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Methodenartikel

Messen und Ändern von Mating Antrieb in Male

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DOI:

10.3791/55291

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15. Februar 2017

 ,  ,  , 
1F.M. Kirby Neurobiology Center, Boston Children’s Hospital, 2Harvard NeuroDiscovery Center, Harvard Medical School, 3Department of Neurobiology, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt einen Verhaltenstest , die männliche Paarungs Laufwerk verwendet in Drosophila melanogaste r Motivation zu studieren. Mit dieser Methode können die Forscher fortgeschrittene Fliegenneurogenetischen Techniken verwenden, um die genetischen, molekularen aufzudecken und zellulären Mechanismen, die diese Motivation zu Grunde liegen.

Zusammenfassung

Trotz jahrzehntelanger Forschung, bleiben die neuronalen und molekularen Grundlagen der motivierenden Staaten mysteriös. Wir haben vor kurzem eine neue, reduktionistische und skalierbares System für eingehende Untersuchung der Motivation zur Aufnahme der Antriebs der männlichen Drosophila melanogaster (Drosophila) verwenden, werden die Methoden , für die hier Detail , das wir. Das Verhaltensparadigma Zentren auf der Erkenntnis, dass männliche Gegenplatte neben Fruchtbarkeit im Laufe von wiederholten Paarungen ab und erholt sich über ~ 3 d. In diesem System konvergieren die mächtigen neurogenetische Werkzeuge zur Verfügung, in der Fliege mit dem genetischen Zugänglichkeit und vermeintlichen für das Sexualverhalten zur Verfügung Schaltplan. Diese Konvergenz ermöglicht eine schnelle Isolierung und Befragung von kleinen neuronalen Populationen mit spezifischen Motivations Funktionen. Hier stellen wir ausführlich die Planung und Ausführung des Sättigungs Assay, der verwendet wird, zu messen und Balz Motivation in der männlichen Fliege verändern. Mit dieserTest zeigen wir auch, dass niedrige männliche Paarungs Antrieb durch die Stimulierung dopaminergen Neuronen überwunden werden können. Der Sättigungs Test ist einfach, kostengünstig und robust gegenüber Einflüssen von genetischen Hintergrund. Wir erwarten, dass das Sättigungs Test viele neue Einblicke in die Neurobiologie der Motivationszustände zu erzeugen.

Einleitung

Die Arbeit in Drosophila hat tief und Pionier Einblick in viele biologische Phänomene zur Verfügung gestellt, einschließlich der Art des Gens 1, Prinzipien der Embryonalentwicklung 2, zirkadianen Rhythmen 3 und die Entwicklung und die Verdrahtung des Nervensystems 4, 5, 6. Motivation bleibt weit weniger gut als diese Phänomene zu verstehen, vielleicht wegen der Einschränkungen auf den Systemen, die bisher untersucht wurden. Motivation in der Fliege wird im Rahmen des Hungers in erster Linie untersucht, die durch viele Herausforderungen mit sich bringt, um ihre verschwindend klein Nahrungsaufnahme pro Fütterung Kampf und Exoskelett, die deutliche Zeichen für eine Fettablagerung ausschließt. Folglich besteht ein Bedarf, die Systemen zu erweitern Motivation in the fly zu studieren.

Wir beschreiben eine Verhaltens Rahmen für die Untersuchung von zusammenpassenden Antriebs inDrosophila. Dieses System nutzt die neurogenetischer Werkzeuge im fly sowie die Zugänglichkeit 7, 8, 9, 10, 11, 12 und der putative Connectome seiner geschlechtsdimorphischen Schaltung 8, 13. Darüber hinaus viel von der angeborenen 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 und erlernten 22, 23, 24 sensomotorischen Schaltung Steuerung Balz wurde im Detail ausgearbeitet, eine seltene Gelegenheit,zu finden, trifft die genaue Schaltungsknoten, auf die Motivation. Vor kurzem berichteten wir , dass in der Fliege, wie beim Menschen, Dopaminspiegel 25 bis Paarung Antrieb von zentraler Bedeutung sind, 26, 27. Wir haben genetische Zugang zu den relevanten Dopamin produzierenden gewonnen und Empfangen von Neuronen in der Fliege, die Erleichterung detaillierte Molekular- und Circuit-Level - Analysen dieser konservierten Phänomen der Assays nutzen wir hier 25 beschreiben.

Wir fügen den Verhaltenstests in Zhang et al. 25 eine neue Wohnung Verhaltens Arena , die Video - Scoring ermöglicht, die wir eine 2-dimensionale (2-D) Sättigungs Test, eine wichtige Verbesserung gegenüber früheren Methoden aufrufen. Folglich ist der neue Test skalierbarer und quantifizierbar, und daher besser geeignet für die genetische Screens von Genen und in der Motivation beteiligten Neuronen. Wir verwenden diese neuen Tests, zusammen mit der Balz-Assays und neurogetische Manipulationen, zu zeigen, wie Paarung Antrieb in der Fliege zu messen und zu verändern.

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Protokoll

Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung (§§ 1 - 3), Durchführung (Abschnitt 4) und Analyse (Abschnitt 4) von 2-D-Sättigung-Assays. Dann dopaminerge Stimulation als Beispiel, Abschnitt 5 zeigt, wie thermogene Stimulation zu kombinieren mit 2-D-Sättigungsassays hypersexuality zu induzieren. Abschnitt 6 beschreibt drei Möglichkeiten, um die Ergebnisse der 2-D-Sättigungstests zu verifizieren. Schließlich Abschnitt 7 zeigt, wie die Erholung der Paarung Antrieb in männlichen Fliegen zu messen.

1. Die Herstellung von 8- und 32-Kammer Behavioral Arenas

HINWEIS: Jede Verhaltens Arena besteht aus mehreren Schichten aus lasergeschnittenen Kunststoffplatten zusammengehalten durch Sechskantschrauben und Flügelmuttern an jeder der vier Ecken (1A).

  1. Fabrizieren die Schichten der Arena. Fabrizieren jede Schicht eine Laserschneider Blätter aus Acrylkunststoff in die entsprechende Form zu schneiden (siehe 1B, 1C für Produkte).
    HINWEIS: Viele Forschungs Institutions Laserschneider in ihren Maschinenhallen oder Hersteller Plätze. Wenn das Organ den Zugang zu einem Laserschneider hat, fahren Sie mit den folgenden Schritten. Wenn nicht, folgen Sie den Anweisungen in Schritt 1.2 statt.
    1. Für jede Schicht, öffnen Sie das Design-Muster in der Software des Laser-Cutter.
      HINWEIS: Die Entwürfe können in entsprechend benannten PDF - Dateien (zB 8-Kammer - Arena - Schicht 2 - Doors.pdf) zu finden in ergänzendes Material 1. Diese Datei enthält auch Anmerkungen für die Art von Kunststoff (zB verwendet werden, 1 / 8 Zoll (dh 3,175 mm) klar Acryl). Die genaue Dicke jeder Schicht ist nicht kritisch. Die Hauptanforderung ist 0,12 Zoll (3 mm) oder mehr freier vertikalen Raum in den Kammern zu ermöglichen.
    2. Passen Sie die Lasereinstellungen (Power, Fokus, etc.) für die Art und Dicke der Kunststoff verwendet werden. Legen Kunststoff in der Laser-Cutter Bett und führen Sie den Laser-Cutter.
      HINWEIS: Diese Einstellungen weitgehend auf der Basis der Laser cutte variierenr Modell und die Stärke seines Lasers. Finden Sie die entsprechenden Einstellungen auf Basis von Erfahrungen aus der Vergangenheit oder indem Testschnitte auf Schrott Kunststoff. Die tiefen hexagonal Gravuren sind in das Design einbezogen werden die Sechskantschraubenköpfe zu versenken. Diese Funktion ermöglicht eine einhändige Anziehen der Flügelmuttern und ermöglicht die Arenen flach auf der Bank zum Ausruhen (ohne Schraubenköpfe vorsteht). Dennoch tiefe Gravuren machen, ist oft schwer zu erreichen, und zeitaufwendig, mit einem Laserschneider. Dieser Schritt ist optional und kann ohne Auswirkung auf die Verhaltensergebnisse übersprungen werden.
    3. Wenn die Türrahmen Schneiden (Layer 2, Abbildung 1A), ferner geeignete Lasereinstellungen zur Gravur der Kammernummern in das Design einbezogen werden (wie in 1B, 1C).
  2. Legen Sie eine Bestellung mit einem Online-Laserschneiden fabricator. Laden Sie alle PDF - Design - Dateien für die 8- und / oder 32-Kammer - Arena , und geben Sie den Materialtyp (zB 1/8 Zoll (dh 3,175 mm) clear Acryl), basierend auf den Anmerkungen in den Dateien. Die Ergebnisse werden angezeigt , wie in den 1B (8-Kammer - Arena) und 1C (32-Kammer - Arena).
  3. Montieren Sie Arenen mit vier Sechskantschrauben und vier Flügelmuttern ausrichten und halten zusammen , um die Kunststoffschichten (1A). Die Arenen erscheint , wie in Abbildung 1D, 1E (8-Kammer) und 1F, 1G (32-Kammer).
    HINWEIS: Die Nahrungsmittelwand (Schicht 4 in Figur 1A) nur dann für 2-D Sättigungsassays verwendet und in 32-Kammer - Arenen weggelassen, die in der Balz - Assays verwendet werden.

2. Nahrungszubereitung für 2-D Satiety Assay

Hinweis: Da ein 2-D-Sättigungstest 4,5 h reicht, fliegen Essen in der Arena verwendet wird Nahrung und Wasser zu versorgen. Dieses Protokoll verwendet, ist aber nicht beschränkt auf, die herkömmliche Maismehl-Agar Nahrungs fliegen.

  1. Teilweise montieren Sie die 2-D-Sättigungs Arena (8-Kammer) mit Schichten 3 bis 6und ziehen Sie es mit Flügelmuttern und Sechskantschrauben (Abbildung 1A für Schicht Zuweisungen sehen).
  2. Legen Sie frische fliegen Lebensmittel in einen sauberen, mikrowellengeeignet Flasche. Fügen Sie gerade genug Wasser , um die Unterseite der Flasche (2A) zu decken.
  3. Essen aus der Mikrowelle auf hoch für 30 - 45 s. Überprüfen Sie den Fortschritt und rühren alle 15 s , bis sie geschmolzen (2B). VORSICHT! Fly Essen leicht überkocht.
  4. Verwenden Sie ein abgestumpft 1000-ul Pipettenspitze (2C) zu langsam übertragen ~ 1 ml geschmolzen Lebensmittel in jede Kammer (2D).
  5. Lassen Sie Lebensmittel bei 4 ° C für ~ 10 min (Abbildung 2E) wieder zu verfestigen , bevor vollständig in die Arena (2F) zusammenbauen.
  6. Verwenden Sie den ausgefüllten Arena für Experimente (siehe Abschnitt 4) oder bei 4 ° C.
  7. Lagern Sie das übrig gebliebene Essen bei 4 ° C und Wiederverwendung.

3. Vorbereitung Virgin Frauen für Verhaltenstests

HINWEIS: 2-D Sättigungs Assays verwenden eine große Anzahl von jungfräulichen weiblichen Fliegen (~ 120-160 für eine vollständige Verhaltens Arena), die schwierig mit Standardmethoden zu sammeln. Dieser Abschnitt beschreibt einen alternativen Ansatz mit dem hs-hid Transgen auf dem Y - Chromosom 28, die erfolgreich 25, 29 bei der Balz - Assays verwendet wurde. Die Lager verwendet weiß-eyed jungfräulichen Weibchen zu erzeugen, hat den Genotyp w1118 (X) / hs-hid (Y); + / +; + / + (Bloomington Artikelnummer 24638).

  1. Flip fliegt in eine neue Flasche einmal 20-50% der Puppen haben geschlüpften (siehe 3A zum Beispiel) , und es gibt genug Männer (5-10) , um die Lager zu propagieren.
  2. Hitzeschock die ursprüngliche Flasche in einem 37 ° C heißen Wasserbad 1 h ausreichend aktivieren hs-hid Männer zu töten (3B). Nach dem Hitzeschock, wird nur Frauen aus diesen Flaschen schlüpfen und so jungfräulich bleiben, bis dieAssays.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher , dass alle Seiten der Flasche gleichmäßig erwärmt (siehe 3A für Wasserlinie). Verlängern Sie diese Zeit für bis zu 2 h, wenn 1 h nicht ausreicht, um alle Männer einschläfern.
  3. Isolieren gesammelter Weibchen für mindestens 3 d vor Experimenten zu gewährleisten , dass sie alt genug sind , um sexuell empfänglich 25, 29 zu sein.
    HINWEIS: Y-Chromosom-weniger Männchen gelegentlich aus diesem Lager entstehen. Diese Männer haben weiße Augen und sind unabhängig von den Hitzeschock, weil sie nicht das hs-hid Transgen enthalten. Sie können nicht Spermien produzieren und daher nicht Empfänglichkeit bei Frauen verringern kann 30, 31.

4. Performing und Scoring 2-D Satiety Assays

HINWEIS: Es ist wichtig, das Alter des Mannes zu steuern, fliegt als Gegen Antrieb ändert sich mit dem Alter. Dieses Protokoll verwendet Männer , die 3 - 4 d alt 25 .

  1. Stellen Sie den Inkubator auf die gewünschte Temperatur (zB 23 ° C für Standard-, RT Experimente) und Luftfeuchtigkeit (> 30%). Für Inkubatoren ohne Feuchtigkeitskontrolle, eine Tasse Wasser in den Inkubator verlassen, ist ausreichend.
  2. Legen Sie eine 2-D-Sättigungstest Arena im Inkubator für ~ 30 min, um die Temperatur zu äquilibrieren und zur Vermeidung von Kondensation in den Kammern im Verlauf des Experiments. Die Drehtüren sollten in der offenen Position sein.
  3. Verwenden Sie 32 eine Fliege Aspirator 15 abzusaugen - 20 jungfräulichen Weibchen in jede Kammer der Arena (Abbildung 4).
    Hinweis: Es ist wichtig, dass die Weibchen und Männchen sind am selben Tag wie dem Assay nicht anästhesiert. Nach unserer Erfahrung kann die weibliche Empfänglichkeit und männliche Paarungsverhalten dabei auswirken.
  4. Absaugen 1 Männchen in jede Kammer.
  5. Legen Sie die geladenen Arena im Inkubator unter einem Standard - Consumer - Camcorder (Abbildung 5) und Film für 4,5 h.
  6. Ergebnis Videos mit der Feststellung , wenn jeder männliche fliegen beginnt und endet jeder Paarung (dh Kopulation). Dieser Schritt kann auf den ersten zeitraubend sein. Mit etwas Übung kann man die Videos bei 5x Geschwindigkeit oder höhere Punktzahl.
    HINWEIS: Da fliegt für ~ 20 min bei ~ 23 ° C (kürzere Dauer bei höheren Temperaturen) paaren 29, kann man die ersten 15 Minuten von jeder Paarung überfliegen.
  7. Nach der Anmeldung alle Paarungszeiten, die Anzahl der Paarungen für jede Fliege Summe (siehe repräsentative Ergebnisse).
  8. Verwenden Sie den bereitgestellten Code ein Ethogramm zu erzeugen. Siehe Supplemental Material 2 für den Code, Anweisungen und Beispieldaten.
  9. Verwenden Sie CO 2 oder kalten Temperaturen , um die Fliegen zu betäuben , bevor sie zu entfernen.

5. Mit thermogene Manipulation Satiety Reverse in 2-D Satiety Assays

Hinweis: Dieses Protokoll prüft, ob thermogene Stimulation einer definierten neuronalen Population Sättigung zu überwinden. Die experimentelle flies der wärmeempfindlichen Kationenkanal TRPA1 in definierten Populationen von Neuronen (UAS-TRPA1) auszudrücken. Die Schritte gelten unten auf die Stimulation von dopaminergen Neuronen (TH-Gal4), die Aufnahme der Antriebs 25 zu fördern gezeigt wurden. Diese Schritte können in Verbindung mit anderen neuronalen Treiber verwendet werden, um andere Populationen zu entdecken, die Aufnahme der Antriebs fördern.

  1. Um thermogenePaarungsVerhalten in satiated Fliegen induzieren, um die Temperatur im Inkubator erhöhen ( zum Beispiel von 23 ° C bis 28,5 ° C) nach einer vollständigen 4,5 h 2-D Sättigungs Experiment abgeschlossen.
  2. Nachdem der Inkubator die gewünschte Temperatur erreicht, Wärme Stimulation fortzusetzen und die Paarungen Score (dh. Paarungen) der Männchen für 1 h (Repräsentative Ergebnisse sehen).
    HINWEIS: Die Temperatur und die Dauer der Stimulation auf dem Genotyp variieren kann, so ist es notwendig, die optimalen Bedingungen zu beheben, die Reizüberflutung von Neuronen zu verhindern, während immer noch eine robu Herstellungst Phänotyp.

6. Mit Umwerbung und Locomotion Satiety zu überprüfen:

HINWEIS: In diesem Abschnitt werden drei optionale Methoden, die verwendet werden können, um die Ergebnisse von 2-D-Sättigung Assays zu überprüfen. Sie sind nicht für jeden Test erforderlich.

  1. Verwenden Sie Balz Assays Sättigung zu überprüfen.
    1. Absaugen eine männliche und eine weibliche Jungfrau in jede der 32 Kammern in einer Balz-Arena.
    2. Film die Fliegen für ~ 20 min einen Standard Consumer-Camcorder verwenden.
    3. Ergebnis der Balz - Index (CI) zu quantifizieren Balz 25; dies ist der Bruchteil der Zeit Balzverhalten verbrachte Durchführung (Singen, folgende usw.) und Paarung (dh Kopulation) über 5 min Fenster. Dieses Fenster geht von der ersten Instanz von Balzverhalten. Wenn ein Mann nicht fliegen Balz in den ersten 15 Minuten beginnen, seine CI ist 0. Naïve WT fliegt ein CI größer als 0,9 zeigen sollte, während ein voll gestillt Fliege ein CI b haben sollteelow 0,2. Andere Balz Maßnahmen können auch 23 in Betracht gezogen werden, 33.
  2. Scoring Balz in 2-D Sättigungsassays
    1. Score die Menge an Zeit , die eine männliche fly aufwendet, über einen Zeitraum von einer 2-D Sättigungs Assay courting (beispielsweise der ersten h). Balz wird als männlich definiert jeden Schritt des Rituals Durchführung (Gesang, folgende, etc.). Anders als in Abschnitt 6.1.3, ist dieser Schritt nicht Zeit das männliche Paarungs verbringt umfassen.
    2. Teilen Sie die Balz Zeit oben durch die Gesamtzeit der Männchen war nicht Paarung (dh nicht kopulierenden) im gleichen Zeitraum. Wenn zum Beispiel ein männlicher Plätze für 15 min und 20 min für mates über der ersten h fliegen, ist das Verhältnis 15 min / (60 min - 20 min) = 0,375. Das Verhältnis wird als "Fraktion der nonmating Zeit in der Balz" gezeigt in Repräsentative Ergebnisse.
  3. Mit Fortbewegung Assay Erschöpfung zu bewerten
    1. zusammenbauen teilweise die 32-Kammer-Arena mit allen Teilen, aber die Kontrastfolie.
    2. Absaugen eine männliche Fliege (keine weibliche Fliegen) in jede der 32 Kammern in einer Balz-Arena.
    3. Film die Fliegen für ~ 10 min einen Standard Consumer-Camcorder verwenden.
    4. Verfolgen Sie die Fliegen mit dem MTrack2 Plugin in ImageJ (http://valelab.ucsf.edu/~nstuurman/ijplugins/MTrack2.html).

7. Nach der Paarung Laufwerk Wiederherstellen von 2-D Satiety Assay

  1. Führen Sie eine 2-D-Sättigung Test, wie in Abschnitt 4 beschrieben, aber aspirieren das Männchen fliegt am Ende des Tests aus.
  2. Isolierung der männlichen Fliegen bei 23 ° C für die gewünschte Anzahl von Tagen.
  3. Führen Sie eine 2-D - Sättigungstest mit den gewonnenen Männern und sammle ihre Paarungen (dh Paarungen) für nur 1 h (siehe Repräsentative Ergebnisse).

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Ergebnisse

Zur Charakterisierung Drosophila Gegen - Antrieb, 3 Tage alten, WT Canton-S Männer wurden in einem 2-D - Sättigungstest getestet. Im Laufe des Tests (4,5 h), Männchen im Durchschnitt 4,8 ± 0,3 paaren (Mittelwert ± Standardabweichung vom Mittelwert, SEM) Zeiten. Paarungen initiieren meist in den ersten 2 h (78%) (6A, 6B) und weniger häufig , wie der Test fortschreitet (6A, 6B). Dieser Rückgang ist auf den Mangel an passenden Partner nicht durch (...

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Diskussion

Motivation Zustände können gesättigt, aufrechterhalten werden und erholte 34. Wir stellen eine 2-D Sättigungs Assay, schnell und robust all dieser Aspekte der Paarung Antrieb im fly misst. Dieser Assay eröffnet die Möglichkeit, fortgeschrittene fly genetische Manipulationen der Verwendung der molekularen und Schaltungskomponenten eines motivierten Verhalten zu untersuchen.

Der Sättigungs Assay beruht auf der Fähigkeit des männlichen erfolgreich vor Gericht und kopulie...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren danken Mike Crickmore, Dragana Rogulja und Michelle Frank für ihre Kommentare zum Manuskript. Pavel Gorelik leistete technische Unterstützung bei der Herstellung der Verhaltensarenen. Diese Arbeit wurde im Labor von Mike Crickmore durchgeführt und wird auch von der Whitehall Foundation (Principal Investigator: Dragana Rogulja) unterstützt. S.X.Z. ist Stuart H.Q. und Victoria Quan Fellow an der Harvard Medical School.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1/16 Zoll klares AcrylMcMaster-Carr8589K12Wird zur Herstellung von Arenen verwendet; siehe Zusatzmaterial 1 für Designs.
1/8 Zoll klares AcrylMcMaster-Carr8589K42Wird zur Herstellung von Arenen verwendet; siehe Zusatzmaterial 1 für Designs.
3/16 Zoll klares AcrylMcMaster-Carr8560K219Wird zur Herstellung von Arenen verwendet; siehe Zusatzmaterial 1 für Designs.
1/32 Zoll schwarzer DelrinMcMaster-Carr8575K132Wird zur Herstellung von Arenen verwendet; siehe Zusatzmaterial 1 für Designs.
Sechskantschrauben, 1 Zoll lang (50x)McMaster-Carr92314A115 Wird verwendet, um Arenen zu bauen. Kann durch 3/4-Zoll-Schrauben (92314A113, McMaster-Carr) für 32-Kammer-Arenen ersetzt werden.
Rändelmuttern (25x)McMaster-Carr92741A100Wird zur Herstellung von Arenen verwendet. Kann durch normale Sechskantmuttern (90480A005, McMaster-Carr) ersetzt werden.
CamcorderCanonVixia HF R700Kann durch jeden Consumer-Comcorder ersetzt werden.

Referenzen

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