.

In diesem Bericht wird ein Protokoll für die System initiiertic IAV-Infektionen in Zebrafischembryonen beschrieben. Mit Zanamivir bei klinisch relevanten Dosen als Proof-of-Prinzip, die Nützlichkeit dieses Zebrabärbling Modell IAV-Infektion für Screening von Verbindungen auf antivirale Aktivität nachgewiesen wird. Darüber hinaus ist eine lokalisierte epitheliale IAV - Infektion in der Zebrabärbling Blase schwimmen ein Protokoll für die Erzeugung, ein Organ , das anatomisch zu betrachten ist und funktionell analog zu der Säugerlungen 21, 29, 30, 31, beschrieben. Mit dieser lokalisierten IAV-Infektionsmodell kann neutrophilen Rekrutierung an den Ort der Infektion verfolgt werden, so dass Untersuchungen über die Rolle der neutrophilen Biologie in der IAV-Infektion und Entzündung. Diese Modelle Zebrabärbling Ergänzung bestehender Tiermodellen von menschlichen IAV-Infektionen und sind besonders nützlich zum Testen von kleinen Molekülen und Immunzellantworten aufgrund der Möglichkeit einer verstärkten sTATISTISCHE Leistung, Kapazität für moderate- zu Assays mit hohem Durchsatz und die Fähigkeiten, um Immunzellverhalten und die Funktion mit Lichtmikroskopie verfolgen.

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Protokoll

Alle Arbeiten sollten von den US Centers for Disease Control (CDC) und gemäß den Richtlinien festgelegt durch Institutional Animal Care und Verwenden Komitees (IACUC) beschrieben unter Verwendung von Biosicherheitsstufe 2 (oder BSL2) Standards durchgeführt werden. Bitte Rücksprache mit den zuständigen Beamten Sicherheit und die Einhaltung zu gewährleisten.

1. Zebrabärbling Pflege und Wartung

  1. Spawn Zebrabärbling und sammeln die erforderliche Anzahl von Embryonen für die Experimente. Bei Bedarf Massenzuchtbecken, wie die von Adatto et al. 32, können eine große Anzahl von entwicklungs inszenierten Embryonen zu sammeln eingesetzt werden.
  2. Lassen Embryonen, bis die gewünschte Entwicklungsstufe (48 Stunden nach der Befruchtung für eine systemische IAV-Infektion [Abschnitt 3] oder 5 Tage nach der Befruchtung für eine lokalisierte, schwimmen Blasenentzündung [Abschnitt 4]) in tiefen Petrischalen mit geringer Dichte zu entwickeln (< 100 Embryonen / Schale) bei 28 ° C in sterilem Wasser Ei mit 60 ug / ml Meersalz (zB Instant Ocean) in destilliertem Wasser.
    1. Entfernen Sie tote Embryonen mit Kunststoff Transferpipetten und Ei Wasser täglich ändern optimale Gesundheit und Entwicklung zu gewährleisten.

2. Herstellung von Materialien und Reagenzien

  1. Bereiten Sie eine 4 mg / ml Stammlösung von Tricaine-S (pH-Wert auf 7,0 bis 7,4) in destilliertem Wasser und Autoklaven. Lagerung bei 4 ° C.
  2. Ziehen Borosilicatglas Kapillaren mit Filamenten mit einer Mikropipette Abzieher (zB Mikropipette Abzieher mit den folgenden Einstellungen: Druckeinstellung = 100, Wärme = 550, ziehen Sie = [kein Wert], Geschwindigkeit = 130, Zeit = 110).
    HINWEIS: Vor der Nadel Trimmen, die Länge von wo die Nadel beginnt an der Spitze der Nadel zu verjüngen würde ungefähr 12-15 mm sein. Dies kann variieren, jedoch auf Basis von Vorlieben und Anwendung. Eine längere, graduelle Verjüngung kann mehr vorzuziehen sein, wegen der erhöhten Fähigkeit, den Embryo und dem reduzierten ri zu durchstechensk der Nadel Biegen oder Brechen.
  3. Melt 2 g Agarose in 100 ml Ei Wasser unter Verwendung einer Mikrowelle. Machen Sie Platten, auf denen Line-Up und injizieren die Embryonen durch Agarose in tiefe Petrischalen geschmolzen Abfüll- und ermöglicht es zu verfestigen.
  4. Machen Sie eine 10 mg / ml Stamm von Zanamivir in Nuklease-freies Wasser. Aliquotieren und Einfrieren bei -20 ° C.
  5. Melt 0,5 g Agarose in 50 ml Ei Wasser unter Verwendung einer Mikrowelle zu machen Embryo Montage Agarose. Aufrechterhaltung in einem Wasserbad bei 50 ° C bis bereit während der Bilderzeugung zu verwenden.

3. Systemische IAV-Infektion (48 Stunden nach der Befruchtung)

ACHTUNG: Alle Mitarbeiter in der Forschung mit ihren Vorgesetzten und Ärzte in Bezug auf die Impfung vor Beginn der Arbeiten mit IAV konsultieren.

  1. Manuell dechorionate Embryonen am Tag des Experiments # 5 Pinzette. Achten Sie darauf, zu entfernen und einschläfern Embryonen, die in dem Prozess in 200 ug / ml Tricaine Lösung wurden verletzt.
  2. Vorbereitung of IAV für Mikroinjektions
    HINWEIS: Stämme, die Genaktivität zu infizieren gezeigt wurden, sind Influenza A / PR / 8/34 (H1N1) (APR8), Influenza-A-X-31 A / Aichi / 68 (H3N2) (X-31) und der fluoreszierenden Reporter Influenza - Stamm NS1-GFP 33. Details zu APR8 und X-31 und andere Stämme, können an der Influenza Research Database finden
    1. Propagieren des NS1-GFP - Stamm von IAV in bebrüteten Hühnereiern , wie zuvor beschrieben 34, 35. Sammeln, aliquoten und titrieren die Allantoisflüssigkeit enthält, IAV, und bei -80 ° C. Pre-Titer bestimmt APR8 und X-31-Viren können im Handel erworben werden.
      1. Kurz vor der Infektion schnell ein IAV aliquoten in behandschuhten Händen auftauen und legen Sie dann schnell auf Eis Titerverlust zu reduzieren.
    2. Viral Verdünnung
      1. Die APR8 oder X-31 - Viren Bei Verwendung verdünnt auf 3,3 x 10 6 Ei infektiöse Dosis 50% (EID 50) / ml in sterilem, eiskaltem PBS Nachtrtierter mit Phenolrot 0,25% in einer laminaren Strömungshaube (in Visualisierung zu unterstützen). Gleichzeitig wird eine Steuerung mit steriler PBS mit 0,25% Phenolrot eingerichtet.
      2. Bei Verwendung von 33 NS1-GFP - Stamm, verdünnt auf ~ 1,5 × 10 2 Plaque - bildenden Einheiten (PFU) pro nl in sterilem, eiskaltem PBS 0,25% Phenolrot enthält (in der Visualisierung zu unterstützen) in einer Laminar - Flow - Haube. Gleichzeitig wird eine Steuerung enthält Allantoisflüssigkeit von nicht infizierten Hühnereiern verdünnt wie das Virus in sterilem PBS mit 0,25% Phenolrot eingerichtet.
      3. Pflegen Sie die IAV auf Eis bis zum Gebrauch.
    3. Pipettieren Virus-Lösung in Mikroinjektionsnadeln mit Microspitzen kurz vor der Verwendung. Einfügen Mikroinjektionsnadel in die entsprechende Halterung der Einspritzvorrichtung (zB MPPI-3 Druckeinspritzsystem).
    4. Während unter dem Stereomikroskop betrachten, vorsichtig die Mikroinjektionsnadelspitze Clip mit scharfen, sterilisiert # 5 Pinzette.
      HINWEIS: Es wird empded, dass die Mikroinjektionsspitze allmählich abgeschnitten.
    5. Fußbremse Pedals des Druckeinspritzsystem und Injizieren in einen Tropfen Mikroskop Sionsöl auf einer Kalibrierungsmikrometer Folie. Den Durchmesser des Tropfens. Berechnen des Volumens des Tropfens unter Verwendung der Gleichung V = 4 / 3πr 3, wobei V Volumen in nl ist und r der Radius in & mgr; m.
      HINWEIS: Wenn der Tropfendurchmesser zu klein ist, zusätzliche Glas abgeschnitten kann sein kann, oder Druck und Timing-Einstellungen angepasst werden. Wenn der Tropfendurchmesser zu groß ist, Druck und Zeiteinstellungen eingestellt werden.
    6. Passen Druck und Zeiteinstellungen auf dem Druck Injektor und / oder reclip die Nadelspitze, bis die gewünschte Injektionsvolumen erreicht wird (in der Regel 1-3 nl). Die Druckeinstellung zwischen 20 und 30 psi und Pulsdauer Einstellungen zwischen 40 und 80 ms sind typisch. Passen Druck zurück, so dass es Kapillardruck kontert aber nicht undicht IAV (Netto-Null-Druck).
  3. Richten Embryonen für die Injektion
    1. Anesthetize dechorionated Embryonen in 200 ug / ml Tricaine.
    2. Sobald die Bewegung aufhört, übertragen 10-20 Embryonen zu einem 2% -igen Platte (hergestellt in Abschnitt 2.3) mit einer Plastikpipette. Verwenden Sie Plastikpipette überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
    3. Ausrichten vorsichtig Embryonen für die Mikroinjektion mit einer feuerpolierten und versiegelt Borosilicatglas Kapillare. Mit einem Stereomikroskop, sanft orientieren Embryonen , so dass der Kanal von Cuvier oder die hintere Kardinalvene im Einklang mit der Mikroinjektionsnadel ist (Abbildung 1A).
  4. IAV Mikroinjektions
    1. die Mikroinjektionsnadel in den Kanal von Cuvier oder der hinteren Kardinalvene vorsichtig einsetzen. Drücken Fußpedal das gewünschte Volumen von IAV in den Kreislauf des Embryos (1A) zu injizieren. Embryos können mehr als eine Zeit, wenn nötig injiziert werden.
      HINWEIS: Die Injektion Bolus sollte in den Kreislauf und distrib gefegt werdenim ganzen Körper ausgeschüttete. Wenn Injektionsvolumen an der Injektionsstelle sammelt, entfernen Embryo aus Experiment und Euthanize.
    2. Wiederholen Sie Injektionen an verschiedenen Embryonen mit Kontroll-Lösung speziell für den Stamm des Virus gewählt. Für APR8 und X-31, verwenden Sie die in Abschnitt 3.2.2.1 Kontrolle; für das NS1-GFP, die in Abschnitt 3.2.2.2 beschriebenen Steuerung verwenden.
  5. Transfer Embryonen markierten Petrischalen mit sterilen Ei Wasser und in Inkubatoren bei 33 ° C.
    HINWEIS: Infizierte Embryonen bei 33 ° C gezüchtet werden, verbessert die virale Replikation zu unterstützen. Zusätzlich Inkubation bei 33 ° C nachahmt näher die Temperatur des menschlichen oberen Atemwege, die mit niedrigeren Temperaturen in der äußeren Umgebung in engem Kontakt ist und in dem IAV-Infektionen auftreten. Die Embryonen können auf einen breiten Temperaturbereich 34 akklimatisieren.

4. Lokalisierte, Schwimmblase IAV - Infektion in Tg (MPX: mCherry) transgener Zebrafische (5 Tage nach der Befruchtung)

  1. Herstellung von IAV für Mikroinjektions
    1. Man verdünnt das NS1-GFP-Stamm und Kontrolle Injektionslösung, wie in Abschnitt 3.2 beschrieben.
    2. Bereiten Sie Nadeln, wie in Abschnitt 2.2 beschrieben.
    3. Richten Tg (MPX: mCherry) 35 Larven enthalten , aufgeblasen Schwimmblasen , wie in Abschnitt 3.3 mit der folgenden Ausnahme beschrieben. Ausrichten Larven in der Weise , dass die Nadel die Schwimmblase durchdringen kann und das Virus kann in dem hinteren Teil des Schwimmblase abgeschieden werden, wie zuvor beschrieben 36 (2A).
  2. IAV Mikroinjektions
    1. Führen Sie vorsichtig die Mikroinjektionsnadel in die Schwimmblase und injizieren das gewünschte Volumen (zB 5 nl) zum hinteren Ende der Struktur (2A).
      HINWEIS: Die Injektion Bolus in Richtung des hinteren sammeln sollte und die Luftblase der Schwimmblase sollte be nach vorne verschoben. GFP-Expression sollte beginnen bei 3 Stunden nach der Injektion beobachtet werden.
    2. Wiederholen Sie Injektionen mit Kontroll-Lösung speziell für den Stamm des Virus gewählt, wie in Abschnitt 3.4.2 beschrieben.
  3. Übertragen Larven zu Petrischalen mit sterilen Ei Wasser und in Inkubatoren bei 33 ° C.

5. Antiviral Drug Treatment

HINWEIS: Das Protokoll unten beschreibt die Zanamivir Behandlung zuvor in Gabor gezeigt et al. 19. Dieses Protokoll kann modifiziert werden, um andere antivirale Medikamente zu screenen und hat das Potential, modifiziert werden, um mehrere Verbindungen in einer 96-Well-Platte, Hochdurchsatz-Format zu screenen.

  1. Nach 3 Stunden nach der Infektion, Ei Wasser von NS1-GFP- und Kontrolle infizierten Fische mit sterilem Wasser Ei mit 0, 16,7 oder 33,3 ng / ml Zanamivir ersetzen.
    ANMERKUNG: Diese Konzentrationen wurden gewählt, um zu versuchen, die physiologische Werte fo erreicht nachzubildenllowing Verabreichung von Zanamivir bei menschlichen Patienten (100, 200 oder 600 mg, iv, zweimal täglich oder 10 mg inhaliert, zweimal täglich). Die Serumkonzentrationen bei menschlichen Patienten reichten von 9,83 bis 45,3 ng / ml 36.
  2. Im Laufe von 5 Tagen Ei Wasser alle 12 Stunden und ersetzen mit sterilem Wasser Ei ändern Sie die entsprechende Menge an Zanamivir enthält.
  3. Verfolgen Sie Verlauf der Infektion.
    1. Anästhesieren Zebrabärbling in 200 & mgr; g / ml Tricaine. Überwachen Sie die GFP-Expression durch Stereo-Fluoreszenzmikroskopie visuell beobachten Unterschiede in der Infektionsmuster zwischen der IAV-infizierten und Kontrollfische und unter den Fischen in den verschiedenen Konzentrationen von Drogen eingetaucht.
    2. Spur Morbidität und Mortalität im Laufe der 5 Tage.
      1. Nehmen Sie Beobachtungen über Dynamik-Infektion Krankheit Pathologie im Zusammenhang, einschließlich Anzeichen von Lethargie und Beweise von Ödemen, Unterschiede in der Pigmentierung, okulare und kraniofazialen Mißbildungen und Lordose. Krankheit Pathologietypischerweise wird offensichtlich in Steuer infizierten Fischen bei 24-48 Stunden nach der Injektion in Abhängigkeit von der Menge des Virus injiziert. Sammeln Sie Bilder 24 Stunden nach der Injektion.
      2. Alle 24 Stunden für 5 Tage nach der Infektion, notieren Sie die Zahl der Toten, morbid, und gesunde Larven. Tod durch das Fehlen eines wahrnehmbaren Herzschlag definiert. Plot-Daten wie gewünscht. Zum Beispiel Plot-Daten als Stapelbalkendiagramm, mit Prozentsätzen von gesunden, morbid, oder tote Fische, aufgetragen auf der y-Achse und der Behandlungsgruppe auf der x-Achse. 19
        HINWEIS: Die Mortalitäten kann durch Kaplan-Meier-Überlebensschätzungen erzielt. Je nach Anwendung kann es zweckmäßig sein, alternative Ansätze für die Morbidität scoring Fisch zu entwickeln, einschließlich einer Scoring-Matrix, die den Grad der Morbidität auf der Grundlage der zuvor genannten pathologischen Merkmale beobachtet quantifizieren kann.
      3. Beraten Sie sich mit einem Statistiker die entsprechenden statistischen Analysen anzuwenden.

6. Neutrophilenmigration

HINWEIS: Das Protokoll unten beschreibt ein Verfahren zur Verfolgung von neutrophilen Migration in die Schwimmblase nach einer lokalisierten, epithelialen IAV-Infektion. Die beschriebenen Verfahren können die Auswirkungen von genetischen und chemischen Manipulationen zu testen, modifiziert werden. zugrundeliegenden neutrophil Verhalten während einer IAV-Infektion unter Verwendung dieser Technik ist es möglich, die Mechanismen zu charakterisieren.

  1. Montage Zebrabärbling für Imaging
    1. Anästhesieren Larven werden in 200 & mgr; g / ml Tricaine abgebildet.
    2. Übertragen Sie eine individuelle Tg (MPX: mCherry) Larve, die zu einer Vertiefung einer 24 Bodenplatte gut, Glas mit NS1-GFP infiziert wurde in einem kleinen Tropfen Ei Wasser (~ 50 bis 100 & mgr; l). Wiederholen Sie mit anderen IAV-infizierten und Kontrollfische.
    3. Langsam 1% iges Embryo Medien in jede Vertiefung (Abschnitt 2.5) Montage, dabei nicht große Blasen einzuführen.
      1. Sanft einzustellen, die Position der Larve, so dass es auf seiner Seite angebracht ist.Goody und Henry 37 beschreiben , wie Sonden zu machen , die in dieser Anwendung mit Insektenstifte gut funktionieren , die in Borosilicatglas Kapillaren mit Filamenten und superglued an Ort und Stelle montiert sind.
    4. Nachdem die Agarose erhärtet, füllen Sie vorsichtig die einzelnen Vertiefungen mit Ei Wasser, das 200 ug / ml Tricaine.
    5. Mit einem konfokalen Mikroskop, Erfassung az Stapel Reihe von Hellfeld- und Fluoreszenzbilder ein 20x-Objektiv mit konzentrierten sich auf die Schwimmblase.
      1. Stellen Sie die obere und untere Grenze, so dass sie alle sichtbar beobachtbare grüne und rote Fluoreszenz zu erfassen.
      2. Aufnehmen von Bildern bei 2,0 & mgr; s / Pixel mit Schritten, die ≤ 4 & mgr; m sind. Zeit pro Pixel erhöht und zwischen den Schritten zu reduzieren Abstand (zB 0,5 bis 1,0 & mgr; m) erhöht sich die Bildauflösung und Qualität.
      3. Generieren eines zweidimensionalen Bildes durch Schichten verschmelzen.
      4. Vergleichen Sie die Anzahl der MPX-mCherry-positive Neutrophile vorhanden in die Schwimmblasen von IAV-infizierten und Kontrolle injizierten Zebrabärbling.

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Ergebnisse

Hier werden Daten zeigen , wie die systemische Infektion IAV in Zebrabärbling verwendet werden kann , um die Arzneimittelwirksamkeit (1A) -Test vorgesehen sind. Embry bei 48 Stunden nach der Befruchtung sind mit APR8 (1C, 1F), X-31 (Figuren 1D, 1G) oder NS1-GFP (Abbildungen 1 H-1I) über den Kanal von Cuvier injiziert , um eine virale Infektion zu initiieren. Eine weitere Gruppe von Embryonen bei 48 Stunden nach der Befru...

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Diskussion

Um die Vorteile gewonnen aus mit einem kleinen Tier maximieren menschlichen Wirt-Pathogen-Interaktionen zu modellieren, ist es wichtig, Forschungsfragen und Testen von Hypothesen zu formulieren, dass auf die inhärenten Vorteile des Modellsystems zu nutzen. Als Modell für die menschliche IAV-Infektion hat der Zebrabärbling mehrere Stärken, einschließlich hoher Fruchtbarkeit, optische Klarheit, Zugänglichkeit für Wirkstoff-Screening, und die Verfügbarkeit von transgenen Linien, die Immunzellen wie Neutrophilen beschriften...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren danken Mark Nilan für die Pflege und Wartung der Zebrafische sowie Meghan Breitbach und Deborah Bouchard für die Vermehrung von NS1-GFP und die Bestimmung der IAV-Titer. Diese Forschung wurde durch das NIGMS-Stipendium, das NIH P20GM103534 und die Maine Agricultural and Forest Experiment Station (Publikationsnummer 3493) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Instant OceanSpectrum BrandsSS15-10
100 mm x 25 mm sterile Einweg-Petrischale VWR89107-632
Transferpipetten Fisherbrand13-711-7M
Tricaine-S (MS-222)Western Chemical
Borosilikatglas Kapillare mit Filament Sutter Instrument BF120-69-10
/Brauner Mikropipettenabzieher Sutter InstrumentP-97
AgaroseLonza50004
ZanamivirAK ScientificG939
Dumont #5 Pinzette Electron Microscopy Sciences72700-D
Microloader-SpitzenEppendorf930001007
Mikroskop-ImmersionsölOlympusIMMOIL-F30CC
Mikroskoptisch-Kalibrierungsfolie AmScopeMR095
MPPI-3 Druckinjektor Angewandte wissenschaftliche Instrumentierung
StereomikroskopOlympusSZ61
GegendruckgerätAngewandte wissenschaftliche InstrumentierungBPU
Mikropipettenhalter-KitAngewandte wissenschaftliche InstrumentierungMPIP
FußschalterAngewandte wissenschaftliche InstrumentierungFSW
MikromanipulatorAngewandte wissenschaftliche InstrumentierungMM33
MagnetischeBasis Angewandte wissenschaftliche InstrumentierungMagnetische Basis
Phenol rotSigma-Aldrich P-4758
Niedertemperatur-InkubatorVWR2020
SteREO Discovery.V12Zeiss
IlluminatorZeissHXP 200C
KaltlichtquelleZeiss CL6000 LED
Multiwell-Platte mit Glasboden, 24 WellMattekP24G-0-13-F
KonfokalmikroskopOlympusIX-81 mit konfokalem Laserscanning-System
Fluoview-SoftwareOlympus
Prism v6GraphPad
Influenza A/PR/8/34 (H1N1) Virus Charles River 490710
Influenza A X-31, A/Aichi/68 (H3N2) Charles River 
Influenza NS1-GFPErwähnt in Manicassamy et al. 2010
Tg(mpx:mCherry)Erwähnt in Lam et al. 2013
FlammenderFV-1000490715

Referenzen

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