Methodenartikel

Zuordnung von RNA-RNA-Wechselwirkungen unter Verwendung von biotinyliertem Psoralen

DOI:

10.3791/55255

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24. Mai 2017

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1Stem Cell and Regenerative Biology, Genome Institute of Singapore, A*STAR, 2Computational and Systems Biology, Genome Institute of Singapore, A*STAR

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier beschreiben wir die Methode des S- Zensierens von P- Soralen-vernetzten, l- igierten und S- gewählten H- Ybriden (SPLASH), die eine genomweite Abbildung von intramolekularen und intermolekularen RNA-RNA-Wechselwirkungen in vivo ermöglichen. SPLASH kann angewendet werden, um RNA-Interaktome von Organismen einschließlich Hefe, Bakterien und Menschen zu untersuchen.

Zusammenfassung

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Zu wissen, wie RNAs mit sich selbst und mit anderen interagieren, ist der Schlüssel zum Verständnis der RNA-basierten Genregulation in der Zelle. Während Beispiele für RNA-RNA-Wechselwirkungen wie microRNA-mRNA-Wechselwirkungen gezeigt wurden, um die Genexpression zu regulieren, ist das volle Ausmaß, in dem RNA-Wechselwirkungen in der Zelle auftreten, noch unbekannt. Bisherige Methoden zur Untersuchung von RNA-Wechselwirkungen haben sich primär auf Teilmengen von RNAs konzentriert, die mit einem bestimmten Protein oder einer RNA-Spezies interagieren. Hier beschreiben wir eine Methode namens S equencing von P soralen vernetzt, L igated und S gewählt H ybrids (SPLASH), die genomweites Erfassen von RNA-Wechselwirkungen in vivo in einer unvoreingenommenen Weise ermöglicht. SPLASH nutzt in vivo- Vernetzung, Proximity-Ligation und High-Throughput-Sequenzierung, um intramolekulare und intermolekulare RNA-Basenpaarungspartner weltweit zu identifizieren. SPLASH kann auf verschiedene Organismen angewendet werden, einschließlich Bakterien, Hefe und menschliche Zellen, sowie aS vielfältige zelluläre Bedingungen, um das Verständnis der Dynamik der RNA-Organisation unter verschiedenen zellulären Kontexten zu erleichtern. Das gesamte experimentelle SPLASH-Protokoll dauert ca. 5 Tage und der rechnerische Workflow dauert ca. 7 Tage.

Einleitung

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Das Studium, wie Makromoleküle falten und miteinander interagieren, ist der Schlüssel zum Verständnis der Genregulation in der Zelle. Während in den vergangenen zehn Jahren viel Aufwand fokussiert wurde, um zu verstehen, wie DNA und Proteine ​​zur Genregulation beitragen, ist relativ wenig über die posttranskriptionelle Regulation der Genexpression bekannt. RNA trägt sowohl in ihrer linearen Sequenz als auch in ihrer sekundären und tertiären Struktur 1 Information. Seine Fähigkeit, sich mit sich selbst und mit anderen zu paaren, ist für seine Funktion in vivo wichtig. Jüngste Fortschritte bei der Hochdurchsatz-RNA-Sekundärstruktur-Son....

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Protokoll

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1. Behandlung von HeLa-Zellen mit biotinylierter Psoralen- und RNA-Extraktion

  1. Kultur-HeLa-Zellen in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin Streptomycin (PS) in einer 10 cm-Platte.
  2. Die HeLa-Zellen zweimal mit 5 ml 1x PBS waschen. Den PBS vollständig aus der Schale abtropfen lassen, indem man die Schale für 1 min vertikal platziert.
  3. Füge 1 ml PBS mit 200 μM biotinyliertem Psoralen und 0,01% w / v Digitonin zu den Zellen gleichmäßig hinzu und inkubiere bei 37 ° C für 5 min. Während biotinyliertes Psoralen in die Zelle eindringen kann, ist seine Permeabilität viel höher,....

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Ergebnisse

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Abbildung 1 zeigt den Schema des SPLASH-Workflows. Bei der Zugabe von biotinyliertem Psoralen in Gegenwart von 0,01% Digitonin und UV-Vernetzung wird die Gesamt-RNA aus den Zellen extrahiert und ein Punkt-Blot wird durchgeführt, um sicherzustellen, dass die Vernetzung von biotinyliertem zu der RNA effizient erfolgt ist (Abbildung 2 ). Wir verwenden biotinylierte 20-Basen-Oligos als positive Kontrollen, um die Menge an biotinylie.......

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Diskussion

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Hier beschreiben wir im Detail den experimentellen und rechnerischen Workflow für SPLASH, eine Methode, die es uns ermöglicht, paarweise RNA-Interaktionen genomweit zu identifizieren. Wir haben erfolgreich SPLASH in Bakterien-, Hefe- und menschlichen Kulturen eingesetzt und erwarten, dass die Strategie weitgehend auf verschiedene Organismen unter verschiedenen zellulären Zuständen angewendet werden kann. Einer der kritischen Schritte im Protokoll ist, mit mindestens 20 μg vernetzten RNA zu beginnen, um ausreichend Mater.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Danksagungen

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Wir danken den Mitgliedern des Wan Labors und dem Nagarajan Labor für informative Diskussionen. N.Nagarajan wird durch die Finanzierung von A * STAR unterstützt. Y.Wan wird unterstützt durch die Förderung von A * STAR und Society in Science-Branco Weiss Fellowship.

....

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Materialien


Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1 kb Plus DNA-LeiterLife Technologies Holdings Pte Ltd10787026 DNA-Leiter
10 bp DNA-LeiterLife Technologies Holdings Pte Ltd10821-015 DNA-Leiter
20% SDS-LösungErste BASEBUF-2052-1L   
20x SSCErste BASEBUF-3050-20X1L
3,0 M Natriumacetat-LösungErste BASEBUF-1151-1L-pH5,2   Erforderlich für die Nukleinsäurefällung
40% Acrylamid/Bis-Lösung, 19:1Bio-Rad1610145TBE Harnstoff-Gelkomponente
Ambion Buffer KitLife Technologies Holdings Pte LtdAM9010
Ammoniumpersulfat, Molekularqualität   PromegaV3131 FSME Urea Gel Komponente
Bromphenol BlueSigma-AldrichB0126-25G
ChloroformMerck1.02445.1000RNA-Extraktion
Einzelstrang-DNA-LigaseEpicentreCL9025KCircLigase II ssDNA Ligase
ZentrifugenröhrchenfilterSigma-AldrichCLS8160-96EACostar Spin-X Zentrifugenröhrchenfilter
D5628-1G DIGITONIN KRISTALLINSigma-AldrichD5628-1GFür die Zellbehandlung
Dark Reader Transilluminator Clare Chemical ResearchDark Reader DR89X TransilluminatorBlaulicht-Transilluminator
DNA-Gel-Ladefarbstoff (6x)Life Technologies Holdings Pte LtdR0611Erforderlich für die Agarose-Gel-Elektroporation
Dulbecco's Modified Eagle MediumPan BioTechP04-03500Für Hela-Zellkultur
Streptavidin-MagnetbeadsLife Technologies Holdings Pte Ltd65002Dynabeads MyOne Streptavidin C1 
Magnetischer Ständer für 15  mL RöhrenLife Technologies Holdings Pte Ltd12301DDynaMag-15
Magnetischer Ständer für 15  mL RöhrchenLife Technologies Holdings Pte Ltd12321DDynaMag-2
ThermoMixerEppendorf5382 000.015Eppendorf ThermoMixer  C
Biotinyliertes PsoralenLife Technologies Holdings Pte Ltd29986EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin
F8T5/BL HitachiF8T5/BL 365 nm UV-Lampe
Fötales RinderserumLife Technologies Holdings Pte Ltd10270106   Bestandteile von Hela medium
FormamidPromegaH5052   Komponente im Hybridisierungspuffer
G8T5Sankyo-DenkiG8T5254 nm UV-Lampe
GlycogenLife Technologies Holdings Pte Ltd10814010Erforderlich für die Nukleinsäurefällung
NanodropLife Technologies Holdings Pte LtdNanodrop 2000Spektralphotometer für die Nukleinsäurequantifizierung
Nukleasefreies Wasser Erste BASEBUF-1180-500ml   
Penicillin Streptomycin   Life Technologies Holdings Pte Ltd15140122   Bestandteile von Hela medium
High-Fidelity-DNA-Polymerase (2x)Life Technologies Holdings Pte LtdF531L Phusion High-Fidelity PCR Master Mix mit HF-Puffer (2x)
Primer Set 1New England BiolabsE7335L PCR-Primer
DNA-Gel-ExtraktionskitQIAgen28106QIAquick Gel-Extraktionskit
Fluorometrisches QuantifizierungskitLife Technologies Holdings Pte LtdQ32854Qubit dsDNA HS Assay Kit
RNA-AufreinigungskitQiagen74106RNeasy Mini Kit Silica-Membran-Säule
Rnase InhibitorLife Technologies Holdings Pte LtdAM2696SUPERase In
Reverse TranskriptaseLife Technologies Holdings Pte Ltd18080400SuperScript III Erststrangsynthese SuperMix
Nukleinsäure-Gel StainLife Technologies Holdings Pte LtdS11494SYBR GOLD NUKLEINSÄURE 500 UL
T4 PolynukleotidkinaseNew England BiolabsM0201LEndreparaturenzym
T4 RNA Ligase 1New England BiolabsM0204LEnzym für Proximity-Ligation
T4-RNA-Ligase 2, verkürzt KQNew England BiolabsM0373LEnzym für die Adapterligation
TemedBio-Rad1610801FSME Harnstoff-Gelkomponente
Guanidiniumthiocyanat-Phenol-ChloroformLife Technologies Holdings Pte Ltd15596018TRIzol® Reagenz für die RNA-Extraktion
UreaFirst BASEBIO-2070-5kg   
UV-VernetzerStratagene400072UV Stratalinker 1800
UV TransilluminatorUVP95-0417-01Zur Visualisierung von Banden
Xylol Cyanol FFSigma-AldrichX4126-10G
DNA-Aufreinigung itZymo Research D4004Zymo DNA-Konzentrator-5 
Liste der benötigten Software
FastQC Software0.11.4http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
SeqPrep Software1.0.7https://github.com/jstjohn/SeqPrep
BWA Software0.7.12http://bio-bwa.sourceforge.net/
SAMTOOLS Software1.2.1http://www.htslib.org/
PULLSEQ Software1.0.2https://github.com/bcthomas/pullseq
STAR Software2.5.0chttps://github.com/alexdobin/STAR
rem_dups.py PYTHON SkriptPYTHON 2.7.11https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
find_chimeras.py PYTHON SkriptPYTHON 2.7.11
pickJunctionReads.awk AWK-SkriptAWK GNU 4.1.2https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
Buffer composition
Elution buffer0.3
M Natriumacetat
< strong>Lysis Buffer
50 mM Tris-Cl pH 7,0
10 mM EDTA
1% SDS
Vor Gebrauch immer Superase-in frisch zugeben, außer beim Waschen von
Proteinase K Puffer 
100 mM NaCl
10 mM Tris-Cl pH 7,0
1 mM EDTA
0,5 % SDS
Hybridisierungspuffer
750 mM NaCl
1 % SDS
50 mM Tris-Cl pH 7,0
1 mM EDTA
15% Formamid (im Dunkeln bei 4 & Grad lagern; C)
Superase-in vor Gebrauch
2x SSC Waschpuffer
2x NaCl und Natriumcitrat (SSC) (verdünnt aus 20x SSC Invitrogen Stamm)
0,5% SDS
2x RNA-Fragmentierungspuffer
18 mM MgCl2
450 mM KCl
300 mM Tris-Cl pH 8,3
2x RNA-Beladung Farbstoff
95 % Formamid
0,02 % SDS
0,02 % Bromphenolblau
0,01 % Xylol, Cyanol
1 mM EDTA
RT Primer-Sequenz:
AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGATGGTGCCTACAG
https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src Perlen immer frisch zugeben, <td colspan="4">3' RNA-Adaptersequenz: 5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC

Referenzen

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  1. Wan, Y., Kertesz, M., Spitale, R. C., Segal, E., Chang, H. Y. Understanding the transcriptome through RNA structure. Nat.Rev.Genet. 12 (9), 641-655 (2011).
  2. Kertesz, M., et al. Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast. Nature. 467 (7311), 103-107 (2010)....

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Schlagwörter

SPLASH MethodeUV CrosslinkingProximity LigationHochdurchsatzsequenzierungRNA ExtraktionGelelektrophoreseMagnetbeadsComputational Pipeline

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