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System zur Wirksamkeit und Zytotoxizität Screening von Inhibitoren Targeting intrazellulärer

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DOI:

10.3791/55273

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5. April 2017

 , 
1Department of Medicine, University of British Columbia

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir haben für die Entdeckung neuer Verbindungen gegen Mycobacterium tuberculosis ein modulares Hochdurchsatz - Screening - System entwickelt, und die intrazelluläre Targeting-Brühe in Bakterien sowie Zytotoxizität gegen die Säuger - Wirtszelle wächst.

Zusammenfassung

Mycobacterium tuberculosis, der Erreger von Tuberkulose (TB), ist weltweit eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität. Mit der zunehmenden Ausbreitung von multiresistenter TB (MDR-TB) besteht eine echte Dringlichkeit, neue therapeutische Strategien gegen M. tuberculosis-Infektionen zu entwickeln. Traditionell werden Verbindungen auf der Grundlage ihrer antibakteriellen Aktivität unter In-vitro-Wachstumsbedingungen in Brühe bewertet; Für intrazelluläre Krankheitserreger wie M. tuberculosis sind die Ergebnisse jedoch oft irreführend, da sich die phänotypischen Screening-Bedingungen in der Brühe signifikant von den tatsächlichen Krankheitsbedingungen im menschlichen Körper unterscheiden. Das Screening auf Inhibitoren, die in Makrophagen wirken, war aufgrund der Komplexität, der Variabilität der Infektion und der langsamen Replikationsrate von M. tuberculosis traditionell schwierig. In dieser Studie berichten wir über einen neuen Ansatz, um die Wirksamkeit von Verbindungen auf die Lebensfähigkeit von M. tuberculosis in einem Makrophagen-Infektionsmodell schnell zu bewerten. Mit einer Kombination aus einem Zytotoxizitätstest und einem In-Bouillon-Viabilitätsassay von M. tuberculosis konnten wir ein Screening-System erstellen, das eine umfassende Analyse der interessierenden Verbindungen ermöglicht. Dieses System ist in der Lage, quantitative Daten zu geringen Kosten zu produzieren, die für die meisten Labore erschwinglich sind und dennoch hochgradig skalierbar sind, um für große industrielle Umgebungen geeignet zu sein.

Einleitung

Mycobacterium tuberculosis, der Erreger der Tuberkulose (TB) ist eine führende Ursache von Morbidität und Mortalität weltweit. Arzneimittelempfindlichen TB ist eine behandelbare Krankheit, die für einen Zeitraum von 6 Monaten mehr Antibiotika erfordert. Trotz einer behandelbaren Krankheit zu sein, wurde TB Sterblichkeit schätzungsweise 1 1,5 Millionen im Jahr 2015 sein. In den letzten 10 Jahren wurden dort zunehmende Besorgnis über die Verbreitung von arzneimittelresistenten Tuberkulose M.. Mehrfach arzneimittelresistenter Tuberkulose (MDR-TB) als TB definiert, die mindestens Isoniazid (INH) und Rifampicin (RMP) beständig ist, und die meisten MDR-TB-Stämme sind auch resistent second-line TB Medikamente auszuwählen, wodurch Behandlungsoptionen Zu . Die Auswirkungen von Medikamentenresistenz eine größere Herausforderung für die Behandlung von Patienten schaffen-Koinfektion mit Human Immunodeficiency Virus (HIV); 400.000 Patienten starben weltweit von HIV-assoziierten TB im Jahr 2015 1. Enttäuschend, den Vereinigten Staaten Food and Drug AdministRation hat nur eine neues TB - Medikament gegen MDR-TB, Bedaquilin, in den letzten 40 Jahren 2 genehmigt. Die Fortschritte bei der Suche nach besseren und kürzeren TB-Therapien sind dringend erforderlich, um vorne zu bleiben im Kampf gegen TB und MDR-TB.

Traditionell TB Arzneimittel Bildschirme sind unter in vitro - Wachstumsbedingungen in einem Wachstumsmedium durchgeführt, wobei Verbindungen zu einer wachsenden Kultur und ihre Wirksamkeit hinzugefügt werden die Mikroorganismen bei der Beseitigung der durch Zählen koloniebildenden Einheiten (CFU) auf einem festen Medium bestimmt. Als Keimzahlen arbeitsintensiv, zeitraubend und teuer werden verschiedene indirekte Methoden, um dieses Problem zu lindern entwickelt. Solche Verfahren umfassen die Lebensfähigkeit Alamar - Blau - Assay 3, die Bestimmung der Fluoreszenz 4 von grün fluoreszierendem Protein (GFP) oder Lumineszenz 5 von Luciferase-exprimierenden Bakterien, und die Schätzung der Gesamt Adenosintriphosphat (ATP) 6, 7.

Typische TB wird durch eine Infektion mit M. tuberculosis der Lunge charakterisiert, in dem sich die Bakterien befinden , und im Inneren der Phagosomen von Alveolarmakrophagen 8 nachzubilden. Die einfache in-Brühe kann phänotypische Bildschirm extrazelluläre Erreger passen; jedoch in der historischen Perspektive getroffen Verbindungen gegen M. tuberculosis diese Methode oft identifiziert verwenden , nicht die Erwartungen bei der nachgeschalteten Validierungsschritten in Infektionsmodellen zu entsprechen . Wir schlagen vor, dass TB Medikament am besten in einem intrazellulären Wirtszelle Infektionsmodell durchgeführt wird. Dennoch besitzen die intrazelluläre Modelle viele technologische und biologische Barrieren für Hochdurchsatz-Screening (HTS) Entwicklung. Eine große Hürde ist die Komplexität des Infektionsprozesses, beispielhaft durch zahlreiche Schritte und die aufwendigen Entfernung von extrazellulären Bakterien, die durch in-zwischen dem Waschen. Eine zweite große Hürde ist die lange Zeit rederungen, als Wachstumserkennung erfolgt normalerweise durch Zählen CFU auf Kulturplatten, ist ein Prozess, vervollständigen über 3 Wochen dauert. Eine Lösung für CFU Zählungen ersetzt wurde durch automatisiertes Fluoreszenz-Mikroskopie in Kombination mit fluoreszierenden Bakterien bereitgestellt. Jedoch erfordert diese Lösung eine Erstausrüstung Investition, die für viele Forschungslabors außer Reichweite ist. Eine einfache, kostengünstige und krankheitsrelevanten HTS Verfahren würde die Drug Discovery-Prozess erheblich verbessern.

In dieser Studie berichten wir über ein neues, modulares HTS - System , das auf der Bereitstellung eine schnelle und hochskalierbaren, noch wirtschaftlich, Assay geeignet zur Bestimmung der Aktivität von Verbindungen gegen intrazelluläre M. tuberculosis gerichtet ist. Dieses System besteht aus drei Modulen: (i) intrazelluläre, (ii) die Zytotoxizität und (iii) in-Broth-Assays. Das kombinierte Endergebnis liefert eine umfassende Beschreibung der Verbindung Eigenschaften, mit zusätzlichen Informationen in Bezug auf die mögliche Wirkungsweise. diese screening System in mehreren Projekten mit verschiedenen Substanzbibliotheken verwendet worden ist, die Wirkungsweise zielen, einschließlich der Analyse von Arzneimittel Synergie 9, -secreted die Stimulation von autophagy 10 und die Hemmung von M. tuberculosis Virulenzfaktor (nicht veröffentlicht). Verbindungen unbekannter Wirkungsweise haben auch 11 untersucht worden. Eine modifizierte Version dieses Verfahrens wurde auch durch unsere Industriepartner als primäre Screening - Verfahren zur Identifizierung neuer Verbindungen gegen intrazelluläre M. tuberculosis 11 angenommen.

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Protokoll

1. Bakterienstamm und Wachstumsmedium

  1. Make-Albumin-Dextrose und Salz-Stammlösung (ADS) durch Solubilisieren von 25 g Rinderserumalbumin, 10,0 g Dextrose und 4,05 g Natriumchlorid in 460 ml deionisiertem Wasser. Filter-Sterilisieren der ADS und lagere bei 4 ° C.
  2. Make 7H9 Brühe durch Zugabe von 4,7 g 7H9 Pulver und 2 ml Glycerin zu 900 ml gereinigtem Wasser. Autoklaviert die 7H9-Bouillon bei 121 ° C für 10 min und läßt es vor dem Fortfahren auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Machen 7H9ADST durch Zugabe von 100 ml ADS und 0,5 ml Tween 80 bis 900 ml 7H9-Bouillon. Lagerung bei 4 ° C.
  3. Man wiegt 50 mg Kanamycinsulfat und löst in 1 ml entionisiertem Wasser; die Endkonzentration beträgt 50 mg / mL. Filter-sterilisiert und bei -20 ° C. In 0,5 ml Kanamycin Stammlösung pro 1 l 7H9ADST.
    HINWEIS: Dieses Medium sollte frisch hergestellt werden, so skaliert die Volumina in geeigneter Weise entsprechend der Kultur Größe.
  4. Wachsen M. tuberculosis in 7H9ADST mit Kanamycin in Kultur steht. Schütteln Sie die Kultur täglich und verdünnen Sie es, bevor die OD 600 1,0 erreicht Verklumpen zu vermeiden.
    HINWEIS: Der Stamm M. tuberculosis für die Entwicklung dieses Verfahrens verwendet H37Rv wurde mit Plasmid pJAK2.A 12 umgewandelt. pJAK2.A ist ein integratives Plasmid basiert auf dem Vektor pMV361, die aus dem hsp60 Promotor Expression auf hohem Niveau des Glühwürmchen - Luciferase - Gens ermöglicht , und kann unter Verwendung von Kanamycin selektiert werden.

2. THP-1 Medium und Wartung

  1. Fügen Sie 50 ml hitzeinaktiviertem fötales Rinderserum (FBS) und 5 ml 200 mM L-Glutamin und 500 ml RPMI 1640-Medium RPMI unvollständig (ca. 10% FBS und 2 mM Glutamin) zu machen.
  2. Pflegen einer THP-1 - Zellkultur nach Standardprotokoll 13. THP-1-Zellen in RPMI unvollständigem Medium kurz, wachsen, während eine Zelldichte von 0,2 bis 1 Million pro ml Medium zwischen pas AufrechterhaltenWeisen.

3. Hochdurchsatz - Screening intrazellulärer Mit Luziferase-exprimierenden M. tuberculosis H37Rv

  1. Die optische Dichte einer aktiv wachsende Bakteriensuspension in einem Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 600 nm. Berechnen Sie die Bakteriendichte unter Verwendung des Umwandlungsfaktors von 0,1 OD 600 = 3 x 10 7 Bakterien pro ml.
  2. Pipette aus genügend Bakterien für eine Multiplizität der Infektion (MOI) von 10: 1 in ein neues Zentrifugenröhrchen. Pelletieren bei 3.000 × g für 10 min und aspirieren die Flüssigkeit. In 50 ul Humanserum zu 450 ul RPMI1640. Skalieren Sie die Lautstärke auf die entsprechenden Werte für das Experiment.
  3. Um die Bakterien zu opsonieren, das Pellet bei einer Dichte von 1 x 10 8 Bakterien pro 500 ul RPMI1640 , das 10% Humanserum. Lassen Sie die Mischung bei 37 ° C für 30 min inkubieren. Bestimmen Sie die THP-1-Zellkulturdichte, indem sie mit einem Hämocytometer gezählt und ein invertiertes microscope.
  4. Pelletieren Sie die Zellen in sterilen Zentrifugenröhrchen bei 100 x g und 37 ° C für 10 min. Aspirieren den Überstand und die Zellen in RPMI unvollständig in einer Dichte von 1 Million Zellen pro ml. Hinzufügen Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) zu einer 40 ng / ml Endkonzentration.
    Hinweis: Dies wird als Mix Differenzierung bezeichnet werden.
  5. Kombinieren opsonisiertes M. tuberculosis mit THP-1 Differenzierungs Mischung bei einer MOI von 10: 1 und aliquotieren die Endmischung bei 100 & mgr; l pro Vertiefung in einer 96-Well - Flachboden - weißen Platte. Regelmäßig rühren Sie die Mischung Einheitlichkeit zu gewährleisten. Ermöglicht die Differenzierung und die Infektion fortschreiten über Nacht bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2.
  6. Waschen Sie die Vertiefungen zweimal mit 100 & mgr; l RPMI jeder. Fügen Verbindungen auf die gewünschten Konzentrationen in RPMI verdünnt unvollständig und inkubiere 3 Tage lang.
  7. Aspirieren das Medium aus den Vertiefungen. Zugeben von 50 & mgr; l Luciferase-Assay-Reagens in jede Vertiefung. Abdichten der Platten mit transparent Klebeplatte Versiegelungen. Sie 5 min Inkubation bei 22 ° C und dann eine Anzeige in einem Luminometer bei 1 s pro Vertiefung erhalten.

4. Die Zytotoxizität Analyse unter Verwendung eines 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) Assay 14

  1. Differenzieren THP-1-Zellen in RPMI unvollständig mit 40 ng / ml PMA in klaren 96-Loch-Platten, ergänzt. Achten Sie auf eine Zelldichte von 1 Million pro ml und aliquote 100 & mgr; l pro Vertiefung. Ermöglicht die Differenzierung über Nacht bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 fortschreiten.
  2. Aspirieren das Medium aus den Vertiefungen und waschen Sie sie zweimal mit RPMI 1640. Verbindungen in RPMI zu den Vertiefungen unvollständig verdünnt hinzufügen. Inkubieren für 3 Tage.
  3. Man löst 0,5 g MTT in 100 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), um eine Stammlösung von 5 mg machen / mL. Sterile Filter und Lagerung bei -20 ° C, vor Licht; ist es am besten diese Lösung frisch zu machen.
  4. 2,5 h vor deme das Ende der Inkubationszeit 3-Tag, fügen Sie in jede Vertiefung 25 ul MTT-Lösung und die Inkubationszeit abzuschließen.
  5. Bereiten 50% N, N-Dimethylformamid (DMF) durch Mischen von 250 ml DMF mit 250 ml deionisiertem Wasser.
  6. Bereiten MTT-Extraktionspuffer, wie folgt: Man wiegt 100 g SDS in einer 500-ml-Flasche und 300 ml 50% DMF. Anwenden niedrige Hitze der SDS zu ermöglichen aufzulösen. 10 ml reiner Essigsäure und 12,5 ml 1 M HCl. Füllen bis zur 500 ml-Markierung mit 50% DMF; die endgültige Zusammensetzung des Extraktionspuffers beträgt 50% DMF, 20% SDS, 2,5% Essigsäure und 2,5% 1 M Salzsäure.
  7. Am Ende der Behandlungszeit wird mit 100 & mgr; l Extraktionspuffer (erwärmt auf 45 ° C keine Kristalle aufzulösen) in jede Vertiefung. Lassen Sie die Mischung über Nacht bei 37 inkubieren ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2. Die Absorption bei 570 nm.
    HINWEIS: Der Zytotoxizitätstest wird am besten parallel durchgeführt mit einem intrazellularenular Bildschirm samt-Charge und das Alter der THP-1-Zellen.

5. In-Brühe Mit Aktivitätsanalyse einer Resazurin - Assay 3

  1. Wächst M. tuberculosis in 7H9ADST zur mittleren log - Phase (~ 0,5 bis 0,8 OD 600). Verdünne die Kultur mit dem 7H9ADST bis 0,01 OD 600. Verdünne die Verbindungen in 7H9ADST die Testkonzentrationen und Aliquot 100 & mgr; l der verdünnten Verbindung in jede Vertiefung auf 2x.
  2. Übertragung von 100 & mgr; l der verdünnten Bakteriensuspension in jede Vertiefung. Lassen Sie die Platten für 5 Tage bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator inkubiert. Man löst 10 mg Resazurin in 100 ml deionisiertem Wasser und Sterilfilter.
  3. In 30 ul Resazurin-Lösung und überwacht die Farbänderung nach 48 h; Bakterienwachstum wird durch eine Farbumwandlung von blau angezeigt rosa.
    ANMERKUNG: Eine quantitative Analyse kann auch durch das Messen entweder die Fluoreszenz bei 590 nm mit einer Anregung bei 530 durchgeführt werden - 560nm oder das Absorptionsvermögen bei 570 nm und 600 nm 15.

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Ergebnisse

Hochdurchsatz - Screening unter Verwendung von intrazellulären M. tuberculosis exprimieren das Luciferasegen

2A und Tabelle 1 enthalten die Rohdaten von dem Luminometer gesammelt, in relativen Lumineszenz - Einheiten ausgedrückt (RLU), zeigen die Wirkung einer Erhöhung der Konzentration des Arzneimittels TB Rifampicin auf M. tuberculosis innerhalb THP-1 - Zellen. 2A

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Diskussion

Verwendung eines menschlichen intrazellulären Infektionsmodell für M. tuberculosis Das Ziel dieser Studie war es, ein einfaches und kostengünstiges HTS - Verfahren zu erstellen. Tuberkulose ist ein Mensch durch die Infektion von Alveolarmakrophagen gekennzeichnet Krankheit , die durch M. tuberculosis. Aufgrund Fragen der biologischen Sicherheit, Forschung sowohl biologische Modelle des Bakteriums und die Wirtszellen beteiligt hat in der Vergangenheit verwendet worden. Allerdings hat es sich gezeigt , d...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass es für diese Arbeit keine konkurrierenden finanziellen Interessen gibt.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der BC Lung Association und Mitacs unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
RPMI 1640Sigma-AldrichR5886
L-GlutaminSigma-AldrichG7513
Fötales Rinderserum (FBS)Thermo Fisher Scientific12483020
Middlebrook 7H9Becton, Dickinson and Company271210
Tween80Fisher ScientificT164
Albumin, Rind pH7Affymetrix10857
DextroseFisher ScientificBP350
NatriumchloridFisher ScientificBP358
KanamycinsulfatFisher ScientificBP906
PMASigma-AldrichP8139
MTTSigma-AldrichM2128
N,N- Dimethylformamid (DMF)Fisher ScientificD131
1 M Hydrocholorinsäure (HCl)Fisher Scientific351279212
EssigsäureFisher Scientific351269
SDS FisherScientificBP166
ResazurinAlfa AesarB21187
DMSOSigma-AldrichD5879
GlycerinFisher ScientificBP229
THP-1American Type Culture CollectionTIB-202
M. tuberculosis H37Rv
96-Well-Platte mit flachem Boden weißCorning3917
95-Well-Platte mit flachem Boden Corning3595
Transparenter PlattenversiegelerThermo Fisher ScientificAB-0580
SpektralphotometerThermo Fisher ScientificBiomate 3
Mikroplatten-SpektralphotometerBiotekEpoch
LuminometerApplied BiosystemsTropix TR717

Referenzen

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auf Luciferase basierender WirksamkeitsassayZytotoxizit tsassayMIC AssayTHP 1 ZelldifferenzierungMakrophagen InfektionsmodellResazurin Viabilit tsassayMTT Zytotoxizit tsassayOpsonisierungsprotokollHigh Content Screening

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