Methodenartikel

Ein umfassendes Verfahren zur Bewertung der In Vivo Performance von Krebs Nanomedizin

DOI:

10.3791/55271

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4. März 2017

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1Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 2Translational and Molecular Imaging Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Das schlechte Verständnis der In-vivo-Leistung von Nanomedikamenten behindert ihre klinische Umsetzung. Verfahren zur Bewertung des in vivo-Verhaltens von Krebs-Nanoarzneimitteln auf systemischer, Gewebe-, Einzelzell- und subzellulärer Ebene bei tumortragenden immunkompetenten Mäusen werden hier beschrieben. Dieser Ansatz kann Forschern helfen, vielversprechende Krebs-Nanomedikamente für die klinische Umsetzung zu identifizieren.

Zusammenfassung

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Inspiriert durch den Erfolg der bisherigen Krebsnanomedizin in der Klinik haben die Forscher eine große Anzahl von neuen Formulierungen in den letzten zehn Jahren generiert. Jedoch nur eine geringe Anzahl von Nanomedizin wurden für die klinische Verwendung zugelassen, während die Mehrzahl der Nanomedizin in der klinischen Entwicklung enttäuschenden Ergebnissen geführt haben. Ein wesentliches Hindernis für die erfolgreiche klinische Übersetzung des neuen Krebsnanomedizin ist der Mangel an einem genauen Verständnis ihrer in vivo Leistung. Dieser Artikel enthält ein rigoroses Verfahren das in vivo Verhalten der Nanomedizin in tumortragenden Mäusen bei einer systemischen, Gewebe, single-cell und subzellulären Ebenen über die Integration der Positronen - Emissions - Tomographie-Computertomographie (PET-CT), Radioaktivität Quantifizierungsverfahren zur Charakterisierung fließen, Zytometrie und Fluoreszenzmikroskopie. Mit diesem Ansatz können die Forscher auswerten genau neuartigen nanoskaligen Formulierungen in relevanten Mausmodellen der cancer. Diese Protokolle können die Fähigkeit haben, die vielversprechendsten Krebs Nanomedizin mit hohem translationalen Potenzial zu identifizieren oder bei der Optimierung von Krebs Nanomedizin für die zukünftige Übersetzung zu helfen.

Einleitung

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Nano verschiebt sich das Paradigma der Krebsbehandlung Entwicklung 1. Inspiriert durch die enorme klinische Auswirkungen früherer Krebs Nanomedizin, wie liposome- und Albumin-basierte nanotherapies 2, 3, haben viele neue Formulierungen wurden in den letzten zehn Jahren hergestellt. Jüngsten Analysen der klinischen Übersetzungs Erfolg dieser Krebsnanomedizin zeigen jedoch, dass nur einige von ihnen sind für die klinische Anwendung 4, 5 zugelassen. Ein großes Hindernis für die klinische Umsetzung von neuen Krebsnanomedizin ist ihre begrenzte Verbesserung des therapeutischen Index im Vergleich mit der direkten Verwaltung der freien therapeutischen Verbindungen 6. Als solche genaue Auswertung der in vivo - Leistung Nanomedizin bei systemischer, Gewebe und zellulärer Ebene in vorklinischen Tiermodellen ist wesentlich für identifdiejenigen y mit optimalen therapeutischen Indizes für zukünftige klinische Übersetzung.

Nanomaterialien können in lebenden Tieren , die mit der Positronen - Emissions - Tomographie (PET) Bildgebung für die quantitative Charakterisierung radioaktiv markiert werden, die 7 hervorragende Sensitivität und Reproduzierbarkeit bei allen klinischen Bildgebungsverfahren hat. Zum Beispiel 89 Zr-markierte lange Zirkulationsnanomedizin haben in Mausmodellen für Krebs 8, 9, 10, wie auch in anderen Krankheitsmodellen 11 charakterisiert. Darüber hinaus kann der Bluthalbwertszeit und biologische Verteilung der Nanomedizin extensiv durch Verwendung ex vivo Messungen der Radioaktivität in einzelnen Geweben 8 ausgewertet werden. Daher ermöglicht die radioaktive Markierung für die quantitative Bewertung von Nanomedizin bei einer systemischen und Gewebespiegel.

Wichtig ist, dass radiolabeled Nanomedizin allgemein kann nicht auf Einzelzell oder subzellulären Ebenen aufgrund der begrenzten räumlichen Auflösung des radioaktiven Signals analysiert werden. Daher Fluoreszenzmarkierung erweist sich für die Beurteilung von Nanopartikeln mit optischen Abbildungstechniken wie Durchflußzytometrie und Fluoreszenzmikroskopie 12 eine komplementäre Modalität sein. Zu diesem Zweck markiert Nanopartikel mit Radioisotopen und Fluoreszenzmarkierungen kann quantitativ in vivo durch nukleare Bildgebung ausgewertet werden und ex vivo durch Radioaktivität Zählen, und sie können auch ausgiebig auf zellulärer Ebene durch die optische Abbildungs charakterisiert werden.

Zuvor haben wir modular Verfahren entwickelt radioaktive und fluoreszierende Markierungen in verschiedene Nanopartikel einzuarbeiten, einschließlich High-Density - Lipoprotein (HDL) 11, Liposome 9, 10, polymere Nanopartikel, Antikörperfragmente und nanoemulsions 10, 13. Diese markierten Nanopartikel wurden zur quantitativen Charakterisierung in relevanten Tiermodellen auf verschiedenen Ebenen erlaubt, die die Optimierung dieser Nanomaterialien für ihre spezifischen Anwendungen geführt. In der aktuellen Studie ist es das Ziel 14 liposomalen Nanopartikel-die meisten etablierten Nano Plattform -wie ein Beispiel zu verwenden , umfassende Verfahren zu demonstrieren , einen Dual-markierte Nanopartikel zu erzeugen , und um es gründlich zu charakterisieren in einem klassischen syngenen Melanom B16-F10 - Maus - Modell 15 . Aus den Ergebnissen können wir diese Nanopartikel Charakterisierung Ansatz überzeugt, angepasst werden kann andere Krebsnanomedizin in relevanten Mausmodellen zu bewerten.

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Protokoll

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Das Verfahren besteht aus dem Dual - radioaktive und fluoreszierende Markierung von Nanopartikeln in vivo PET-CT - Bildgebung, ex vivo Bioverteilung Messungen und ex vivo - Immunfärbung und Durchflusszytometrie analysiert. Alle Tierversuche wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee von Memorial Sloan Kettering Cancer Center genehmigt.

1. Herstellung von zweifach markierten Liposome

HINWEIS: Syngene B16 Melanomtumoren kann durch Einspritzen von 300.000 B16-F10-Zellen in den hinteren Flanken von C57BL / 6-Mäusen unter Narkose durch das Einatmen von 2% -Isofluran haltigen Sauerstoff induziert werden. Verwenden Sie sterile Reagenzien und Werkzeuge in einem sterilen Arbeitsbereich während der Operation. Nach der Operation sorgfältig beobachten die Tiere bis zu ihrem Erwachen aus der Narkose. Setzen Sie die Tiere wieder in ihren Käfigen nur dann, wenn sie die volle Bewusstsein und Mobilität wiederzuerlangen. Haus sie in sterilen Räumen für Tiere mit xenografted Tumoren. Tumoren mit einer Größevon 300 mm sind 3 für Nanopartikel - Charakterisierung ideal aufgrund ihrer ausgeprägten erhöhte Permeabilität und Retention Effekte (EPR), die Nanopartikel - Akkumulation zu erhöhen. Die detaillierten Protokolle sind unten angegeben.

  1. In einem Rundkolben wurde ein Gemisch aus 20 mg der Lipide in 2 ml Chloroform , enthaltend 1,2-Dipalmitoyl- sn - glycero-3-phophocholine (DPPC) auflösen, Cholesterol, 1,2-sn - glycero disearoyl- 3-phosphoethanolamin-poly (ethylenglykol) 2000 (DSPE-PEG2000), DSPE-Deferoxamin (DFO-DSPE) 8, und 1,1-diododecyl-3,3,3,3-tetramethylindodicarbocyanine-5,5-disulfonsäure ( DiIC12 [5] -DS) bei molaren Verhältnissen von 61,3%, 33,4%, 5, 0,2% und 0,1% betragen.
    ANMERKUNG: Diese Lipidzusammensetzung ist sehr ähnlich zu der liposomalen Formulierung von Doxorubicin verwendet wird derzeit in der Klinik 2. Die resultierenden Liposomen aus unserem Verfahren wird eng imitieren die in vivo - Wirksamkeit der klinischen nanomedicine.
  2. Verwenden eines Rotationsverdampfers das organische Lösungsmittel zu entfernen und eine dünne Lipidfilm bei Raumtemperatur bilden. 20 ml PBS und beschallen für 30 min zur liposomalen Nanoteilchen erzeugen, indem ein 3,8-mm Beschallungsspitze und einer Amplitude von 30 W verwendet, wobei eine ausreichende Kühlung auf Eis.
  3. Zentrifugieren Sie die Liposom-Lösung bei 4.000 × g für 10 min die Aggregate zu entfernen und zu waschen, die Nanopartikel mit PBS unter Verwendung von Zentrifugenfiltration (Molekulargewicht cut-off (MWCO:. 100 kDa) freie Lipide und restliche organische Lösungsmittel zu entfernen, konzentrieren sich die Liposomen, die wird bleiben in der oberen Kammer, und übertragen sie in ein neues Röhrchen. die Liposome können, bevor die nachfolgenden Schritte für bis zu 1 Woche in PBS in einem Kühlschrank gelagert werden.
  4. Für die Qualitätskontrolle, charakterisieren die Liposomen durch dynamische Lichtstreuung (DLS). Genauer gesagt, mit 950 & mgr; l PBS, 50 & mgr; l Liposomen mischen und dann die Mischung in die Schlichte Küvette übertragen. Setzen Sie die Küvette in den Analysator und messen den PartikelGrößen und deren Größenverteilung. Die Teilchengrößen und deren Größenverteilung (Polydispersitätsindex (PDI)) erwartet 90 zu sein - jeweils 0,2, - 120 nm und 0,1.
  5. Zur radioaktiven Markierung, mischen die gereinigten Liposomen, entsprechend 2 mg von Lipiden, in PBS bei einem pH - Wert zwischen 6,9 und 7,1 mit 1 mCi 89 Zr-Oxalat bei 37 ° C für 2 h in einem 1,5-ml - Röhrchen, (Gesamtvolumen: ~ 100 & mgr; l). Entfernen Sie die freie, nicht umgesetzten 89 Zr durch Zentrifugenfiltration (MWCO = 100 kDa), ähnlich zu Schritt 1.3 umgesetzt. Waschen des Retentats mit sterilem PBS und verdünne sie auf das gewünschte Volumen. 95% - Die radiochemische Ausbeute sollte 80 sein.
    VORSICHT! Arbeiten mit radioaktiven Stoffen ist stark reguliert. Die Institute müssen die notwendigen Einrichtungen, Personal Training zertifiziert und bieten werden, und eine strenge Überwachung der Radioaktivität Einsatz. Forscher müssen eine angemessene Ausbildung zu erhalten und persönliche Schutzausrüstung und Dosimetrie Ringe / Abzeichen tragen, wenn die Radioaktivität der Handhabung.
    6. , um die radiochemische Reinheit der radiomarkierten Liposomen durch Grßenausschluß-HPLC Radio, die typischerweise mehr als 98% betragen sollte 10. Die radiochemische Reinheiten von weniger als 95% weisen auf unzureichendes Waschen auf Schritt 1.5.
  6. Nach radioaktiven Markierung, um die Größe der Nanopartikel durch dynamische Lichtstreuung bestimmen. Die Größe und die PDI werden voraussichtlich innerhalb der gleichen Größenordnung wie die Messungen in Schritt 1.4 10 zu sein.
    HINWEIS: Wenn radioaktive Proben nicht im Flow Cytometer erlaubt oder Fluoreszenzmikroskop, nicht-radioaktive nat Zr-Oxalat verwendet werden können Liposomen in Schritt 1.5 zu etikettieren. Diese nicht-radioaktiven Liposome haben identische Eigenschaften ihrer radioaktiven Analoga. Eine Beschreibung dieses Verfahrens ist in Figur 2 zur Verfügung gestellt.

2. In - vivo - PET-CT Bildgebung und Biodistribution Dual-markierten Liposome

  1. Injizieren etwa 100 & mgr; l doppelt markierte Liposomen with etwa 300 & mgr; Ci von Radioaktivität in gezügelt Melanom - Mäuse (C57BL / 6, weiblich, 10 - 16 Wochen alt) durch ihre Schwanzvenen, bei etwa 10 mCi 89 Zr / kg Körpergewicht.
  2. Um die Halbwertszeit bestimmen, ziehen Blut aus der Schwanzvene von narkotisierten Tieren unter 2% Isofluran-Sauerstoff enthält, unter Verwendung von 28-G Insulinspritzen. Sammeln Blut (10 bis 20 & mgr; l) in vorgewogenen Röhrchen bei 2 min, 15 min, 1 h, 4 h, 8 h, 24 h und 48 h nach der Injektion. Wiegen Sie das Blut durch den Unterschied bestimmen Radioaktivität Inhalt eines Gammazählers verwendet, und berechnen die Radioaktivität Konzentration als Prozentsatz der injizierten Dosis pro Gramm (% ID / g).
    HINWEIS: Führen Sie das Verfahren in einem Raum mit einem Anästhesiesystem ausgestattet, Erholungskäfigen, eine Heizung und ein Biohazard Kapuze. Stellen Sie sicher, dass die Tiere vollständig zu erholen und normale Beweglichkeit nach dem Verfahren gewinnen, bevor sie von Erholungskäfigen zu halten Käfige zu übertragen. Haus der tumortragenden Tiere in Räumen für Tiere bezeichnet, verabreicht mitradioaktive Materialien.
  3. 24 oder 48 h nach der Injektion des Liposomen, Bild die Mäuse in einem Kleintier - microPET-CT - Scanner 10. Platzieren Sie den narkotisierten Tier horizontal auf dem Bauch und halten Sie sie narkotisiert. Verwalten 2% Isofluran-Sauerstoff durch einen Nasenkegel. Bewerben Augensalbe auf seine Augen vor dem Scan zu verhindern, dass sie vor dem Austrocknen.
  4. Führen Sie eine Ganzkörper-PET statischen Scan-Aufnahme mindestens 50 Millionen übereinstimmend Ereignisse, mit einer Dauer von etwa 15 min. Stellen Sie die Energie und Koinzidenzzeitfenster bei 350-700 keV und 6 ns sind. Danach führen Sie eine 5-min-Computertomographie (CT). Stellen Sie die Röntgenröhre mit einer Spannung von 80 kV und einem Strom von 500 uA; die CT - Abtastung verwendet 120 Rotationsschritte für insgesamt 220 Grad, mit ca. 145 ms pro Rahmen 10.
  5. Nach dem PET-CT-Scan, opfern sofort die Mäuse durch Ersticken mit Kohlendioxid und bestätigen den Tod von pinching die Pfoten der Tiere. Sobald zervikalen Versetzungen bestätigt, führen.
  6. Entfernen Sie die Blut in Geweben der Maus durch das erste offene rechte Atrium Schneiden und dann Einspritzen von 20 ml PBS in den linken Ventrikel und anschließend die relevanten Geweben sammeln wie Tumor, Leber, Milz, Lunge, Niere, Muskel und andere 16.
  7. Wiegen Sie das Gewebe messen ihre Radioaktivität Gehalt durch Gammazählung 8, 9, und berechnen die Radioaktivität Gewebeakkumulation als Prozentsatz der injizierten Dosis pro g (% ID / g).

3. Ex - vivo - Durchflusszytometrie und Immunostaining

HINWEIS: Injizieren etwa 100 & mgr; l von fluoreszierenden Liposomen in Melanom-Mäuse durch ihre Schwanzvene in einer Dosis von 0,5 mg Farbstoff pro kg Körpergewicht. Wenn radioaktive Proben werden in dem Durchflusszytometer und Fluoreszenzmikroskop nicht erlaubt, nicht radioaktiven Liposome verwendet werden.

  1. Opfern, um die Mäuse 24 Stunden nach der Injektion, wie in Schritt 2.5, und sammeln die Tumoren, die in kaltem PBS gelagert werden müssen.
  2. Für die Durchflusszytometrie folgendermaßen vor 17:
    1. Vorbereiten eines Enzymcocktail aus einer Mischung von gereinigtem Kollagenase I besteht, und II (4 U / ml), Hyaluronidase (60 U / ml) und DNase I (60 U / ml) in Durchflusszytometrie-Puffer (PBS mit 0,5% BSA und 1 mM EDTA).
    2. Mischungs 100 mg von Tumorgewebe mit 200 & mgr; l Enzymcocktail-Puffer in einem 1,5-ml-Röhrchen und würfeln das Gewebe in kleine Stücke mit einer feinen Schere. Einen weiteren hinzufügen 1,3 ml Enzymcocktail in das Rohr und übertragen seinen Inhalt auf eine 6-Well-Platte.
    3. Schütteln Sie die 6-Well-Platte auf einem horizontalen Schüttler in einem C-Ofen 37 ° gelegt für 60 min bei 60 Umdrehungen pro Minute.
    4. Waschen Sie das Gewebehomogenat mit Durchflusszytometrie-Puffer 3 mal eine Einzelzellsuspension zu erhalten.
    5. Beflecken die Zellen mit einem Cocktail von Antikörpern, die spezifisch an Biomarkern einschließlich CD45, CD11b, Ly6C, CD11c,CD64, CD3, MHCII und CD31 (1: 200-Verdünnung für alle Antikörper, Klon Informationen werden im Materialkalkulationstabelle zur Verfügung gestellt). Identifizierung relevanten Zelltypen und bestimmen deren mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) von DiIC12 (5) -DS in jeder Zellpopulation mit einem entsprechenden Durchflusscytometrie-Analyse-Software.
  3. Für die Immunfärbung, gehen Sie folgendermaßen vor:
    1. Legen Sie einen Tumor in eine Kassette mit einer optimalen Schneidmedium (OCT) gefüllt und frieren sie auf Trockeneis.
    2. Machen Sie 6 um gefrorene Schnitte von Tumorgewebe und legen sie auf die Histologie Glasobjektträger; die Abschnitte sollten die größten Querschnitte des Tumors Abdeckung, die den repräsentativsten Informationen auf dem Gewebe bereitzustellen.
    3. Stain die Biomarker (zB CD31 für Endothelzellen) von Interesse mit den entsprechenden Antikörpern (zB anti-CD31, Klon MEC13.3). Befestigen Sie die Abschnitte mit Paraformaldehyd; blockieren sie mit Serum der Spezies Ursprung der Sekundärantikörper übereinstimmt; incubaß mit primären Antikörpern für 12 h bei 4 ° C und anschließend mit Sekundärantikörper für 2 h; und schließlich waschen mit PBS und Deckel mit Deckel rutscht. Bild die gefärbten Objektträger mit einem Leica aufrechten konfokalen Mikroskop SP5 13, 16.

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Ergebnisse

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1 zeigt einen Überblick über das Verfahren. Figur 2 zeigt den schematischen Syntheseverfahren der dual-markierte Liposomen in Schritt 1 beschrieben 10. Abbildung 3 zeigt eine repräsentative PET-CT - Bild (Abbildung 3a), Radioaktivität Quantifizierung von PET - Bildgebung (Abbildung 3b), Bluthalbwertszeit (Abbildung 3c) und biologische Verteilung (Abbildung...

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Diskussion

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Kritische Schritte im Protokoll:

Die hohe Qualität der dual-markierte Liposomen ist der Schlüssel konsistente Ergebnisse über einen langen Zeitraum zu erzeugen. Freie Fluoreszenzfarbstoffe oder 89 Zr - Ionen können völlig unterschiedliche Targeting - Muster erzeugen und müssen vollständig während der Reinigungsschritt entfernt werden. Darüber hinaus deutlich, wenn das Immunsystem experimentellen Krebsnano Leistung beeinflusst, sollte die Verwendung von immunkompetenten Mausmodelle be...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Offenlegung vorzunehmen.

Danksagungen

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Die Autoren danken Dr. Helene Salmon und Miriam Merad von der Icahn School of Medicine am Mount Sinai für die Bereitstellung der B16-F10-YFP-Zellen und für ihre fachkundige Beratung zu Melanom-Mausmodellen. Die Autoren danken außerdem der Animal Imaging Core Facility, der Radiochemistry and Molecular Imaging Probes Core Facility und der Molecular Cytology Core Facility am Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK) für ihre Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch die National Institutes of Health Grants NIH 1 R01 HL125703 (W.J.M.M.), R01CA155432 (W.J.M.M.), K25 EB016673 (T.R.) und P30 CA008748 (MSK Center Grant) unterstützt. Die Autoren danken auch dem Center for Molecular Imaging and Nanotechnology (CMINT) am MSK für die finanzielle Unterstützung (T.R.).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
DPPCAvantilipide850355
CholesterinSigma-AldrichC8667
DSPE-PEG2000Avantilipide880120P
DSPE-DFOHausgemacht110634Perez-Medina et al., JNM, 2014
DiIC12[5]-DSAAT Bioquest22051
ZentrifugalfilterVivaproductsVS2061
RotationsverdampferBüchiR-100
Radio-HPLCShimadzu HPLC mit 2 LC-10AT PumpenN/A
89Zr-oxalatMSKCCSynthetisiert im HausTR19/9 Veränderliches Strahl-Zyklotron (Ebco Industries Inc.)
Micro PET-CTSiemensInveon Micro-PET/CT
Gamma-ZählerPerkinElmer2470-0150
DurchflusszytometrieBD BiosciencesFortessaAlle multiparametrischen Durchflusszytometrie-Analysatoren würden ausreichen
C57BL/6 MäuseJackson Laboratories
B16-YFP MelanomzellenHausgemachtN/ALachs et al., Immunität, 2016
Ly6C (Klon HK1.4)--APC-Cy7128025Biolegend
MHCII (M5/114/152)--APC107613Biolegend
CD45 (30-F11)--BV510103137Biolegend
CD64 (X54-5/7.1)--PE-Cy7139313Biolegend
CD11b (M1/70)--BV605101237Biolegend
CD3 (17A2)--BV711100241Biolegend
CD31 (13.3)--PE561073Biolegend
CD11c (M418)--PerCP-Cy5.5117327BD Biosciences
CD31 (13.3) kein Fluorophor550274BD Biosciences

Referenzen

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Schlagwörter

PET CT BildgebungDurchflusszytometrieFluoreszenzmikroskopieRadioaktivit tsquantifizierungtumortragende M useLiposomenformulierungZirconium 89 MarkierungEx vivo Biodistribution

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