System zur Wirksamkeit und Zytotoxizität Screening von Inhibitoren Targeting intrazellulärer Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, der Erreger der Tuberkulose (TB) ist eine führende Ursache von Morbidität und Mortalität weltweit. Arzneimittelempfindlichen TB ist eine behandelbare Krankheit, die für einen Zeitraum von 6 Monaten mehr Antibiotika erfordert. Trotz einer behandelbaren Krankheit zu sein, wurde TB Sterblichkeit schätzungsweise ¹ 1,5 Millionen im Jahr 2015 sein. In den letzten 10 Jahren wurden dort zunehmende Besorgnis über die Verbreitung von arzneimittelresistenten Tuberkulose M.. Mehrfach arzneimittelresistenter Tuberkulose (MDR-TB) als TB definiert, die mindestens Isoniazid (INH) und Rifampicin (RMP) beständig ist, und die meisten MDR-TB-Stämme sind auch resistent second-line TB Medikamente auszuwählen, wodurch Behandlungsoptionen Zu . Die Auswirkungen von Medikamentenresistenz eine größere Herausforderung für die Behandlung von Patienten schaffen-Koinfektion mit Human Immunodeficiency Virus (HIV); 400.000 Patienten starben weltweit von HIV-assoziierten TB im Jahr 2015 ^1. Enttäuschend, den Vereinigten Staaten Food and Drug AdministRation hat nur eine neues TB - Medikament gegen MDR-TB, Bedaquilin, in den letzten 40 Jahren ² genehmigt. Die Fortschritte bei der Suche nach besseren und kürzeren TB-Therapien sind dringend erforderlich, um vorne zu bleiben im Kampf gegen TB und MDR-TB.

Traditionell TB Arzneimittel Bildschirme sind unter in vitro - Wachstumsbedingungen in einem Wachstumsmedium durchgeführt, wobei Verbindungen zu einer wachsenden Kultur und ihre Wirksamkeit hinzugefügt werden die Mikroorganismen bei der Beseitigung der durch Zählen koloniebildenden Einheiten (CFU) auf einem festen Medium bestimmt. Als Keimzahlen arbeitsintensiv, zeitraubend und teuer werden verschiedene indirekte Methoden, um dieses Problem zu lindern entwickelt. Solche Verfahren umfassen die Lebensfähigkeit Alamar - Blau - Assay ^3, die Bestimmung der Fluoreszenz ⁴ von grün fluoreszierendem Protein (GFP) oder Lumineszenz ⁵ von Luciferase-exprimierenden Bakterien, und die Schätzung der Gesamt Adenosintriphosphat (ATP) ^{6, 7.}

Typische TB wird durch eine Infektion mit M. tuberculosis der Lunge charakterisiert, in dem sich die Bakterien befinden , und im Inneren der Phagosomen von Alveolarmakrophagen ⁸ nachzubilden. Die einfache in-Brühe kann phänotypische Bildschirm extrazelluläre Erreger passen; jedoch in der historischen Perspektive getroffen Verbindungen gegen M. tuberculosis diese Methode oft identifiziert verwenden , nicht die Erwartungen bei der nachgeschalteten Validierungsschritten in Infektionsmodellen zu entsprechen . Wir schlagen vor, dass TB Medikament am besten in einem intrazellulären Wirtszelle Infektionsmodell durchgeführt wird. Dennoch besitzen die intrazelluläre Modelle viele technologische und biologische Barrieren für Hochdurchsatz-Screening (HTS) Entwicklung. Eine große Hürde ist die Komplexität des Infektionsprozesses, beispielhaft durch zahlreiche Schritte und die aufwendigen Entfernung von extrazellulären Bakterien, die durch in-zwischen dem Waschen. Eine zweite große Hürde ist die lange Zeit rederungen, als Wachstumserkennung erfolgt normalerweise durch Zählen CFU auf Kulturplatten, ist ein Prozess, vervollständigen über 3 Wochen dauert. Eine Lösung für CFU Zählungen ersetzt wurde durch automatisiertes Fluoreszenz-Mikroskopie in Kombination mit fluoreszierenden Bakterien bereitgestellt. Jedoch erfordert diese Lösung eine Erstausrüstung Investition, die für viele Forschungslabors außer Reichweite ist. Eine einfache, kostengünstige und krankheitsrelevanten HTS Verfahren würde die Drug Discovery-Prozess erheblich verbessern.

In dieser Studie berichten wir über ein neues, modulares HTS - System , das auf der Bereitstellung eine schnelle und hochskalierbaren, noch wirtschaftlich, Assay geeignet zur Bestimmung der Aktivität von Verbindungen gegen intrazelluläre M. tuberculosis gerichtet ist. Dieses System besteht aus drei Modulen: (i) intrazelluläre, (ii) die Zytotoxizität und (iii) in-Broth-Assays. Das kombinierte Endergebnis liefert eine umfassende Beschreibung der Verbindung Eigenschaften, mit zusätzlichen Informationen in Bezug auf die mögliche Wirkungsweise. diese screening System in mehreren Projekten mit verschiedenen Substanzbibliotheken verwendet worden ist, die Wirkungsweise zielen, einschließlich der Analyse von Arzneimittel Synergie ^9, -secreted die Stimulation von autophagy ¹⁰ und die Hemmung von M. tuberculosis Virulenzfaktor (nicht veröffentlicht). Verbindungen unbekannter Wirkungsweise haben auch ¹¹ untersucht worden. Eine modifizierte Version dieses Verfahrens wurde auch durch unsere Industriepartner als primäre Screening - Verfahren zur Identifizierung neuer Verbindungen gegen intrazelluläre M. tuberculosis ¹¹ angenommen.

1. Bakterienstamm und Wachstumsmedium

1. Make-Albumin-Dextrose und Salz-Stammlösung (ADS) durch Solubilisieren von 25 g Rinderserumalbumin, 10,0 g Dextrose und 4,05 g Natriumchlorid in 460 ml deionisiertem Wasser. Filter-Sterilisieren der ADS und lagere bei 4 ° C.
2. Make 7H9 Brühe durch Zugabe von 4,7 g 7H9 Pulver und 2 ml Glycerin zu 900 ml gereinigtem Wasser. Autoklaviert die 7H9-Bouillon bei 121 ° C für 10 min und läßt es vor dem Fortfahren auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Machen 7H9ADST durch Zugabe von 100 ml ADS und 0,5 ml Tween 80 bis 900 ml 7H9-Bouillon. Lagerung bei 4 ° C.
3. Man wiegt 50 mg Kanamycinsulfat und löst in 1 ml entionisiertem Wasser; die Endkonzentration beträgt 50 mg / mL. Filter-sterilisiert und bei -20 ° C. In 0,5 ml Kanamycin Stammlösung pro 1 l 7H9ADST.
   HINWEIS: Dieses Medium sollte frisch hergestellt werden, so skaliert die Volumina in geeigneter Weise entsprechend der Kultur Größe.
4. Wachsen M. tuberculosis in 7H9ADST mit Kanamycin in Kultur steht. Schütteln Sie die Kultur täglich und verdünnen Sie es, bevor die OD 600 1,0 erreicht Verklumpen zu vermeiden.
   HINWEIS: Der Stamm M. tuberculosis für die Entwicklung dieses Verfahrens verwendet H37Rv wurde mit Plasmid pJAK2.A ¹² umgewandelt. pJAK2.A ist ein integratives Plasmid basiert auf dem Vektor pMV361, die aus dem hsp60 Promotor Expression auf hohem Niveau des Glühwürmchen - Luciferase - Gens ermöglicht , und kann unter Verwendung von Kanamycin selektiert werden.

2. THP-1 Medium und Wartung

1. Fügen Sie 50 ml hitzeinaktiviertem fötales Rinderserum (FBS) und 5 ml 200 mM L-Glutamin und 500 ml RPMI 1640-Medium RPMI unvollständig (ca. 10% FBS und 2 mM Glutamin) zu machen.
2. Pflegen einer THP-1 - Zellkultur nach Standardprotokoll ^13. THP-1-Zellen in RPMI unvollständigem Medium kurz, wachsen, während eine Zelldichte von 0,2 bis 1 Million pro ml Medium zwischen pas AufrechterhaltenWeisen.

3. Hochdurchsatz - Screening intrazellulärer Mit Luziferase-exprimierenden M. tuberculosis H37Rv

1. Die optische Dichte einer aktiv wachsende Bakteriensuspension in einem Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 600 nm. Berechnen Sie die Bakteriendichte unter Verwendung des Umwandlungsfaktors von 0,1 OD ₆₀₀ = 3 x 10 ⁷ Bakterien pro ml.
2. Pipette aus genügend Bakterien für eine Multiplizität der Infektion (MOI) von 10: 1 in ein neues Zentrifugenröhrchen. Pelletieren bei 3.000 × g für 10 min und aspirieren die Flüssigkeit. In 50 ul Humanserum zu 450 ul RPMI1640. Skalieren Sie die Lautstärke auf die entsprechenden Werte für das Experiment.
3. Um die Bakterien zu opsonieren, das Pellet bei einer Dichte von 1 x 10 ⁸ Bakterien pro 500 ul RPMI1640 , das 10% Humanserum. Lassen Sie die Mischung bei 37 ° C für 30 min inkubieren. Bestimmen Sie die THP-1-Zellkulturdichte, indem sie mit einem Hämocytometer gezählt und ein invertiertes microscope.
4. Pelletieren Sie die Zellen in sterilen Zentrifugenröhrchen bei 100 x g und 37 ° C für 10 min. Aspirieren den Überstand und die Zellen in RPMI unvollständig in einer Dichte von 1 Million Zellen pro ml. Hinzufügen Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) zu einer 40 ng / ml Endkonzentration.
   Hinweis: Dies wird als Mix Differenzierung bezeichnet werden.
5. Kombinieren opsonisiertes M. tuberculosis mit THP-1 Differenzierungs Mischung bei einer MOI von 10: 1 und aliquotieren die Endmischung bei 100 & mgr; l pro Vertiefung in einer 96-Well - Flachboden - weißen Platte. Regelmäßig rühren Sie die Mischung Einheitlichkeit zu gewährleisten. Ermöglicht die Differenzierung und die Infektion fortschreiten über Nacht bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO _2.
6. Waschen Sie die Vertiefungen zweimal mit 100 & mgr; l RPMI jeder. Fügen Verbindungen auf die gewünschten Konzentrationen in RPMI verdünnt unvollständig und inkubiere 3 Tage lang.
7. Aspirieren das Medium aus den Vertiefungen. Zugeben von 50 & mgr; l Luciferase-Assay-Reagens in jede Vertiefung. Abdichten der Platten mit transparent Klebeplatte Versiegelungen. Sie 5 min Inkubation bei 22 ° C und dann eine Anzeige in einem Luminometer bei 1 s pro Vertiefung erhalten.

4. Die Zytotoxizität Analyse unter Verwendung eines 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) Assay ¹⁴

1. Differenzieren THP-1-Zellen in RPMI unvollständig mit 40 ng / ml PMA in klaren 96-Loch-Platten, ergänzt. Achten Sie auf eine Zelldichte von 1 Million pro ml und aliquote 100 & mgr; l pro Vertiefung. Ermöglicht die Differenzierung über Nacht bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO ₂ fortschreiten.
2. Aspirieren das Medium aus den Vertiefungen und waschen Sie sie zweimal mit RPMI 1640. Verbindungen in RPMI zu den Vertiefungen unvollständig verdünnt hinzufügen. Inkubieren für 3 Tage.
3. Man löst 0,5 g MTT in 100 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), um eine Stammlösung von 5 mg machen / mL. Sterile Filter und Lagerung bei -20 ° C, vor Licht; ist es am besten diese Lösung frisch zu machen.
4. 2,5 h vor deme das Ende der Inkubationszeit 3-Tag, fügen Sie in jede Vertiefung 25 ul MTT-Lösung und die Inkubationszeit abzuschließen.
5. Bereiten 50% N, N-Dimethylformamid (DMF) durch Mischen von 250 ml DMF mit 250 ml deionisiertem Wasser.
6. Bereiten MTT-Extraktionspuffer, wie folgt: Man wiegt 100 g SDS in einer 500-ml-Flasche und 300 ml 50% DMF. Anwenden niedrige Hitze der SDS zu ermöglichen aufzulösen. 10 ml reiner Essigsäure und 12,5 ml 1 M HCl. Füllen bis zur 500 ml-Markierung mit 50% DMF; die endgültige Zusammensetzung des Extraktionspuffers beträgt 50% DMF, 20% SDS, 2,5% Essigsäure und 2,5% 1 M Salzsäure.
7. Am Ende der Behandlungszeit wird mit 100 & mgr; l Extraktionspuffer (erwärmt auf 45 ° C keine Kristalle aufzulösen) in jede Vertiefung. Lassen Sie die Mischung über Nacht bei 37 inkubieren ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO _2. Die Absorption bei 570 nm.
   HINWEIS: Der Zytotoxizitätstest wird am besten parallel durchgeführt mit einem intrazellularenular Bildschirm samt-Charge und das Alter der THP-1-Zellen.

5. In-Brühe Mit Aktivitätsanalyse einer Resazurin - Assay ³

1. Wächst M. tuberculosis in 7H9ADST zur mittleren log - Phase (~ 0,5 bis 0,8 OD _600). Verdünne die Kultur mit dem 7H9ADST bis 0,01 OD _600. Verdünne die Verbindungen in 7H9ADST die Testkonzentrationen und Aliquot 100 & mgr; l der verdünnten Verbindung in jede Vertiefung auf 2x.
2. Übertragung von 100 & mgr; l der verdünnten Bakteriensuspension in jede Vertiefung. Lassen Sie die Platten für 5 Tage bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator inkubiert. Man löst 10 mg Resazurin in 100 ml deionisiertem Wasser und Sterilfilter.
3. In 30 ul Resazurin-Lösung und überwacht die Farbänderung nach 48 h; Bakterienwachstum wird durch eine Farbumwandlung von blau angezeigt rosa.
   ANMERKUNG: Eine quantitative Analyse kann auch durch das Messen entweder die Fluoreszenz bei 590 nm mit einer Anregung bei 530 durchgeführt werden - 560nm oder das Absorptionsvermögen bei 570 nm und 600 nm ^15.

Hochdurchsatz - Screening unter Verwendung von intrazellulären M. tuberculosis exprimieren das Luciferasegen

2A und Tabelle 1 enthalten die Rohdaten von dem Luminometer gesammelt, in relativen Lumineszenz - Einheiten ausgedrückt (RLU), zeigen die Wirkung einer Erhöhung der Konzentration des Arzneimittels TB Rifampicin auf M. tuberculosis innerhalb THP-1 - Zellen. 2A ist ein Streudiagramm der rohen Lumineszenz gemessen in RLU für verschiedene Konzentrationen von Rifampicin. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwerts (SEM). 2B zeigt die prozentuale Verringerung der Lumineszenz in behandelten Wells im Vergleich zu den unbehandelten Vertiefungen. Die Daten zeigen , dass Rifampicin reduzieren> 99,9% RLU aus intrazellulären M. tuberculosis in einer Konzentration von 0,1 ug / ml der Lage ist. Dies ist in Übereinstimmung mit dem previously veröffentlicht MIC zwischen 0,1 und 0,4 & mgr; g / mL 16. Lumineszenz in jeder Vertiefung erzeugt wird , ist ein Hinweis auf die Gesamt - Luciferase ausgedrückt durch M. tuberculosis und ist somit ein Indikator für die Stoffwechsellage von M. tuberculosis in der gut. Es ist normal für rohe Leuchtstufen zwischen den Experimenten zu variieren. Als solches würde ein Vergleich der Rohdaten unzuverlässig Schlussfolgerungen erzeugen. Somit sollten die Daten gegen eine definierte negative Kontrolle normalisiert werden, die die Proben mit nur DMSO behandelt würden. Die resultierenden Werte können ausgedrückt werden als die prozentuale Verringerung in M. tuberculosis in den Vertiefungen (2B).

Zytotoxizität Analyse unter Verwendung der MTT-Assays

Der MTT-Test ist eine gut etablierte Assay für eukaryotische Zytotoxizität. Dieser kolorimetrischen Test zeigt lebende Zellen durch die Umwandlung von MTT (gelb) zupurpurfarbene Formazan. Dieser Assay ist ohne eine M. tuberculosis - Infektion durchgeführt , weil die Bakterien metabolisieren MTT fähig sind, die die beobachtete Toxizität der Verbindungen reduziert. Ein üblicher Vorschlag für die MTT - Assay beruht auf der Absorption bei 570 nm 17 Medien ohne den pH - Indikator Phenolrot zu verwenden. Jedoch ist das angesäuerte Extraktionspuffer in diesem beschriebenen Verfahren können Störungen durch Phenolrot 17 verursacht wird, minimieren.

Abbildung 3 veranschaulicht die Zytotoxizität von einer zunehmenden Konzentration einer Testverbindung codiert G1-1H verursacht. Normalerweise wird ein 50% ige Hemmkonzentration (IC 50) eingesetzt , um den Grad der Zytotoxizität anzuzeigen. Im Fall von G1-1H, Konzentrationen von 10 um und 3 um liegen deutlich unterhalb der Konzentration 50 ICS.

In-Brühe Aktivitätsanalyse unsing des Resazurin-Assay

Der Resazurin - Test wird für die Analyse der Zytotoxizität in eukaryotischen Zellen üblicherweise verwendet, aber es kann auch lebende Bakterien verwendet wird , in 3 - Brühe zu überwachen. Der Resazurin-Test ist ein redox-basierter Assay ähnlich die MTT-Assay. Er misst NADPH Ebenen und NADPH-Dehydrogenase-Aktivität durch die Umwandlung von Resazurin in Resorufin, einem roten Fluorophor. Der einfachste und schnellste Weg, Wirksamkeit von Medikamenten zu bestimmen, ist für die niedrigste Behandlungskonzentration zu suchen, wo die Vertiefungen in der Farbe blau bleiben. Abbildung 4 zeigt einen Teil einer 96-Well - Platte zeigt , haben die Wirkung verschiedener Konzentrationen der Antibiotika - Apramycin auf Resazurin Umwandlung von M. tuberculosis. Die in-Brühe MIC wurde zwischen 2,5 und 5 & mgr; g / ml bestimmt. Dies ist etwas höher als der zuvor veröffentlichte Wert von 1,5 ug / ml 18, aber es ist immer noch gut innerhalb der acceptable Bereich. In vielen Fällen ist die Farbänderung eher allmählich, so ist es schwierig, eine selbstbewusste Entscheidung zu treffen. Unter diesen Bedingungen ist es besser, die tatsächliche Menge an Resazurin Umwandlung unter Verwendung von entweder Absorption oder Fluoreszenz zu quantifizieren. Aufgrund der ähnlichen Absorptionseigenschaften von Resazurin und Resorufin, Absorption erfordert Messungen mit MHK - Bestimmung unter Verwendung von zwei verschiedenen Wellenlängen und komplexe Berechnungen 15. Daher ist die beste Methode , unter Verwendung von Fluoreszenz - 530- bis 560-nm - Anregungswellenlängen und eine 590-nm - Emissionswellenlänge zu messen, wie in 15 die Herstellerliteratur beschrieben.

4 stellt eine mögliche Quelle für mangelnde Übereinstimmung mit multiday Inkubationen verbunden , die Screening - Ergebnisse drastisch verändern könnte. Durch unsachgemäßes Befeuchten des Inkubators 37 ° C für dieses Experiment verwendet, Vertiefungen auf den Rand des p lates litt deutlich mehr Verdunstung. Alle 15 DMSO-behandelten Vertiefungen sollen identisch sein, aber die Brunnen entlang der linken und oberen Kanten hatte Volumen reduziert. Diese Vertiefungen erscheinen auch verschiedene Farben als die anderen DMSO-behandelten Vertiefungen in der Mitte der Platte zu haben. Die gleiche Unbeständigkeit kann auch in 2,5 ug / ml Apramycin-behandelten Vertiefungen beobachtet werden. In diesem Fall würde das reduzierte Volumen führt auch zu einer quantitativen Messung mit einem Spektrophotometer und Fluorometer. Die Verdampfung wird signifikant für alle Experimente mit längeren Inkubationszeiten, so Pflegezentren getroffen werden müssen halten gut befeuchtete diese Quelle der Inkonsistenz zu vermeiden.

Figur 1: Verfahren Schema. Diagramm, das Testschema für 3 getrennten Module des Hochdurchsatz-Screening-Systems. _upload / 55273 / 55273fig1large.jpg“target = "_ blank"> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2: Repräsentative Daten aus einer intrazellulärer zur Prüfung der Wirksamkeit von Rifampicin bei der Beseitigung von M. tuberculosis innerhalb THP-1 - Zellen. (A) Diagramm der mittleren Lumineszenz Lese (in relativen Lumineszenz - Einheiten) für jede Behandlung (Rifampicin) Konzentration. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung des Mittelwerts für jede dreifache Ausfertigung. (B) Graph der berechneten prozentuale Verringerung der Lumineszenz , die durch eine Behandlung von Rifampicin verursacht, wobei höhere Werte eine größere Wirksamkeit anzuzeigen. Das 90% Hemmkonzentration (IC 90) , ist in diesem Fall irgendwo zwischen 0,01 und 0,1 ug / ml.nk "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3: Repräsentative Daten aus einer Zytotoxizität (MTT) Assay die toxischen Wirkungen der Verbindung G1-1H auf Differenzierte THP-1 - Zellen untersuchen zu. Graph der berechneten „Prozent der Kontrolle“ Werte für jede Konzentration der Behandlungsverbindung G1-1H, wobei höhere Werte gesünderen THP-1-Zellen an. Der IC 50 ist in diesem Fall irgendwo zwischen 10 und 30 & mgr; M. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4: Repräsentative Daten aus einer Resazurin - Assay zum Untersuchen Sie die EIRKSAMKEIT von Apramycin bei M. tuberculosis Hemmen In-Brühe. Nur qualitative Daten werden in der Biosicherheitsstufe 3 (BSL3) Labor aufgrund von Gerätebeschränkungen in diesem Fall gesammelt. Das Foto zeigt einen Teil einer 96-Well - Platte , die mit M. tuberculosis entweder DMSO behandelt oder unterschiedliche Mengen an Apramycin. Der DMSO-behandeln Wells zeigte eine Umwandlung von Resazurin Resorufin, wie durch die Farbumwandlung von blau nach rosa angegeben. Die Apramycin behandelten Proben unterzog sich deutlich die Farbumwandlung unter 5 & mgr; g / mL. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Tabelle 1: Rohdaten aus der Luciferase - Assay zur Bestimmung der intrazellulären ICS 90 von Rifampicin.

Tabelle 2: Rohdaten aus der MTT - Assay zur Bestimmung der Zytotoxizität von Testverbindung G1-1H bei Different Konzentrationen.

Die Autoren erklären, dass es für diese Arbeit keine konkurrierenden finanziellen Interessen gibt.