In vitro Differenzierung von humanen pluripotenten Zellen in Trophoblastische Stammzellen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur effizienten Erzeugung menschlicher trophoblastischer Zellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen unter Verwendung des knochenmorphogenen Proteins 4 und Inhibitoren der Activin/Nodal-Signalwege. Diese Methode eignet sich für die effiziente Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen und kann große Mengen an Zellen für die genetische Manipulation erzeugen.

Zusammenfassung

Die Plazenta ist das erste Organ während der Embryogenese zu entwickeln, und ist für das Überleben der sich entwickelnden Embryo erforderlich. Die Plazenta besteht aus verschiedenen trophoblastic Zellen, die von den extraembryonalen Trophektoderm Zellen des preimplantation Blastozyste unterscheiden. Als solches unser Verständnis der frühen Differenzierungsereignisse der menschlichen Plazenta ist begrenzt, weil der ethischen und rechtlichen Beschränkungen für die Isolation und Manipulation der menschlichen Embryonalentwicklung. Menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) sind eine robuste Modellsystem für die Untersuchung der menschlichen Entwicklung und können auch in vitro in trophoblastische Zellen unterschieden werden , die Marker der verschiedenen Trophoblasten - Zelltypen exprimieren. Hier präsentieren wir ein ausführliches Protokoll für hPSCs in Trophoblastzellen mit knochenmorphogenes Protein 4 und Inhibitoren der Activin / Nodal Signalwege zu unterscheiden. Dieses Protokoll erzeugt verschiedene Trophoblastenzelle Typen, die mit siRNAs transfiziert werden könnenzur Untersuchung loss-of-function Phänotypen oder können mit Krankheitserregern infiziert werden. Zusätzlich werden kann hPSCs genetisch modifiziert und dann in Trophoblasten Vorläufern differenziert für gain-of-function Analysen. Diese in vitro Differenzierung Methode menschlichen Trophoblasten zur Erzeugung von hPSCs Ausgangswindet die ethischen und rechtlichen Einschränkungen mit frühen menschlichen Embryonen zu arbeiten, und dieses System kann für eine Vielzahl von Anwendungen eingesetzt werden, einschließlich der Wirkstoffforschung und Stammzellforschung.

Einleitung

Die Plazenta ist für das Wachstum und Überleben des Fötus während der Schwangerschaft erforderlich und erleichtert den Austausch von Gasen, Nährstoffen, Abfallprodukte und Hormone zwischen mütterlichen und fetalen Kreislauf. Das erste Organ während Säugetierembryogenese gebildet ist , der Plazenta, die bei Menschen und 3,5-4,5 Tagen bei Mäusen ^{1, 2, 3, 4} 6-7 Tagen nach der Empfängnis beginnt entwickeln. Trophoblastische Zellen sind die wichtigsten Zellen der Plazenta, und diese Zellen stellen eine der frühesten lineage Differenzierungsereig....

Protokoll

HINWEIS: Für die Differenzierung von hES entweder oder hiPSCs in trophoblast Vorläufern, hPSCs auf embryonale Fibroblasten Maus gezüchtet (MEF) werden nicht umgestellt Zubringer freien Bedingungen für zwei Passagen vor Differenzierung Initiierung mit BMP-4 / A / P. Dieses Verfahren beseitigt die MEF Kontamination von differenzierten Zellen. Hier stellen wir ein Protokoll für HES-Differenzierung, und das gleiche Protokoll kann zu hiPSCs angewendet werden.

1. Kultur und Gewinnung von hES-Zellen auf Bestrahlte embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) (Vorbereitung)

1. Gamma-Bestrahlung von MEFs
   1. Machen 500 ml Medium zur Kultivierung d....

Ergebnisse

Überblick über die in vitro Differenzierung von hPSCs

Diese in vitro Differenzierung Protokoll beginnt mit undifferenzierten hESCs auf MEFs gezüchtet , das umge sind zufuhrfreien Bedingungen für einen Durchgang (1A). Während wir die Differenzierung von hES in diesem Protokoll beschrieben, haben wir dieses Protokoll erfolgreich hiPSCs in trophoblastic Zellen differenzieren. Der Übergang zu extraz.......

Diskussion

Wir präsentierten die grundlegenden Schritte zur hESCs in trophoblast Vorläufern unterscheiden. Dieses Protokoll wurde kürzlich optimiert, um schnell hESCs mit der Zugabe von Activin / Nodal Signalisierungs Inhibitoren unterscheiden, die Differenzierung zu trophoblastische Zellen zu erhöhen und die Erzeugung von Mesoderm Progenitoren vermeiden, die mit BMP4 Behandlung werden in der Regel allein beobachtet. Das BMP-4-Modell-System ermöglicht die Prüfung der frühesten Stadien der menschlichen Trophoblasten Linie Spezifika.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
DMEM/F12	Invitrogen	11330-057
Knock-Out-Serumersatz	Invitrogen	10828-028	Dies wird in diesem Protokoll als "Serumersatz" bezeichnet.
NEAA	Invitrogen	11140-050
FBS	Invitrogen	16000-044
L-Glutamin	Invitrogen	10828-028
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-155
2-Mercaptoethanol	Sigma	M-7522
B-FGF	Millipore	GF-003
DMEM	Invitrogen	11965-118
Dispase	Invitrogen	17105-041
Kollagenase Typ IV	Invitrogen	17104-019
Gesteinsinhibitor Y27632	Calbiochem	688000
Bestrahlte CF1 MEFs	GlobalStem	6001G	MEFs können aus dem embryonalen Tag 13,5 embyos erzeugt und bestrahlt werden.
0,22 &Mikro; m Spritzenvorsatzfilter	Millipore	SLGS033SS
Heracell 150i Inkubator mit niedrigem Sauerstoffgehalt	Heracell/VWR	89187-192	Jeder Gewebekultur-Inkubator mit der Fähigkeit, die Sauerstoffkonzentration zu regulieren, ist ausreichend.
BMP4	R& D Systems	314-BP-01M
A 83-01	F& Technik D Systems	2939/10
PD173074	Forschung und Entwicklung D Systems	3044/10
RNAiMax	Invitrogen	13778150
Trizol	ThermoFisher 15596026		Trizol wird zur Isolierung der Gesamt-RNA verwendet.
X-tremeGENE 9		Roche 6365779001
Matrigel	Corning	356231	Dies wird in diesem Protokoll als "extrazelluläre Matrix" bezeichnet.