Eine Anpassbare Kammer zur Messung der Zellmigration

Summary

Dieses Protokoll Informationen eine anpassbare Methode Zellmigration in Reaktion auf die chemischen Lockstoffe zu messen, die auch die Diffusionsgeschwindigkeit eines Arzneimittels verwendet werden kann, aus einer Polymermatrix zu bestimmen.

Abstract

Die Zellmigration ist ein wichtiger Teil der Immunantwort, Wachstum und Wundheilung. Die Zellmigration ist ein komplexer Prozess, der Wechselwirkungen zwischen Zellen, die extrazelluläre Matrix, und löslichen und nicht-löslichen chemischen Faktoren (zB chemische Lockstoffe) beinhaltet. Standardmethoden für die Migration von Zellen zu messen, wie der Boyden-Kammer-Assay, der Arbeit von Zellen auf beiden Seiten eines Teilers zu zählen. Diese Techniken sind einfach zu bedienen; Sie bieten jedoch wenig geometrische Modifikation für verschiedene Anwendungen. Im Gegensatz dazu können Mikrofluidik - Vorrichtungen verwendet werden , die Zellmigration mit anpassbaren Konzentrationsgradienten von löslichen Faktoren ^{1, 2} zu beobachten. Allerdings Methoden für Mikrofluidik basierte Assays machen kann schwierig sein, zu lernen.

Hier beschreiben wir eine einfache Methode zur Erzeugung von Zellkulturkammern die Zellmigration in Reaktion auf die chemischen Konzentrationsgradienten zu messen. Unsere Zelle migration Kammerverfahren verschiedene lineare Konzentrationsgradienten, um zu schaffen Zellmigration für eine Vielzahl von Anwendungen zu untersuchen. Dieses Verfahren ist relativ einfach zu bedienen und wird in der Regel von Studenten durchgeführt.

Die Mikrokanalkammer wurde durch Einbringen eines Acryleinlage in der Form des endgültigen Mikrokanalkammer und in eine Petrischale geschaffen. Danach wird Poly (dimethylsiloxan) (PDMS) wurde auf die Oberseite des Einsatzes gegossen. Das PDMS wurde härten gelassen und dann wurde die Einlage entfernt. Dies ermöglichte die Schaffung von Vertiefungen in jeder gewünschten Form oder Größe. Zellen anschließend in die Mikrokanalkammer hinzugefügt werden können, und löslichen Mittel können durch Einweichen eines Agarose-Block in dem gewünschten Mittels zu einer der Vertiefungen zugegeben werden. Die Agarose-Block wird zu einer der Vertiefungen gegeben, und Zeitraffer-Bilder können in der Reihenfolge der Mikrokanalkammer entnommen werden, die Zellmigration zu quantifizieren. Änderungen dieses Verfahrens kann für eine gegebene Anwendung gemacht werden, diese Methode hig machenhly anpassbar.

Introduction

Damit lebenswichtige Prozesse wie Wundheilung, Immunreaktionen und Embryonalentwicklung stattfinden können, muss eine Zellmigration stattfinden. Die Zellmigration beinhaltet die Interaktion zwischen Zellen und Nachbarzellen, der extrazellulären Matrix und löslichen chemischen Hinweisen (Lockstoffe oder Abwehrmittel). Zum Beispiel spielen Fibroblasten im Prozess der Wundheilung eine wesentliche Rolle bei der Fibrogenese und Wundkontraktion, bei der die Zellen an den Ort der Verletzung rekrutiert werden, um Kollagen zu synthetisieren und die extrazelluläre Matrix zu bilden³. Zahlreiche Mechanismen, die hinter der Migration von Fibroblasten zu einer Wundstelle stehen, wurden untersucht, darunter verschiedene mechanische, physikalische, elektrische und chemotaktische Faktoren⁴. Fibroblasten reagieren besonders gut auf unterschiedliche Konzentrationsgradienten von Wachstumsfaktoren. Diese verschiedenen Wachstumsfaktoren arbeiten zusammen, um die Geweberegeneration zu optimieren⁵. Bei der Beobachtung der chemotaktischen Reaktion von Fibroblasten auf Wachstumsfaktorkonzentrationen kann man das Muster der gerichteten Migration von Fibroblasten untersuchen und untersuchen, wie sie sich um physische Hindernisse herum orientieren, um ihr Ziel zu erreichen. Daher waren die Ziele dieser Studie erstens, ein System zu entwickeln, in dem das Wachstum von Fibroblasten unter Anleitung physikalischer Barrieren verfolgt werden kann, und zweitens das Wachstum von Fibroblasten auf ihrem Weg durch das System zu modellieren.

Derzeit ist der Boyden-Kammer-Assay das am weitesten verbreitete System zur Messung der Migration von Zellen⁶. Die Boyden-Kammer besteht aus einer Zweikammer-Multi-Well-Platte, in der jede Vertiefung Medium mit oder ohne Chemoattraktoren enthalten kann⁷. Eine Filtermembran bildet eine poröse Grenzfläche zwischen den beiden Kammern in jeder Vertiefung. Dadurch entsteht eine Barriere, die Zellen nicht passieren können, es sei denn, es handelt sich um eine aktive Migration. Typischerweise wird für die Boyden-Kammer ein Chemolockstoff in die untere Kammer gegeben, und das System wird äquilibriert, um einen Gradienten zwischen der oberen und unteren Vertiefung zu bilden⁴. Ein Problem beim Boyden-Kammer-Assay besteht darin, dass sich steile Gradienten entlang einer einzigen Achse senkrecht zur Oberfläche der Membran bilden. Dies führt dazu, dass die Differenz in der Konzentration des Chemolockstoffs zwischen der oberen und der unteren Vertiefung geringer ist als ursprünglich erwartet. Aufgrund dieser Einschränkung ist es mit dem Boyden-Kammer-Assay schwierig, spezifische Zellreaktionen mit bestimmten Gradienteneigenschaften wie der Steigung und dem Konzentrationsunterschied zu korrelieren. Ohne diese Messungen ist es schwierig, die Integration von Multigradienten-Signalen zu untersuchen.

Um einige der Einschränkungen des traditionellen Boyden-Kammer-Assays zu erfüllen, wurden mikrofluidische Assays entwickelt, um anpassbare Konzentrationsgradienten zu bilden¹. Gängige Methoden zur Herstellung mikrofluidischer Systeme erfordern Reinräume für lithographische Techniken. Diese Techniken können schwierig zu erlernen sein, insbesondere in einem normalen Klassenzimmer. So haben wir ein Kammersystem zur Messung der Zellmigration konzipiert, das ohne den Einsatz eines Reinraums durchgeführt werden kann. Mit unserem System können die Wells des Assays auf eine bevorzugte Größe eingestellt werden, und es kann ein linearer Konzentrationsgradient mit kundenspezifischer Steigung erzeugt werden. Dies ermöglicht eine genaue Messung der Chemotaxis aus zufälligen Bewegungen. Das Design ist ein kostengünstiges und einfach zu bedienendes System, um das Zellwachstum als Reaktion auf verschiedene chemische Reize zu modellieren.

Protocol

1. Die Herstellung eines Mikrokanal-Kammer einen Konzentrationsgradienten erstellen

1. Schneiden eines Acrylformteil
   1. Besorgen Sie sich ein Stück Acryl mit der gewünschten Breite. Normalerweise verwenden Sie 1/16-Zoll-dicke Acrylplatten. Dickere Platten sind schwierig, gut und sehr dünne Bleche zu schneiden die erforderliche mechanische Festigkeit nicht haben, so dass sie während des Prozesses zu brechen oder sich verziehen.
   2. Erstellen eines CAD-Datei mit der gewünschten Form des Acrylstück einen Hohlraum innerhalb des Polydimethylsiloxans (PDMS) zu erzeugen. Stellen Sie die Kanalbreite und Länge des gewünschten Gradienten relevant für einzelne experimentelle Protokolle zu erreichen.
      1. Hier verwenden ein Acryl Stück der folgenden Dimensionen: zwei Quadrate (0,254 cm x 0,254 cm) verbunden mit einem 0,127 cm breiten Kanal (0,254 cm lang) (Abbildung 1).
   3. Importieren Sie die CAD-Datei in die Laserschneidvorrichtung und legen Sie die Acryl-Stück in einem Laserschneider nach dem manulers Protokoll.
      HINWEIS: Alternativ 3D-Druck, das Stück aus der CAD-Konstruktion. Der Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass alternative Materialien für die Form verwendet werden kann; kann jedoch die Auflösung und die Reproduzierbarkeit, mit 3D-Druck verringert werden im Vergleich zum Laserschneiden.

Abbildung 1: Computer-Aided Design (CAD) Darstellung von Microchannel- Kammer. Dieses Bild zeigt die CAD-Zeichnung des Acryleinsatz erforderlich, um die Mikrokanalkammer zu erzeugen. 1 A) Draufsicht der CAD - Zeichnung, 1B) Seitenansicht der CAD - Zeichnung mit Abmessungen in Zoll, 1C) Draufsicht einer CAD - Zeichnung mit Abmessungen in Zoll Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.

2. Gießen des Polydimethylsiloxans (PDMS)
   1. In einem Boot wiegen, mischen 10 Gewichtsteile der kommerziellen Elastomerbasis (zB Sylgard 184) mit 1 Gewichtsteil der kommerziellen Elastomer Härters (zB Sylgard 194). Typischerweise wurden 10 g Elastomer Base zu 1 g des Elastomer Härter mischen.
   2. Rühren Sie die Basis und das Härtungsmittel mit einer Mikropipette für 5 min zu kombinieren.
   3. Stellen Sie eine Vakuumglocke nach oben und legen Sie das wiegen Boot mit PDMS im Vakuum 30 min eingeschlossene Luftblasen zu entfernen.
   4. Schalten Sie das Vakuum aus, und entfernen Sie das Boot wiegen. Gießen Sie die PDMS auf der Oberseite des Acryl-Ausschnitt in eine kleine Petrischale. Stellen Sie sicher, dass die PDMS vollständig den Einsatz abdeckt.
   5. Lassen Sie die PDMS über Nacht aushärten (mindestens 18 h) bei Raumtemperatur.
3. Entfernen des Einsatzes aus PDMS
   1. Nach der PDMS-Härtung, entfernen Sie den Einsatz von sorgfältig die PDMS um das Acryl-Stück mit einem Skalpell zu schneiden.

2. Ausplattieren der Zellen in einem Mikrokanal Chamber

1. Sterilisieren der Kammer zum Plattieren von Zellen.
   HINWEIS: Während kann PDMS unter Verwendung von Ethylenoxid oder andere Techniken sterilisiert werden, um eine schnelle UV-Behandlung ist schnell, billig und ausreichend für die Zellkulturstudien. Die kurze UV-Behandlungsdauer beeinträchtigte nicht die Struktur oder die mechanische Integrität des PDMS Stück.
   1. In einer Standard-Zellkulturschrank vollständig bedecken die Kammer mit 70% Ethanol.
   2. Legen Sie die Petrischale in Laminar-Flow-Haube mit den Deckel ab.
   3. Schließen Sie die Haube und schalten Sie das UV-Licht. Expose mit UV-Licht für 1-2 h.
   4. Öffnen Sie die Laminarströmungsabzug und warten Sie 15 min Volumenstrom wiederherzustellen.
   5. Entfernen Sie die 70% Ethanol.
   6. Waschen Sie die Kammern zweimal mit steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Verwenden Sie 1 ml PBS für jede Wäsche. Entfernen PBS und erlauben Kammern über Nacht mit den Deckel ab, um zu trocknen.
      HINWEIS: Alternativ kann statteine Laminarströmungsabzug der Verwendung eines UV-Kammer-Box für die Sterilisation verwendet werden, wenn ein solcher vorhanden ist. Machen Sie eine UV-Box durch eine UV-Lichtquelle in der Rückseite eines Karton ausgekleidet mit Aluminiumfolie platzieren. Die Aluminiumfolie reflektiert das Licht für eine gleichmäßige Ausleuchtung der Probe zu ermöglichen.
2. Plating Cells in Kammer
   1. Zählen von Zellen unter Verwendung von Trypanblau und einer Zählkammer.
      1. Füge 100 & mgr; l der Zellsuspension zu 400 ul von 0,4% Trypanblau und vorsichtig mischen. Anwenden 100 ul dieser Lösung in die Zählkammer durch vorsichtiges beide Kammern unter dem Deckglas gefüllt wird.
      2. Verwenden Sie ein Mikroskop mit einem 10X-Objektiv auf das Gitter auf dem Hämocytometer zu konzentrieren. Verwenden Sie einen Handtallykostenzähler die Live-ungefärbten Zellen innerhalb eines Satzes von 16 Plätzen auf dem Hämocytometer zu zählen.
      3. Zählen von Zellen in allen vier Sätzen von 16 Plätzen. Nehmen Sie die durchschnittliche Zellzahl von den vier Sätzen von 16 Plätzen und multiplizieren mit 5x10 ^4. Diese letzte Zahl ist die number von Zellen / ml in der Zellsuspension.
   2. In 2500 Zellen in eine Vertiefung in jeder Kammer. Dies führt zu einer nahezu konfluenten Zelldichte von ~ 30.000 / cm ^2.
   3. Erlauben Zellen für 60 min in der Kammer zu sitzen, bevor das Hinzufügen Medium (Dulbecco-modifiziertes Eagle-Medium, das 10% fötales Rinderserum, 1% Penicillin-Streptomycin).

3. Dextran Soaked Agaroseblöcken

1. Erstellen eines Agaroseblock
   1. Pour 3% Agarose in das 3D-Druckform (2 mm x 2 mm x 2 mm).
   2. Erlauben die Agarose in einer Vakuumkammer zum Verfestigen für 30 min alle Blasen zu entfernen.
   3. Entfernen Sie die Agarose-Block aus der Form.
      HINWEIS: Alternativ pour 3% Agarose in kleine Petrischale in einer Dicke von 2 mm. Schneiden Sie ein 2 mm x 2 mm x 2 mm Block mit einem Skalpell oder einem anderen Schneidwerkzeug. Das ist nicht so präzise wie die Formsystem, aber es kann ein wenig leichter zu tun.
2. komplett submerge der Agarose-Block in einer Lösung der gewünschten Konzentration des chemotaktischen Faktors. Um die Konzentrationsgradienten Bildung beurteilen, spülen Sie die Kammer zunächst mit fluoreszierenden Dextran. Die Konzentration und Molekulargewicht von Dextran sollte einer löslichen Faktor oder Medikament von Interesse entsprechen.
3. Genießen Sie die Agarose-Block über Nacht.

4. Zeitraffer des Dextran Diffusion der löslichen Faktor Konzentrationsgradienten Beurteilen

1. Legen Sie das Dextran getränkten Agaroseblock in einem kleinen Platz und der Mikrokanalkammer.
2. Setzen Sie den Mikrokanalkammer in einer Zelle-Bildgebungssystem oder verwenden Sie ein anderes Fluoreszenzmikroskop mit einem Zeitraffer-Fähigkeit. Beginnen Sie mit der Zeitraffer gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   HINWEIS: Die angezeigten Ergebnisse sind mit GFP-Filter genommen, 50% Licht, 10.04 pH-Wert und 4-fache Vergrößerung.

5. Zeitraffer des Zellwachstums

1. Platten Zellen in der Mikrokanalkammer an einem Ende derKammer. Hier verwenden 3T3 Fibroblasten. In 2500 Zellen in eine Vertiefung in der Mikrokanalkammer. Zählen von Zellen, wie in 2.2.1 beschrieben.
   1. Erlauben Zellen für 60 min in der Kammer zu sitzen, bevor das Hinzufügen Medium (Dulbecco-modifiziertes Eagle-Medium, das 10% fötales Rinderserum, 1% Penicillin-Streptomycin). Halten der Mikrokanalkammer , die mit plattierten Zellen bei 37 ° C in 5% CO _2. Zellmigration durch den Kanal kann mit einem Mikroskop betrachtet werden.
   2. Fügen Sie einen Marker oder verwenden Sie eine mikroskopische Defekt in der Kammer als Marker, um als Ausgangspunkt dienen der Abstand zwischen der Zelle Front bewegt sich zu quantifizieren.
2. Stellen Sie einen Gradienten durch ein Agarosegel Platzierung (8 mm ³ Block) , die das konzentrierte Wachstumsfaktor, chemo-Lockstoff, Medikament oder einem anderen Faktor getestet an einem Ende des Mikrokanals (hier 40% FBS als Beispiel wird verwendet) Kammer.
3. Nehmen Sie Zeitrafferbilder der sich bewegenden Zelle Front. Hier zeigen die Ergebnisse, Bilder der Zelle front waren, dass alle 12 h unter Verwendung eines Abbildungssystems genommen.
4. Verwenden Sie Bilder der Zelle Front Zellwachstumsrate zu quantifizieren. Berechnen Sie die Wachstumsrate, indem zuerst die MATLAB polyfit Funktion (roipoly) eine polygonale Maske von der Zelle Front, die Kanalwände und der Referenzmarke definiert zu erstellen. Die Abmessungen dieser Maske ergeben die Migrationsdistanz der vorderen, von dem mittleren Zellenfrontgeschwindigkeit berechnet wird. Andere Studien haben eine ähnliche Methode ⁸ verwendet.
   HINWEIS: Vergleichen der Rand des Zellwachstumsfront auf jedem Rahmen zu der Konzentration des löslichen Faktors in derselben Entfernung. Der lösliche Faktor Konzentrationsgradienten ist ein 1D-Diffusionsmodell Näherung berechnet.
5. Nehmen Fluoreszenzbilder der Zellen Phalloidin und DAPI-Färbung verwendet.
   1. Fix-Zellen, bevor sie mit Phalloidin-Färbung.
      1. Warm 4% Paraformaldehyd bei 37 ° C.
      2. Fügen Sie genug 4% Paraformaldehyd Zellen zu decken. Halten der Zellen inParaformaldehyd für 10 min.
      3. Spülen zweimal mit PBS für 15 Minuten jedes Mal. Verwenden Sie genug PBS um die Zellen zu decken.
   2. Entfernen PBS aus Zellen und fügen Sie genug permeabilisierend Lösung (0,1% Triton X-100 in PBS) Zellen zu decken. Lassen Lösung für 10 min.
   3. Zweimal waschen mit PBS für jeweils 5 min. Verwenden Sie genug PBS um die Zellen zu decken.
   4. Entfernen PBS aus Zellen und fügen Lösung (1% Rinderserumalbumin in PBS) für 20 min blockiert.
   5. Entfernen Blockierungslösung und waschen 2-mal mit PBS für jeweils 5 min. Verwenden Sie genug PBS um die Zellen zu decken.
   6. Von diesem Punkt, schützen die Zellen vor Licht mit Aluminiumfolie, wenn sie nicht verwendet werden. Entfernen PBS aus Zellen und fügen Phalloidin 488 1:50 verdünnt in PBS für 1 h.
   7. Waschen Sie 2-mal in PBS für 5 Minuten für jede Wäsche. Verwenden Sie genug PBS um die Zellen zu decken. Dann entfernen PBS aus Zellen.
   8. Hinzufügen DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol), verdünnt 1: 1000 in PBS zu den Zellen für 15 min.
   9. Entfernen Sie DAPI undwaschen Sie die Zellen zweimal mit PBS für 5 Minuten für jede Wäsche.
   10. Entfernen letzten Waschen und fügen Sie genug PBS Zellen zu decken. Zellen können nun mit einem Fluoreszenzmikroskop abgebildet werden.

Results

Figur 2 zeigt die Bewegung der Zellenfront über den Kanal als Reaktion auf einen Gradienten von fötalem Rinderserum am entgegengesetzten Ende des Kanals angeordnet , von dem die Zellen ausplattiert. Die Zellfront wird bei 48 h (2A) gezeigt, 72 h (2B), 96 h (2C) und 120 h (Figur 2D) Post plating. Die Bewegung der Zellenfront wurde mit diesen Zeitraffer-Bildern verfolgt, und die Laufstrecke und die Wachstu...

Discussion

Unsere Mikrokanalkammer kann für eine Vielzahl von Zwecken verwendet werden, einschließlich der Bestimmung der Zellmigrationsrate in Reaktion auf Wachstumsfaktoren und Lockstoffe und Messen der Diffusionsrate eines Arzneimittels aus einer Polymermatrix. Es ist möglich, unsere Mikrokanalkammer zu verwenden, Zellen wachsen zu lassen und einen chemoattractant an einem Ende der Kammer platzieren. Die Zellen wachsen in Reaktion auf die chemische Lockstoffe, und die Zellmigration können, indem sie Zeitrafferbilder quantifizie...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 Silikonelastomer Kit	Sigma-Aldrich	761036	Poly(dimethylsiloxan) 2-teiliges Kit inklusive Silikonelastomerbasis und Silikonelastomer-Härter
Acrylplatten	US Plastic	44200
Einweg-Petrischale	Falke	25373-041
Fluorescein-Isothiocyanat– Dextran	Sigma-Aldrich	FD20s-100MG
Agarose, Typ I, niedriger EEO	Sigma-Aldrich	A6013-100G
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Fisher Scientific	11965092	Zellmedienkomponenten
Fötales Rinderserum	Fisher Scientific	16000036	Zellmedienkomponenten
Penicillin-Streptomycin	Fisher Scientific	15140148	Komponenten für Zellmedien
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Fisher Scientific	BP24384
EVOS XL Cell Imaging System	Thermo Fisher Scientific	AME3300	Instrument zur Aufnahme von Zeitrafferbildern
Versa Laser	Universal Laser Systems, Inc.	Modellnummer VLS2.30	Laserschneider zum Schneiden von Kunststoff