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Methodenartikel

In vitro Differenzierung von humanen pluripotenten Zellen in Trophoblastische Stammzellen

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DOI:

10.3791/55268

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16. März 2017

 , 
1Department of Biomedical Sciences, School of Veterinary Medicine, University of Pennsylvania

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur effizienten Erzeugung menschlicher trophoblastischer Zellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen unter Verwendung des knochenmorphogenen Proteins 4 und Inhibitoren der Activin/Nodal-Signalwege. Diese Methode eignet sich für die effiziente Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen und kann große Mengen an Zellen für die genetische Manipulation erzeugen.

Zusammenfassung

Die Plazenta ist das erste Organ während der Embryogenese zu entwickeln, und ist für das Überleben der sich entwickelnden Embryo erforderlich. Die Plazenta besteht aus verschiedenen trophoblastic Zellen, die von den extraembryonalen Trophektoderm Zellen des preimplantation Blastozyste unterscheiden. Als solches unser Verständnis der frühen Differenzierungsereignisse der menschlichen Plazenta ist begrenzt, weil der ethischen und rechtlichen Beschränkungen für die Isolation und Manipulation der menschlichen Embryonalentwicklung. Menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) sind eine robuste Modellsystem für die Untersuchung der menschlichen Entwicklung und können auch in vitro in trophoblastische Zellen unterschieden werden , die Marker der verschiedenen Trophoblasten - Zelltypen exprimieren. Hier präsentieren wir ein ausführliches Protokoll für hPSCs in Trophoblastzellen mit knochenmorphogenes Protein 4 und Inhibitoren der Activin / Nodal Signalwege zu unterscheiden. Dieses Protokoll erzeugt verschiedene Trophoblastenzelle Typen, die mit siRNAs transfiziert werden könnenzur Untersuchung loss-of-function Phänotypen oder können mit Krankheitserregern infiziert werden. Zusätzlich werden kann hPSCs genetisch modifiziert und dann in Trophoblasten Vorläufern differenziert für gain-of-function Analysen. Diese in vitro Differenzierung Methode menschlichen Trophoblasten zur Erzeugung von hPSCs Ausgangswindet die ethischen und rechtlichen Einschränkungen mit frühen menschlichen Embryonen zu arbeiten, und dieses System kann für eine Vielzahl von Anwendungen eingesetzt werden, einschließlich der Wirkstoffforschung und Stammzellforschung.

Einleitung

Die Plazenta ist für das Wachstum und Überleben des Fötus während der Schwangerschaft erforderlich und erleichtert den Austausch von Gasen, Nährstoffen, Abfallprodukte und Hormone zwischen mütterlichen und fetalen Kreislauf. Das erste Organ während Säugetierembryogenese gebildet ist , der Plazenta, die bei Menschen und 3,5-4,5 Tagen bei Mäusen 1, 2, 3, 4 6-7 Tagen nach der Empfängnis beginnt entwickeln. Trophoblastische Zellen sind die wichtigsten Zellen der Plazenta, und diese Zellen stellen eine der frühesten lineage Differenzierungsereignisse des Säugetierembryo. Sie ergeben sich aus den äußeren extraembryonalen Trophektoderm Zellen des preimplantation Blastozyste. Unser Wissen über die frühen Phasen der Entwicklung der Plazenta wird durch ethische und logistische Einschränkungen begrenzt auf frühe menschliche Entwicklung zu modellieren.

Während der embryonalen Implantation Trophoblastendringen in das mütterliche Epithel und unterscheiden sich in spezialisierte Vorläuferzellen 5. Cytotrophoblasten (CTBs) sind einkernigen, undifferenzierten Vorläufern, die in Synzytiotrophoblasten (SYNs) und extravillösen invasive Trophoblasten (EVT), die Anker, die Plazenta in die Gebärmutter verschmelzen und zu differenzieren. SYNs werden, terminal differenzierte Zellen mehrkernige, die Hormone notwendig für die Aufrechterhaltung der Schwangerschaft zu synthetisieren. Die frühe Differenzierung Ereignisse , die EVTs und SYNs erzeugen , sind von wesentlicher Bedeutung für Plazentabildung, wie Beeinträchtigungen in Trophoblastzellen in einer Fehlgeburt führen, Präeklampsie und intrauterine Wachstumsrestriktion 1. Die Typen der humanen Trophoblasten - Zelllinien , die entwickelt wurden , umfassen CTBs und Chorionkarzinome verewigt, die 6 Plazentahormone und Anzeige invasiven Eigenschaften herzustellen. Primäre trophoblastic Zellen aus menschlichen ersten Trimenon Plazenten isoliert werden können, aber die Zellen schnell difzieren und stoppen in vitro vermehren. Wichtig ist , transformiert und primären Zelllinien unterschiedliche Genexpressionsprofile haben, was darauf hinweist , dass tumorerzeugend und trophoblast immortalisierte Zelllinien nicht genau primäre Trophoblasten 7 darstellen. Darüber hinaus sind diese Linien unwahrscheinlich, dass der Plazenta Trophoblasten Stammzellen Vorläufern ähneln, weil sie von einer späteren Phase ersten bis dritten Trimester abgeleitet werden.

Es besteht ein Bedarf für ein robustes in vitro Kultursystem im Frühstadium menschlichen Trophoblasten , um die frühen Ereignisse der Plazentabildung und Funktion zu untersuchen. Menschliche embryonale Stammzellen (hES-Zellen), die Eigenschaften mit der inneren Zellmasse des preimplantation Embryo zu teilen, werden häufig zur Modellierung der frühen menschlichen Entwicklung, einschließlich der Bildung der frühen Plazenta verwendet. Beide menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) und HES - Zellen können in Trophoblasten in vitro differenziert werden unter Verwendung von Knochen Morphogenic Protein 4 (BMP - 4) , 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15. Diese Umwandlung von pluripotenten Zellen zu Trophoblastzellen BMP4 Verwendung ist für menschliche Zellen spezifisch und wird weithin verwendet , um die Entwicklung der frühen menschlichen Plazenta zu studieren , weil sie den Zugang zu frühen menschlichen Embryonen nicht erfordert 9, 16. Kürzlich wurde entdeckt, daß die Zugabe der Inhibitoren A83-01 (A) und PD173074 (P), die die SMAD2 / 3 und MEK1 / 2 Signalwege blockieren, erhöht die Effizienz der Differenzierung in HPSC Trophektoderm artigen Vorläufern, hauptsächlich SYNs und EVTs, ohne die umfangreiche Erzeugung von Mesoderm, Endoderm oder Ektodermzellen 9, 17 . Unter Verwendung dieser Medienbedingungen differenzierte hES für 12 Tage ähnliche Gen - Expression haben Profile als Trophektoderm isolierte Zellen aus menschlichen Blastozysten-Stadium Embryonen und verschiedenen Plazentaspezifische Wachstumshormone absondern, die Unterstützung , die Gültigkeit dieses in vitro Modellsystem 9, 11. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die in vitro Differenzierung von hPSCs in menschliche Trophoblasten - Vorläufern unter Verwendung von BMP4 / A / P Kulturmedium. Diese Bedingungen erzeugen reichlich Anzahlen von Zellen für eine Vielzahl von Anwendungen, einschließlich RNA-Sequenzierung, Genzerstörung verwendet siRNAs, Pathogen-Infektionen und genetischen Modifikation unter Verwendung von Lipofektion-vermittelte Transfektion.

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Protokoll

HINWEIS: Für die Differenzierung von hES entweder oder hiPSCs in trophoblast Vorläufern, hPSCs auf embryonale Fibroblasten Maus gezüchtet (MEF) werden nicht umgestellt Zubringer freien Bedingungen für zwei Passagen vor Differenzierung Initiierung mit BMP-4 / A / P. Dieses Verfahren beseitigt die MEF Kontamination von differenzierten Zellen. Hier stellen wir ein Protokoll für HES-Differenzierung, und das gleiche Protokoll kann zu hiPSCs angewendet werden.

1. Kultur und Gewinnung von hES-Zellen auf Bestrahlte embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) (Vorbereitung)

  1. Gamma-Bestrahlung von MEFs
    1. Machen 500 ml Medium zur Kultivierung der MEFs: DMEM mit 10% FBS, 2 mM L-Glutamin, 1x Penicillin / Streptomycin (Pen / Strep) und 0,1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA).
    2. ein Fläschchen mit primären MEFs auftauen und MEF Medium verwenden für die Kultivierung von Zellen. Erweitern Sie die primären MEFs auf 30 Platten mit MEF Kulturmedium.
      HINWEIS: Sauerstoffkonzentrationen für diesen Schritt nicht kritisch sind, soentweder physiologische (4%) oder Umgebungs (20%) Bedingungen innerhalb des Inkubators verwendet werden.
    3. Ernten Sie die MEFS. Verwenden 0,25% Trypsin die MEFs von den Platten zu entfernen und die Zellen in ein konisches Röhrchen übertragen. Legen Sie die MEFs in einem Bestrahlungsinstrument und setzen die Zellen zu 3500 Graustufen.
      HINWEIS: Die Zeit auf der Aktivität der Quelle innerhalb der Bestrahlungseinheit abhängen.
    4. Resuspendieren der bestrahlten MEFs mit MEF Kulturmedium und zählen die Anzahl der Zellen, die eine Zählkammer.
    5. Pellet die MEF unter Verwendung einer Zentrifuge und 50% MEF Kulturmedium hinzufügen und 50% Zellgefriermedium (80% FBS und 20% MEF Kulturmedium). Aliquot 1 x 10 6 Zellen pro Fläschchen.
    6. Legen Sie die bestrahlten MEF Fläschchen in einem -80 ° C Gefrierschrank über Nacht, und übertragen sie dann in flüssigen Stickstoff für die Langzeitlagerung.
  2. Auftauen gefrorenen MEFs und hESCs für Kultur
    1. Machen Sie 500 ml hES-Medium: DMEM / F-12 mit 20% Serum Replacement, 0,1 mM NEAA, 2 mM L-Glutamin, 10 ng / ml bFGF, 0,1 mM ß-Mercaptoethanol und 1x Pen / Strep.
    2. ein Fläschchen von MEFs 1 Tag auftauen, bevor Sie die hESCs Auftauen. Mantel eine Platte mit 6 Vertiefungen mit 0,1% Gelatine, unter Verwendung von 1 ml für jede Vertiefung. mindestens 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und anschließend die Gelatine zu entfernen.
    3. Entfernen Sie ein Fläschchen mit MEF aus Lagerung in flüssigem Stickstoff und tauchen Sie die Fläschchen in einem 37 ° C Wasserbad. Sehen Sie sich das Fläschchen mit Unterbrechungen, bis nur noch kleine Eiskristalle bleiben. Schnell wird der Inhalt des Fläschchens zu 9 ml MEF Medium in einem 15 ml konischen Röhrchen.
    4. Pelletieren Sie die Zellen bei 200 · g für 5 min zentrifugiert. Den Überstand aspirieren und resuspendieren in MEF Medium, welches das Zellpellet. Aliquot der MEF gleichmäßig auf eine 6-Well-Platte. Legen Sie die Platte in eine 37 ° C mit wenig Sauerstoff (4%) Inkubator über Nacht.
  3. Routine Kultur von hES auf MEFs
    1. Entfernen eines hESC Fläschchen aus flüssigem Stickstoff und schnell das Fläschchen tauen unter Verwendung eines 37 ° C Wasserbad. Pipette vorsichtig die hES in einen 15 ml konischen Röhrchen 9 ml hES-Medium mit und Spin bei 200 xg für 5 min nach unten. Entfernen Sie das Medium und Resuspendieren der Zellen mit 1 ml hES-Medium.
    2. Saugen Sie das MEF Medium aus der in Schritt hergestellten Platte 1.2.4 und 1 ml hES-Medium. In Rock-Inhibitor Y-27632 (10 & mgr; M) an die hESC Medium. Übertragen Sie die hESCs auf MEFs.
    3. Legen Sie die Zellen in eine 37 ° C mit wenig Sauerstoff (4%) Inkubator über Nacht. Ersetzen Sie die hESC Medium täglich. Abkratzen differenzierten Zellen mit einer Pasteurpipette unter einem aufrechten Mikroskop mit 4x sichtbar gemacht.
    4. Passage die hESCs alle 4-6 Tage, abhängig von der Zelle Konfluenz und der Größe der HES Kolonien. Bereiten Sie eine Platte von MEFs am Tag vor Passagierung. Wenn die Zellen bereit Passage sind, entfernen Sie die hESC Medium und waschen Sie die Vertiefung mit 1 ml PBS.
    5. 1 mg / ml Kollagenase (vorgewärmt auf 37 ° C), bei 37 ° C für 5 Minuten, und entfernen Sie die Kollagenase. WAsche, die Zellen mit PBS, 1 ml hES-Medium pro Vertiefung, und kratzen Sie manuell die Zellen in kleine Klumpen die Spitze einer 5 ml Pipette. Übertragen Sie die suspendierten Zellklumpen in eine neue MEF-beschichtete Vertiefung (en).

2. Übergang von hES von MEFs auf Feeder freien Bedingungen auf Extrazellulärmatrix beschichteten Platten

  1. Bereiten Sie MEF - konditioniertem Medium (CM)
    1. Platte, die die bestrahlten MEFs in einem T75-Kolben bei 90-100% Konfluenz; es ist wichtig, dass die MEFs dicht überzogen werden. Beachten Sie die Zellen mit einem Mikroskop, um festzustellen, ob sie mit dem Boden des Kolbens befestigt sind (MEFs befestigen etwa 6 Stunden nach der Plattierung oder am nächsten Tag).
      HINWEIS: Unattached Zellen in dem Medium schwimmen, wenn mit einem Mikroskop beobachtet. Am nächsten Tag, entfernen MEF Medium und 25 ml hESC Medium ohne B-FGF.
    2. Sammeln Sie das konditionierte Medium nach 24 Stunden Inkubation. Ersetzen mit frischem Medium täglich für maximal 12 Tage.
    3. Filtern des gesammelten CM unter Verwendung eines 0,22 um-Filter. Vor der Verwendung frischer B-FGF zum CM hinzuzufügen.
      HINWEIS: CM kann für bis zu 1 Jahr bei -80 ° C aufbewahrt und eingefroren werden. Alternativ speichern Sie die CM bei 4 ° C für 2 Wochen.
  2. Der Übergang der hES von Kultur auf den MEFs auf Feeder-freie extrazelluläre Matrix beschichteten Platten.
    1. Herstellung der extrazellulären Matrix für die Beschichtung von Gewebekulturplatten
      1. Tauen Sie eine aliquote Menge von extrazellulären Matrix auf Eis (ca. 3-4 h). Mit eiskalter Tipps, ein kaltes, 50 ml konischen Röhrchen und DMEM / F12-Medium, Transfer 2 mg der extrazellulären Matrix in 24 ml eiskaltem DMEM / F-12 (hängt die Verdünnung auf die extrazelluläre Matrix Konzentration vom Lieferanten ).
      2. Unmittelbar übertragen die 50 ml konischen Röhrchen auf Eis und lagern bei 4 ° C. Für die Beschichtung von Gewebekulturplatten, fügen Sie die entsprechende Menge an verdünnten extrazellulären Matrix auf die gut (zB 1 ml pro Vertiefung in einer 6-Well - Platte). Swirl zur Beschichtung der Platte und Inkubation bei Raumtemperatur für mindestens 1 Stunde.
    2. Passage hESCs von den MEFs (wie in Schritt 1.3) unter Verwendung von CM-FGF enthält, B (10 ng / ml).
      1. Aspirieren die extrazelluläre Matrix aus der neuen Platte zu entfernen und fügen Sie CM B-FGF enthält. Übertragen Sie die geschabt Zellklumpen aus dem MEF Platte mit einer Pipette und Aliquotierung es in die extrazelluläre Matrix-beschichtete Platte. Inkubieren in der 37 ° C mit niedrigem Sauerstoff Inkubator über Nacht.
      2. Ersetzen Sie das CM mit B-FGF Medium täglich; die Menge des Mediums auf der Größe des Kulturflasche ab. Verwenden Sie 2 ml Medium für eine 6-well gut. Abkratzen differenzierten Zellen mit einer Pasteur-Pipette.
      3. Passage hESCs alle 6-7 Tage, wenn Kolonien hell sind, wenn sie unter dem Mikroskop betrachtet.
        HINWEIS: hESC Kolonien auf der extrazellulären Matrix beschichteten Platten gewachsen wachsen größer als MEF-kultivierten Zellen.
      4. Wenn der Feeder-freien Zellen der Passage fertig sind, entfernen Sie das Medium, waschen von adding 1 ml PBS mit einer Pipette, absaugen mit der PBS zu entfernen, mit 0,5 mg / ml Dispase (vorgewärmt auf 37 ° C) mit einer Pipette, und 5 min bei 37 ° C inkubieren.
      5. Waschen der Zellen mit PBS durch Zugabe von 2 ml PBS pro Vertiefung und Aspirieren danach. 1 ml CM pro Vertiefung und kratzen manuell die Zellen in kleine Klumpen die Spitze einer 5 ml Pipette.
      6. Platte um die suspendierten Zellklumpen in neue extrazelluläre Matrix beschichteten Platten; Die Zellen sollten nach 24 Stunden einzuhalten.

3. Differenzierung von hES Mit BMP4 / A / P

  1. Bereiten Sie das Differenzierungsmedium. Verwenden CM (fehlende B-FGF) und fügen Sie (frisch) BMP4 (50 ng / ml), A83-01 (1 & mgr; M) und PD173074 (0,1 uM). Fügen Sie diese Inhibitoren an das CM vor dem Gebrauch.
  2. Verwenden Feeder freie hESCs wächst auf der extrazellulären Matrix beschichteten Platten für 1 Passage, kultiviert innerhalb einem Inkubator bei 4% Sauerstoff eingestellt. Nach dem ersten Durchgang auf der extrazellulären Matrix beschichteten Platten,lassen sich die Zellen für 24 Stunden befestigen. Am nächsten Tag initiieren Differenzierung. Entfernen Sie die CM (mit B-FGF) und ersetzen Sie es mit CM enthält, BMP-4 / A / P (2 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte). Weiter Kultivierung der Zellen unter Verwendung von 4% Sauerstoffgehalt.
  3. Ersetzen Sie das CM enthält, BMP-4 / A / P (2 ml / Vertiefung für eine 6-Well-Platte) alle 2 Tage. Absaugen das alte Medium zu entfernen und neue CM mit einer Pipette hinzu. Am zweiten Tag nach BMP-4 und Entfernen von B-FGF (als Differenzierung Tag 2) Zugabe wird die Morphologie der Zellen zu ändern, erscheinen größer, wenn mit einem Mikroskop beobachtet.
    HINWEIS: undifferenzierte Zellen, die helle runde Kanten aufweisen, die nicht vorhanden sein wird.
  4. Sammeln Zellen zu gewünschten Zeitpunkten. Differenzierte Zellen stoppt nach etwa 2 Wochen zu teilen. Transfizieren Zellen während dieser Zeit (siehe nächster Abschnitt).

4. Transfektion von Trophoblastzellen mit siRNAs oder Plasmid-DNA

  1. Bereiten Sie trophoblastic Zellen für die Transfektion
    1. Kultur hESCs für zwei Durchgänge auf der extrazellulären Matrix, nachdem sie von den MEFs übertragen (siehe Schritt 2.2). Verwenden Sie hES-Medium, das B-FGF.
    2. Teilen Sie die hESCs auf eine neue extrazelluläre Matrixplatte einen Tag vor der Differenzierung. Hohe zelluläre Konfluenz ist wichtig, aufgeteilt, so dass die Zellen 1: 1 auf eine neue Platte / Vertiefung, die mindestens 50% Konfluenz am nächsten Tag gewährleistet. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht in der sauerstoffarmen Inkubator.
      HINWEIS: hESCs müssen nicht bei diesem Schritt gezählt werden.
    3. Am nächsten Tag, ersetzen Sie das Medium mit dem Differenzierungsmedium (CM enthält, BMP-4 / A / P und ohne B-FGF, unter Verwendung von 2 ml / Vertiefung für eine 6-Well-Platte). Entfernen Sie das alte Medium durch Absaugen und übertragen das neue Medium (2 ml) mit einer Pipette. Platzieren Sie die Zellen in einer sauerstoffarmen Inkubator (4% Sauerstoff) über Nacht.
  2. Transfektionen siRNAs mit für Genin oder unter Verwendung von Plasmid - DNA
    1. Differenzieren der Zellen, bis die gewünschte ZeitPunkt (zwischen den Tagen 1 und 14). Am Tag vor der Transfektion trypsinize die Zellen 0,05% Trypsin für 5 min mit. Platte an die gewünschte Konfluenz (je nach Transfektionsreagenz protocol) auf einen mit Gelatine beschichteten Platte (mit 0,1% Gelatine auf eine Gewebekulturplatte für 20 min und aspirieren zu entfernen). In CM enthält, BMP-4 / A / P (fehlende B-FGF) und über Nacht inkubiert.
    2. Am nächsten Tag, fügen Sie frische Differenzierungsmedium zu den Zellen. Transfektion von siRNAs eine siRNA Transfektionsreagenz verwenden. Für Plasmid-DNA, verwenden Sie ein geeignetes Lipofectamin Reagenz.
    3. Folgen Sie dem Produkt-Protokoll wie für jede Transfektionsreagenz beschrieben. Übertragen Sie die siRNA-Lipofectamin-Komplexe in jede Vertiefung / Platte von Zellen, vorsichtig mischen und Kultur die Zellen über Nacht in einer sauerstoffarmen Inkubator.
      HINWEIS: Einige Transfektionsreagentien durch Antibiotika gehemmt werden, die CM erfordern Pen / Strep fehlt.
    4. Am nächsten Tag, ersetzen mit frischen Differenzierung Medien.
    5. Ernten Sie die Zellen auf den Wunschd Zeitpunkten (zB 24 h, 48 h und 72 h) , um die Genin Effizienz mittels quantitativer RT-PCR zu überprüfen. Zum Ernten von Zellen verwenden 0,05% Trypsin, Zugabe von 1 ml pro Vertiefung und Inkubation für 5 min bei 37 ° C. 5 ml MEF Medium pro Vertiefung um das Trypsin zu neutralisieren. Spin down die Zellen bei 200 xg für 5 min und verwenden Sie das Zellpellet zur RNA-Isolierung.

5. Pathogen-Infektion von Trophoblastzellen: Sendai-Virus-Infektion

  1. Bereiten Sie hESCs zur Differenzierung
    1. Kultur hESCs für zwei Durchgänge auf der extrazellulären Matrix nach der Übertragung von der MEF (siehe Schritt 2.2). Verwenden Sie hES-Medium, das B-FGF.
    2. Teilen Sie die hESCs auf eine neue extrazelluläre Matrixplatte einen Tag vor der Differenzierung. Hohe zelluläre Konfluenz ist wichtig, so geteilte Zellen 1: 1 auf eine neue Platte / Vertiefung, die mindestens 50% Konfluenz am nächsten Tag gewährleistet. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht in einer sauerstoffarmen Inkubator (4% Sauerstoff).
      Hinweis: hESCs müssen nicht bei diesem Schritt gezählt werden.
    3. Am nächsten Tag, ersetzen Sie das Medium mit dem Differenzierungsmedium (CM enthält, BMP-4 / A / P und ohne B-FGF) und Kultur über Nacht in einer sauerstoffarmen Inkubator (4% Sauerstoff).
  2. Sendai Virus-Infektion von Trophoblastzellen
    1. Einen Tag vor der Differenzierung Tag gewünscht, trypsinize die differenzierenden Zellen (auf einzelne Zellen) unter Verwendung von 0,05% Trypsin für 5 min und übertragen sie auf eine mit Gelatine beschichtete Platte. In Differenzierungsmedium und Inkubation über Nacht in einer sauerstoffarmen Inkubator.
    2. Am nächsten Tag hinzuzufügen Medium für Infektion (das auf dem Virus variieren je). Verwenden CM fehlt Pen / Strep enthält, BMP-4 / A / P, unter Verwendung von 0,5 ml für eine Vertiefung einer 6-Well-Platte. In Sendai-Virus für MOI 1. Inkubation für 8 h in einer sauerstoffarmen Inkubator =.
    3. Wenn zusätzliche Zeit-Punkte notwendig sind, entfernen Sie das Virus enthaltenden Mediums nach 4 h und ersetzen Sie es mit BMP-4 / A / P CM. Sammeln Zellenfür die RNA-Isolierung mit einem Zellschaber.
    4. Bestimmen Sie die Effizienz der viralen Infektion , indem qRT-PCR für Gene , die in der viralen Reaktion beteiligt 18.

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Ergebnisse

Überblick über die in vitro Differenzierung von hPSCs

Diese in vitro Differenzierung Protokoll beginnt mit undifferenzierten hESCs auf MEFs gezüchtet , das umge sind zufuhrfreien Bedingungen für einen Durchgang (1A). Während wir die Differenzierung von hES in diesem Protokoll beschrieben, haben wir dieses Protokoll erfolgreich hiPSCs in trophoblastic Zellen differenzieren. Der Übergang zu extraz...

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Diskussion

Wir präsentierten die grundlegenden Schritte zur hESCs in trophoblast Vorläufern unterscheiden. Dieses Protokoll wurde kürzlich optimiert, um schnell hESCs mit der Zugabe von Activin / Nodal Signalisierungs Inhibitoren unterscheiden, die Differenzierung zu trophoblastische Zellen zu erhöhen und die Erzeugung von Mesoderm Progenitoren vermeiden, die mit BMP4 Behandlung werden in der Regel allein beobachtet. Das BMP-4-Modell-System ermöglicht die Prüfung der frühesten Stadien der menschlichen Trophoblasten Linie Spezifika...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von einem Pennsylvania Health Research Formula Fund unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
DMEM/F12Invitrogen11330-057
Knock-Out-SerumersatzInvitrogen10828-028Dies wird in diesem Protokoll als "Serumersatz" bezeichnet.
NEAAInvitrogen11140-050
FBSInvitrogen16000-044
L-GlutaminInvitrogen10828-028
Penicillin/StreptomycinInvitrogen15140-155
2-MercaptoethanolSigmaM-7522
B-FGFMilliporeGF-003
DMEMInvitrogen11965-118
DispaseInvitrogen17105-041
Kollagenase Typ IVInvitrogen17104-019
Gesteinsinhibitor Y27632Calbiochem688000
Bestrahlte CF1 MEFsGlobalStem6001GMEFs können aus dem embryonalen Tag 13,5 embyos erzeugt und bestrahlt werden.
0,22 &Mikro; m SpritzenvorsatzfilterMilliporeSLGS033SS
Heracell 150i Inkubator mit niedrigem SauerstoffgehaltHeracell/VWR89187-192Jeder Gewebekultur-Inkubator mit der Fähigkeit, die Sauerstoffkonzentration zu regulieren, ist ausreichend.
BMP4R& D Systems314-BP-01M
A 83-01F& Technik D Systems2939/10
PD173074Forschung und Entwicklung D Systems3044/10
RNAiMaxInvitrogen13778150
TrizolThermoFisher 15596026Trizol wird zur Isolierung der Gesamt-RNA verwendet.
X-tremeGENE 9Roche 6365779001
MatrigelCorning356231Dies wird in diesem Protokoll als "extrazelluläre Matrix" bezeichnet.

Referenzen

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