Abstract
Detta dokument redovisar en mikroflödessystem enhet tillverkad av polydimetylsiloxan (PDMS) med en inbäddad polykarbonat (PC) tunnfilms att studera cell migration enligt kombinationer av kemiska och syre gradienter. Både kemiska och syre gradienter kan kraftigt påverka cellmigration in vivo; men på grund av tekniska begränsningar, mycket lite forskning har utförts för att undersöka deras effekter in vitro. Anordningen utvecklats i denna forskning utnyttjar en serie av serpentin-formade kanaler för att generera de önskade kemiska gradienter och utnyttjar en rumsligt begränsad kemisk reaktion metod för syre gradient generation. Riktningarna för de kemiska och syre gradienter är vinkelräta mot varandra för att möjliggöra enkel migration resultat tolkning. För att effektivt generera syre gradienter med minimal kemikalieförbrukning, är den inbyggda PC tunn film används som en gas diffusionsbarriär. Den utvecklade mikrofluidikanordningkan påverkas av sprutpumpar och placeras i en konventionell cellinkubator under cellmigrations experiment för att möjliggöra inställnings förenkling och optimerade cellodlingsbetingelser. I cellförsök har vi använt enheten att studera migrering av adenocarcinomic mänskliga alveolära basal epitelceller, A549, enligt kombinationer av kemokin (stromal derived faktor, SDF-1α) och syre gradienter. De experimentella resultaten visar att anordningen stabilt kan alstra vinkelräta kemokin och syre gradienter och är kompatibel med cellerna. Migrationsstudieresultaten tyder på att syre gradienter kan spela en viktig roll i att vägleda cellmigration och cell beteende under kombinationer av gradienter kan inte förutsägas från de under enstaka gradienter. Anordningen ger ett kraftfullt och praktiskt verktyg för forskare att studera interaktioner mellan kemiska och syre gradienter i cellkultur, som kan främja bättre studier cell migration som mer in vivo -liknande microenvijöer.
Introduction
Den rumsliga fördelningen av lösliga faktorer och syrespänningen kan reglera ett antal viktiga cellulära funktioner in vivo 1, 2, 3, 4. För att bättre kunna undersöka deras effekt på celler, är en in vitro cellkultur plattform förmåga att stabilt alstra kemiska och syre gradienter högst önskvärt. Olika lösliga faktorer spelar nyckelroller i biologiska aktiviteter och påverka cellbeteende. Nyligen, på grund av utvecklingen av mikroflödesteknik, ett antal mikroflödessystem enheter kan stabilt generera kemiska gradienter har utvecklats för att studera cell migration 5. Dessutom har flera studier också visat att det är nödvändigt att syrespänningen för in vitro-cellkulturer 6, 7, 8. Dock,kontroll av syrgastryck för cellodling bygger huvudsakligen på direkt kemisk tillsats för syreuppsamlande eller cell inkubatorer med tryck gasflaskor. Direkt kemisk tillsats förändrar cellkulturmediet och påverkar de cellulära svar. Syrekontroll inkubatorer kräver särskild inkubator utformning, exakt gasflöde kontroll, och en stor volym av kvävgas i syfte att uppnå hypoxi förhållanden. Dessutom är det omöjligt att styra den geografiska fördelningen av syre med hjälp av denna inställning, som hämmar den cellulära beteende studien under olika syretryck och gradienter. För att övervinna dessa begränsningar, har ett antal mikroflödessystem enheter har utvecklats för att generera syre gradienter för cellodlingstillämpningar 9. Dock de flesta av dem drivs med gaser under tryck, vilket kan orsaka avdunstning och bubbel generationens problem. Därför kräver de ofta sofistikerad instrumentering och kan inte vara tillförlitliga för långsiktig cellodling studies.
För att övervinna de utmaningar och att ytterligare studera samspelet mellan kemiska och syre gradienter för cellmigration, har vi utvecklat en mikroflödessystem cellodlingsanordning tillverkad av polydimetylsiloxan (PDMS) med en inbäddad polykarbonat (PC) tunn film 10. Anordningen är sammansatt av två mikroflödeskanallager separerade av en PDMS-membran. Det översta skiktet är ett PDMS-PC skikt för syre gradient generering; bottenskiktet är gjort av PDMS för kemisk gradient generering och cellodling. Enheten kan samtidigt generera vinkelräta kemiska och syre gradienter utan att använda gasflaskor och sofistikerade flödeskontroll system. I anordningen ger PDMS stor optisk transparens, gaspermeabilitet, och biologisk kompatibilitet för cellodling och bildbehandling. Den inbäddade PC filmen fungerar som en gas diffusionsbarriär för effektiv syrespänningskontroll. I mikroflödeskanalen, använde vi en serie av serpentin-formad kanals för att generera kemiska gradienter. Designen har i stort sett utnyttjas för att generera kemiska gradienter i mikroflödessystem enheter för olika applikationer på grund av dess pålitlighet och lätt experimentuppställning. Dessutom kan den kemiska lutning profiler utformas genom att variera kanalgeometrier i förväg med numerisk simulering. För syre lutning generation, vi drog fördel av den rumsligt begränsade kemisk reaktion metod som tidigare utvecklats i vårt labb 10, 11, 12. Syret kan rensas från de utvalda områdena utan kväve rensning. För praktisk användning i biologiska labs, är hela experimentuppställning kompatibel med konventionella cellodlings inkubatorer. Genom att integrera dessa metoder, kan vi samtidigt skapa stabila kemiska och syre gradienter utan bulk gasflaskor och sofistikerade instrument för att studera cell migration.
Protocol
1. Tillverkning av mikroflödessystem enhet
OBS: Hela mikroflödessystem enheten är tillverkad med hjälp av mjuk litografi replika gjutprocessen 13.
- Tillverkning av formar för PDMS lager i mikrofluidanordningen
- Utforma mikroflödeskanalmönster med hjälp av kommersiellt tillgängliga illustration eller ritprogram. Skicka filen till ett företag med hög upplösning transparens fotomasker utskrift 14.
- Rena kiselskivor med aceton (≥99.5%), isopropylalkohol (IPA; ≥99.9%) och buffrad oxidetsning (BOE; 6: 1 NH 4 F.HF). Skölj med avjoniserat (DI) vatten och dehydratisera wafern med ett kväve pistol.
- Spin päls ungefär 20 g negativ ton fotoresist, SU-8 2050 på skivorna vid 500 rpm under 15 sekunder och sedan 2000 rpm under 30 sek.
OBS: spinnbeläggning villkor bör ge SU-8 2050 fotoresistskikt med en tjocklek av ungefär 75 | j, m på de tunna skivorna efter optisk litografi. - Mjuk baka skivorna på en 65 ° C värmeplatta för 3 min och sedan vid 95 ° C i 9 min. Efter den mjuka baka, utsätta skivorna med hjälp av en mask Aligner med designade öppenhet masker under UV-ljus; den totala exponeringen energi bör vara cirka 300 mJ / cm2. Efterexponerings baka (PEB) rånen vid 65 ° C under 2 minuter och därefter vid 95 ° C under 7 min.
- Efter PEB, sänk skivorna i SU-8 utvecklare med stark omröring eller i ett ultraljudsbad (37 kHz och 180 W effektiv ultraljudseffekt) under 7 min. Skölj skivan med aceton och IPA för avlägsnande av rest SU-8.
- Placera skivan och 100 ul av silan (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltrichlorosilane) i en 6 cm diameter Petri-skål i en exsickator kopplad med ett membran vakuumpump för styckeytan silanisering för att förhindra oönskad bindning. Slå på pumpen under 15 minuter, stängaOch försegla exsickatorn med ett vakuum under 30 min.
- Ta silaniserade rån ur exsickatorn och tejpa dem till 15 cm diameter petriskålar för följande mjuk litografiprocess:
- Tillverkning och montering av PDMS skikt
- Framställning av PDMS pre-polymer
- Blanda PDMS monomer (bas) och härdaren vid ett 10: 1 förhållande (volym / volym). Avlufta blandningen i exsickatorn setup för 60 min.
- Tillverkning av PC-inbäddade toppskikt
- Överföring 2 g av PDMS prepolymerpartiklarna har laddats in i formen med de toppskiktsfluidkanalmönster för att göra ett tunt skikt av PDMS. Placera formen i exsickatorn installationen att avgasa PDMS under 60 minuter.
- Placera formen över natten i en 60 ° C ugn för PDMS härdning. Se till att formen är på ett horisontellt plan.
- Kyla ned formen till rumstemperatur. Häll ytterligare 13 g PDMS pre-polymer på formen och avlufta PDMS i the exsickatorn setup för 60 minuter.
- Långsamt bädda in en 1 mm tjock PC film i friska PDMS lager som en gas diffusionsbarriär; utvisa eventuella bubblor om det behövs.
- Sätt formen natten i C ugn i 60 °, och se till att det är på ett horisontellt plan.
- Kyl ner de härdade PDMS till rumstemperatur. Skär enheten med en skalpell till ett område på ungefär 5,5 x 5 cm 2, som kan täcka alla kanalmönster, och dra av PDMS platta från formen.
- Slå hål för inlopp och utlopp med hjälp av en 2 mm diameter biopsistans. Förvara fabricerade topp PDMS-PC skiktet bort från omgivande damm för senare montering.
- Tillverkning av botten PDMS skiktet
- Häll 11 g av PDMS pre-polymer på formen för bottenskiktet. Placera formen i exsickatorn att avgasa PDMS i 60 min. Hålla formen över natten i en 60 ° C ugn för att härda PDMS. Se till att den ligger på ett horisontellt plan.
- Svalna the PDMS till rumstemperatur. Skär anordningen till ett område av ca 5,5 x 5 cm 2, som kan täcka alla kanalmönster, och skala bort det av formen. Förvara fabricerade botten PDMS lagret bort från omgivande damm för senare montering.
- Tillverkningen av PDMS-membran
- Spin päls ungefär 4 g PDMS pre-polymer på en silaniserad tom skiva vid 100 rpm under 90 sekunder och sedan 3000 rpm under 4 sekunder. Baka spin-belagda skivan i en 60 ° C ugn över natten.
- Sammansättningen av anordningen
- Placera fabricerade PDMS-PC översta lagret och skivan med spin-belagda PDMS membran i en O 2 plasma ytbehandling maskin med bindningsytorna uppåt. Behandla PDMS ytor med 90 W av O2 plasma för 40 sek.
- Binda det översta lagret på PDMS membranet direkt efter O 2 plasma ytbehandling av. Placera en vikt (ca 600 g) ovanpå de bundna skikten och lägg dem i en60 ° C ugn över natten för att främja bindning.
- Kyla ner de bundna skikten till rumstemperatur och skära membranet bundet till toppskiktet med en skalpell till ett område av ca 5,5 x 5 cm 2, som kan täcka alla kanalmönster. Dra av bundna strukturen från kiselskivan och stansa hål i inlopp och utlopp för den kemiska gradienten kanal med en 2 mm diameter biopsistans.
- Placera den membranbundna toppskiktet och fabricerade PDMS bottenskiktet i O 2 plasmaytbehandlingsmaskin, med bindningsytorna som vetter uppåt, för att aktivera de PDMS ytor med hjälp av plasma vid 90 W under 40 sekunder.
- Fästa de övre och nedre skikten med varandra för bindning direkt efter ytbehandlingen. Placera en vikt (ca 600 g) ovanpå hela bundna enheten och placera den i en 60 ° C ugn över natten.
- Ta hela fabricerade anordningen ut ur ugnen och kyla ner till rumstemperatur.
- Framställning av PDMS pre-polymer
2. Mikroflödes cellmigrationsassay
OBS: I detta dokument använder vi en vanligt förekommande cellinje adenocarcinomic human alveolär basala epitelceller (A549), och en kemokin, stromal derived factor (SDF-1α), som exempel. För forskare som arbetar med andra celler och kemokiner, justera experimentella processer i enlighet därmed.
- Dag 0: Cell förberedelse
- Kultur beståndet av A549-celler i komplett tillväxtmedium innehållande DMEM F12 L-glutamin substitut, 10% (volym / volym) fetalt bovint serum (FBS) och 1% (volym / volym) Antimicrob-antimykotisk lösning. Subkultur genom dissociation med 0,25% trypsin-EDTA.
- Förbereda cellsuspensioner för experimenten genom centrifugering dissocierade celler vid 140 xg under 3 min vid rumstemperatur. För mikrofluidanordningen experimenten, räkna cellerna med en hemocytometer och utsäde minst 1 x 10 6 celler i en T75-flaska med 10 ml fullständigttillväxtmedium.
NOTERA: Alla cellodlingsprocesser utförs i en inkubator med en 37 ° C och 5% CO2 atmosfär.
- Dag 1: Enhets preparat
- Placera enheten i O 2 plasma maskin och behandla det med O 2 plasma vid 90 W under 40 sekunder för att göra mikroflödessystem kanal ytor hydrofila.
- Omedelbart efter ytbehandling, installera två 14 G trubbiga nålar genom att direkt föra in nålar i hål de två mm diameter stansade i PDMS lagret vid kemisk gradient kanalinlopp. Kontrollera att nålarna inte blockera mikroflödessystem kanaler. Rita 0,8 ml DDH 2 O med användning av en 1 ml spruta med en trubbig 14 G-nål. Injicera DDH 2 O i den kemiska gradienten kanalen från utloppet tills vattnet rinner ut från båda nålar på inloppen.
- Förbereda 1 ml av 50 pg / ml fibronektin lösning genom utspädning fibronektin lager med Dulbecco & #39; s fosfatbuffrad saltlösning (DPBS).
- Ingjuta fibronektin lösning från utloppet av den kemiska gradienten kanalen med användning av en 1 ml spruta med en trubbig 14 G-nål till dess att lösningen strömmar ut från båda nålar vid inloppen.
- Inkubera hela anordningen över natten i en konventionell cellkultur inkubator.
- Dag 2: Cell sådd och mikroskopi avbildning
- cellsådd
- Aspirera mediet från de celler som odlades sedan dag 0 och tvätta cellerna med 5 ml DPBS 2 gånger. Aspirera DPBS, tillsätt 2 ml trypsin-EDTA, och inkubera cellerna i inkubator under 5 min för att lösgöra cellerna från kolvytan.
- Vänta tills cellerna lösgörs och suspenderades i lösningen och tillsätt 8 ml serumfritt medium (DMEM F12 + 1% (volym / volym) Antimicrob-antimykotisk lösning) till kolven. Överföra all vätska in i ett 15 ml koniskt rör och centrifugera det vid 140 xg under 5 min under rumstemperatur. Aspirera supernatanten efter centrifugering och tillsätt en lämplig mängd av det serumfria mediet för att göra den slutliga celldensiteten 1 x 10 6 celler / ml. Ta ut mikroflödessystem enhet beredd på Dag 1. Räkna celler med hjälp av en hemocytometer eller annan automatisk cellräkning instrument.
- Injicera serumfritt medium från utloppet av den kemiska gradienten kanalen med användning av en 1 ml spruta med en trubbig 14 G-nål till dess att mediet strömmar ut från båda nålarna vid inloppen. Injicera 200 ul av cellsuspensionen från utloppet av den kemiska gradienten kanalen.
- Observera cellodlingskammaren i anordningen under ett mikroskop för att bekräfta att cellerna har införts för att mikroflödeskanalen. Placera enheten i en fuktig behållare (t.ex. en plastlåda med DDH 2 O inuti) och förvara den på en cellkultur inkubator under 5 timmar för att främja vidhäftningen av cellerna på enheten ytan.
- Framställning av Reagmedelsingredienser för kemisk gradient generation
- Förbereda den kemiska (SDF-1α) vid den önskade koncentrationen (100 ng / ml) i serumfritt medium. Dra det serumfria medium med och utan den kemiska i två separata 3 ml sprutor anslutna till hög renhet slangen. Inrättat sprutorna på en sprutpump med en flödeshastighet av 1 | j, l / min för senare användning.
- Framställning av reagens för syre gradient generation
- Göra 15 ml 1 M NaOH-lösning och 15 ml av 200 mg / ml pyrogallol lösning. Rita NaOH och pyrogallol lösningar i två separata 15 ml sprutor anslutna till högrent PTFE slang och hög renhet slangar, respektive. Inrättat sprutorna på en sprutpump med flödeshastighet av 5 | il / min för senare användning.
- Mikroflödesinställningsanordning
- Efter 5 h inkubation ta hela enheten och placera den på en 15 cm diameter petriskål. Fäst enheten i petriskål med lim kitt. överförPetriskål till en levande cell imaging mikroskop i en inkubator.
- Anslut slangen från sprutorna för kemisk gradient generation till inloppen hos den kemiska gradienten kanalen. Anslut utloppet till slangen som leder till en avfallsbehållare. Slå på sprutpumpen med sprutorna för kemisk gradient generation.
- Anslut hög renhet slang från sprutor innehållande NaOH och pyrogallol till inloppen hos syre gradient kanalen. Anslut slangen till utloppet för att samla in avfall. Slå på sprutpumpen med sprutor för syre gradient generation.
- Tillsätt ca 15 ml DDH 2 O till petriskål för att hålla enheten återfuktad. Ställ in levande cell imaging mikroskop för tids förfallit bildfångst, och ta en bild var 15 min.
- cellsådd
- Dag 3: Datainsamling och analys
- Överför tagna bildfiler till en dator. Analysera bilder med hjälp av en öppen källkod bild enALYS programvara, ImageJ, med en open source plugin för manuell spårning (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html) och en fri kemotaxi Tool (http://ibidi.com/xtproducts / sv / Software-och-bildanalys / Manuell-bildanalys / Chemotaxis-och-migration-tool) 15, 16.
3. Karakterisering av gradienterna
OBS: De kemiska och syre gradienter kan karakteriseras före eller efter cellexperiment.
- Numerisk simulering av den kemiska gradienten
- Uppskatta laminärt flöde natur mikrofluidik använder beräkningsfluiddynamik (CFD) simulation.
- Experimentell karakterisering av syret gradient
- Framställa en syrekänslig fluorescerande färg, tris (2,2'-bipyridyl) rutenium (III) klorid-hexahydrat, lösning i vatten vid en koncentration av 5mg / ml.
- Dra det syrekänsliga färgämneslösningen i två separata 3 ml sprutor anslutna till hög renhet slangen. Inrättat sprutorna på en sprutpump med flödeshastighet på 1 | j, l / min (identiska med de flödeshastigheter som används för den kemiska gradienten generationen).
- Anslut slangen från sprutorna till inloppen hos den kemiska gradienten kanalen. Anslut utloppet till slangen som leder till en avfallsbehållare. Slå på sprutpumpen med sprutorna för kemisk gradient generation.
- Mäta fluorescensintensiteten med användning av ett inverterat fluorescensmikroskop med excitationsljuset passera genom en 470 ± 20 nm optiskt filter. Samla emissionsljuset genom ett 515 nm långpassemissionsfilter med användning av en kall CCD-kamera.
- Anslut hög renhet slang från sprutor innehållande NaOH och pyrogallol till inloppen hos syre gradient kanalen. Anslut slangen till utloppet för att samla in avfall. Slå på sprutpumpen med sprutor för syregradient generation.
- Samla fluorescensbilder av det syrekänsliga färgämnet som strömmar i cellodlingskammaren.
- Stoppa flödet av syre gradient generering och koppla ur alla slangar till syregenerekanalen. Ansluta hög renhet slangen från gasflaskorna till utloppet av syret gradient kanalen.
- Samla fluorescensbilder av det syrekänsliga färgämnet som strömmar i cellodlingskammaren när strömmande luft, rent kväve, och rent syre i slangen ansluten till syre gradient kanalen.
- Uppskatta syre gradienter genom att analysera fluorescensbilder med hjälp av Stern-Volmer ekvation enligt referenserna 10 och 11.
Representative Results
Fabricerade PDMS-PC hybrid mikroflödescellodlingsanordning. Fikon. 1 visar ett foto och en illustration av mikrofluidanordningen. Bottenskiktet innehåller fyra nivåer av serpentin-formade kanaler för att generera lösningar från reagenser som införs från två separata inlopp med sex olika blandningsförhållanden. Teoretiskt, de sex olika blandningsförhållanden är 1: 0, 4: 1, 3: 2, 2: 3, 1: 4, och 0: 1 (vänster: höger) mellan de två lösningar som införts från inloppen. De kemiska gradienter konstruerade av de sex olika blandnings utväxling lösningar kan genereras i cellodlingskammaren, som ligger nedströms. De övre och nedre skikten är åtskilda av en PDMS-membran. I det översta lagret är de reagens för syrefångande kemiska reaktionen införes i mikroflödeskanalen från två separata inlopp. Reagensen blandas med varandra för reaktionen omedelbart före flyter ovanpå cellodlingskammaren tillscavenge syret från bottenkanalen, utan direkt kemisk kontakt. Den inbäddade PC-film, med en mindre gas diffusionskoefficient jämfört med PDMS, fungerar som en diffusionsbarriär som gör syreuppsamlande effektivare. Syre diffunderar gradvis tillbaka till cellodlingskammaren genom PDMS i den nedströms belägna området för att bilda en syre gradienten utmed flödesriktningen. Eftersom syrefångande kemisk reaktion rums begränsad, är endast lokala syre spänningar påverkas. Som ett resultat kan anordningen utnyttjas i ett konventionellt cellinkubator utan att förändra dess globala syrespänningen. I migrations experimenten, celler ympas inuti cellodlingskammaren för observation. Tillväxtmediet och kemiska reagens introduceras till enheten med sprutpumpar med exakt styrda flödeshastigheter.
Karakterisering av kemiska och syre gradienter genereras inuti enheten. På grund av than laminärt flöde natur mikrofluidik, flödes beteenden kan förutsägas med hjälp av beräkningsfluiddynamik (CFD) simulation. I detta papper, vi konstruerat en 3D-modell och genomfört simulering med hjälp av en kommersiellt tillgänglig multi modellering programvara. Fikon. 2 (a) visar en jämförelse mellan experimentellt karakteriserade fluorescein koncentrationsprofiler tvärs över bredden av cellodlingskammaren baserat på fluorescensintensitetsmätningar och de numeriska simuleringsresultat. Överenskommelsen mellan de experimentella och simuleringsresultat tyder på att CFD-modell väl kan uppskatta de kemiska gradienter genereras inuti enheten. Fikon. 2 (b) plottar den simulerade SDF-1α-gradient som genereras i cellodlingskammaren. Fikon. 3 visar de syre gradient karakterisering resultat genom att flöda det syrekänsliga fluorescens färgämne inuti cellodlingskammaren innan cellförsök. Resultatet visar att en syre gradient, som sträcker sig från ca 1 till 16%, kan fastställas med hjälp av ovannämnda protokoll.
Cell migration resultat. Som en demonstration, utförde vi A549 studier cellmigration under 4 kombinationer av kemokin (SDF-1 a) och syre gradienter: (1) ingen kemokin och ingen syre gradienter som en kontroll, (2) med en kemokin-gradient och utan en syre gradient, (3) med en syre lutning och utan en kemokin gradient, och (4) med både kemokin och syre gradienter. Fikon. 4 visar en bild för hela experimentuppställning. Experimenten allt utfört i en konventionell cellkultur inkubator med hela installationen (inklusive mikroflödessystem enheter, sprutpumpar och levande cell imaging mikroskop) placerade inuti den. Cell migration resultat de är visade i fig. 5. Fikon. 5 (a) visar bilder som samlats in under experimenten med hjälp av levande cell imaging analyzer, och Fig. 5 (b) och (c) plottar cell migration banor och genomsnittliga rörelser under fyra kombinationer analyserats av ImageJ programvara med plugins. Resultaten visar att den genomsnittliga cellmigration avstånd i styr närmar sig noll, vilket tyder på slumpmässig rörelse av cellerna i experimentet. I kontrast, med endast kemokin gradienten är den genomsnittliga rörelsen av cellerna mot vänster, där SDF-1α-koncentrationen är högre. Resultaten tyder på SDF-1α kemotaxi beteende A549-celler, som tidigare har rapporterats. I experimentet med endast syre gradienter, är den genomsnittliga rörelsen av cellerna uppåt, där syrespänningen är lägre. Mer intressant, i experimentet med vinkelräta kemokin och syre gradienter, är den genomsnittliga rörelsen av cellerna uppåt och utan någon uppenbar rörelse i den horisontella riktningen (kemokin gradientriktningen).
Figur 1: Tillverkade PDMS-PC mikroflödescellodlingsanordning. (A) Den experimentella foto av den tillverkade anordningen i stånd att tillförlitligt generera vinkelräta kemiska och syre gradienter för cellmigrationsstudier. Den kemiska gradienten kanalen är fylld med blå och gula livsmedelsfärger för att demonstrera den gradient generationen inuti cellodlingskammaren. Syre gradient kanal är fylld med röd livsmedelsfärg. Skalstrecket är 1 cm. (B) Den schematiska av mikrofluidanordningen. Det övre skiktet är tillverkade med användning av PDMS med en inbäddad PC skikt som en gas diffusionsbarriär för effektiv syre gradient kontroll inne i cellodlingskammaren. (C) befälhavaren formar för tillverkning av de övre och undre skikten. Klicka här för atten större version av denna siffra.
Figur 2: Kemisk gradient inuti mikroflödescellodlingsanordning. (A) Numeriskt simuleras och experimentellt tecknas fluorescein koncentrationsgradient inuti cellodlingskammaren över bredden av cellodlingskammaren (Y-riktningen). Likheten mellan de simulerade och experimentellt uppmätta gradienter indikerar att simuleringen väl kan förutsäga den kemiska gradienten. Figuren infällda bilden visar den tredimensionella (3D) modell konstrueras för simuleringen. (B) Numerisk simulering resultat av SDF-1α kemokin-gradient tvärs över bredden av cellodlingskammaren för cellmigrationsstudier. Klicka här för att se enstörre version av denna siffra.
Figur 3: Oxygen gradient inuti mikroflödescellodlingsanordning. Experimentellt uppmätta syre gradienter inom cellodlingskammaren längs flödesriktningen. De gradienter uppskattades med hjälp av syrekänsliga fluorescens färgämne och bildanalys. Gradienterna, från vänster till höger av kammaren, karakteriseras, och resultaten har visat genomgående lutning profiler över bredden av kammaren.
Figur 4: Bilder av experimentuppställning. Hela installationen, inklusive mikroflödessystem enheter, sprutpumpar och en levande cell imaging mikroskop, är placerad inuti en konventionell cellodling inkubator för optimeradcellodlingsbetingelser under experimenten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Cellmigration studieresultat enligt vinkelräta SDF-1a och syre gradienter. (A) Bilder som tagits före och efter 12-h cellmigration studien. Cellmigrationsvägar kan analyseras från de infångade tids förfallit bilder med levande cell imaging mikroskop. (B) Cellmigrationsvägar och analyserade genomsnittliga migration rörelse från de tagna bilderna under 4 olika lutning kombinationer: ingen lutning, bara kemokin lutning, bara syre lutning, och båda kemokin och syre gradienter. Bilderna fångades var 15 min. Skalan bar är 250 um. (C) Tomter av den genomsnittliga cellmigrations avstånd i den vinkelräta (syre gradient) och horisontellt (kemokin gradient) riktningar under fyra olika lutning kombinationer. Data uttrycks som medelvärde ± SD, som erhållits från tre oberoende experimentella uppsättningar, och 10 celler analyserades i varje experiment. De statistiska signifikant olika (oparat t-test, p <0,01) resultat betecknas med olika bokstäver (a och b). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
De mest kritiska stegen för att tillverka PDMS mikroflödessystem enhet med en inbäddad PC tunn film är: (1) utvisa alla bubblor när du sätter i PC-film i PDMS pre-polymer, medan tillverkning av PDMS-PC toppskikt och (2) att se till alla PDMS härdningsprocesser utförs på en väl planade horisontalplanet. För cellmigrations experiment de mest kritiska stegen är: (1) eliminera bubblorna inom mikroflödessystem enhet, slangar och sprutpumpar under experimenten; (2) Se till att mikroflödessystem enheten placeras på en väl planade horisontalplanet under levande cell imaging för cellmigration observation; och (3) att hålla enheten återfuktad genom att tillsätta DDH 2 O till petriskål under experimenten och se till att vattnet inte torkas ut.
För att framgångsrikt tillverka PDMS-PC hybrid mikroflödessystem enhet utan delaminering, är det viktigt att ta bort alla bubblor under PC film införing. PC filmen kan införas långsamt från en vinkel (ungefär 15 till 30 grader bort från PDMS pre-polymerytan) för att förhindra bubblor generation under införandet av PC-filmen in i PDMS prepolymerpartiklarna. Om så är nödvändigt kan hela PDMS-prepolymer med den inbäddade PC-film placeras i exsickatorn ansluten till vakuumpumpen under 10 min för att driva ut de infångade bubblor. Om PC-film flyter upp efter vakuumprocessen, kan en pipettspets användas för att trycka ner PC filmen på det härdade PDMS lagret. Upprepa vakuum- och pressprocesser vid behov.
För cellexperiment, en brist på luftbubblor är kritisk för mikroflödescellkulturen. Se till att inga luftbubblor införs i hela mikroflödes setup (inklusive sprutpumpar, slangar och mikroflödessystem enhet) när du gör anslutningarna. Om luftbubblor skapas inom mikroflödesinställnings på grund av minskningen av gas löslighet under den förhöjda temperaturen av erfarenriments inuti inkubatorn, kan alla experimentella komponenter (inklusive de sprutor och slangar) och reagens (inklusive tillväxtmediet, pyrogallol, och NaOH) placeras i inkubatorn i förväg (minst 20 min före användning) för att minimera temperaturvariation . Sprutpumpar ofta generera värme från driften av motorerna inom pumparna. Det är oftast acceptabelt att driva sprutpumpar i inkubatorer; emellertid gör kontrollera inkubatortemperaturen under experimenten. Om temperaturen höjer under experimenten, ytterligare kylning förfaranden måste genomföras. kan användas flera genomförbara kylmetoder, såsom att placera en låda med is in i inkubatorn, minska antalet sprutpumpar placeras inuti inkubatorn, eller med användning av en inkubator med en kraft kylsystem.
PDMS-PC mikroflödescellodlingsanordning utvecklats i detta dokument är i stånd att på ett tillförlitligt sätt generera vinkelräta kemiska och syre gradienter for studier cell migration. Begränsningen av den utvecklade anordningen är att de alstrade syre lutning profiler beror på balansen mellan syreflödet, som drivs av kemisk reaktion sophantering, och syrediffusion från den omgivande atmosfären, genom anordningen, och i mediet. Som ett resultat, de syre gradient Profiler kan inte godtyckligt styras inuti anordningen. Jämfört med befintliga mikroflödescellodlings plattformar, är anordningen som utvecklats i detta dokument den första som kan utföra cellodlingsstudier enligt kombinationer av kemiska och syre gradienter. Hela anordningen kan tillverkas med hjälp av konventionella mjuk litografi replik gjutprocessen, utan omständlig justering och dyr instrumentering. De gradienter kan numeriskt simuleras och experimentellt präglas för att ge mer fysiologiska mikroliknande förhållanden för in vitro studier cell. Genom att använda en rumsligt begränsad kemisk reaktion metod med en PC-film som en gas diffusion barriär, kan genereras syre lutning utan att använda tryck gasflaskor och sofistikerade gasflödet styrenheter. Dessutom kräver installationen endast små mängder av kemikalier (mindre än 10 ml per dag) för att upprätthålla syre gradienter. Eftersom syrespänningsregleringen begränsas lokalt runt mikroflödessystem kanal, och inte stör den omgivande syrehalt kan hela installationen placeras inuti en konventionell cellodling inkubator utan extra temperatur, luftfuktighet och CO 2 kontroll instrumentering. Som ett resultat har den utvecklade anordningen stor potential att användas praktiskt i biologiska laboratorier.
På grund av tekniska begränsningar, har cellulära beteenden under syre spänningar sällan studerats i den existerande litteraturen. Med hjälp av anordningen som utvecklats i detta dokument, kan utföras cellodling under syre gradienter på ett enkelt sätt som i hög grad främjar cellstudier under syre gradienter. furthermore kan en liknande princip operation tillämpas för att generera andra fysiologiskt relevanta gasformiga gradienter, såsom koldioxid och kväveoxid, för in vitro cellkulturstudier 17. Dessa funktioner visar att PDMS-PC mikroflödessystem enhet visar stor potential för olika cellodlingsapplikationer, inklusive drogtestning och celltillväxt och migration analyser att avancera in vitro cellodlingsstudier.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml Syringe | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 302104 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tube | Smartgene | 6011-000 | |
| 10 ml Syringe | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 302151 | |
| 15 ml Centrifuge Tube | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | Falcon 352096 | |
| 150 mm Petri dish | Dogger Science | DP-43151 | |
| 1H,1H,2H,2H-Perfluorooctyltrichlorosilane | Alfa Aesar, Ward Hill, MA | 78560-45-9 | |
| 3 ml Syringe | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 302118 | |
| 4'' Silicon Dummy Wafer | Wollemi Technical, Taoyuan, Taiwan | ||
| Acetone | ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan | AH3102-000000-72EC | |
| AG Double Expose Mask Aligner | M&R Nano Technology, Taoyuan, Taiwan | AG500-4D-D-V-S-H | |
| Antibiotic-Antimyotic solution | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | GIBCO 15240-062 | |
| Biopsy punch | Miltex, Plainsboro, NJ | 33-31 | |
| Blunt needle | JensenGlobal, Santa Barbara, CA | Gauge 14 | |
| Bright-Line Hemocytometer | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | Z359629 | for cell counting |
| Buffered Oxide Etch | ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan | PH3101-000000-72EC | |
| Cell Culture Incubator | Caron, Marietta, OH | 6016-1 | |
| COMSOL Multiphysics | COMSOL, Burlington, MA | Ver. 4.3b | for numerical simulation of chemical gradients in the device |
| D-PBS | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | GIBCO 14190-144 | |
| Desicattor | A-VAC Industries, Anaheim, CA | 35.10001.01 | |
| DMEM/F12+GlutaMax-1 | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | GIBCO 10565-018 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | GIBCO 10082 | |
| Fibronectin from Human Plasma | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | F2006 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | DMIL LED | |
| Isopropyl Alcohol (IPA) | ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan | CMOS112-00000-72EC | |
| JuLi Smart Fluorescence Cell Imager | NanoEnTek, Seoul, Korea | DBJ01B | |
| Mechanical Convention Oven | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | Lindberg Blue M MO1450C | |
| NaOH | Showa Chemical Industry, Tokyo, Japan | 1943-0150 | |
| Plasma tretment system | Nordson MARCH, Concord CA | PX-250 | for oxygen plasma surface treatment |
| Polycarbonate (PC) film | Quantum Beam Technologies, Tainan Taiwan | ||
| Polydimehtylsiloxane (PDMS) | Dow Corning, Midland, MI | SYLGARD 184 | |
| Pyrogallol | Alfa Aesar, Ward Hill, MA | A13405 | |
| Removable Adhesive Putty | 3M | 860 | |
| Sorvall Legend Mach 1.6R Tabletop Centrifuge | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | ||
| Spin Coater | ELS Technology, Hsinchu, Taiwan | ELS 306MA | |
| SU-8 2050 | MicroChem, Westborough, MA | SU-8 2050 | |
| SU-8 Developer | MicroChem, Westborough, MA | Y020100 | |
| Surgical blade | Feather, Osaka, Japan | 5005093 | for PDMS cutting |
| Syringe Pump | Chemyx, Houston, TX | Fusion 400 | |
| T75 Cell Culture Flask | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | Nunc 156367 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher Scientific,Waltham, MA | GIBCO 25200 | |
| Tygon PTFE Tubing | Saint-Gobain Performance Plastics, Akron, OH | ||
| Tygon Tubing | Saint-Gobain Performance Plastics, Akron, OH | 621 |
References
- Phillips, J. E., Burns, K. L., Le Doux, J. M., Guldberg, R. E., García, A. J.
- Wang, F. The signaling mechanisms underlying polarity and chemotaxis. Cold Spring Harb. Perspect Biol. 1 (4), 1-16 (2009).
- Oh, S. H., Ward, C. L., Atala, A., Yoo, J. J., Harrison, B. S. Oxygen generating scaffolds for enhancing engineering tissue survival. Biomaterials. 30 (5), 757-762 (2009).
- Decaris, M. L., Lee, C. I., Yoder, M. C., Tarantal, A. F., Leach, J. K. Influence of the oxygen microenvironment on the proangiogenic potential of human endothelial colony forming cells. Angiogenesis. 12, 303-311 (2009).
- Chung, B. G., et al. Human neural stem cell growth and differentiation in a gradient-generating microfluidic device. Lab Chip. 5 (4), 401-406 (2005).
- Harris, A. L. Hypoxia - a key regulatory factor in tumor growth. Nat. Rev. Cancer. 2 (1), 38-47 (2002).
- Allen, J. W., Bhatia, S. N. Formation of steady-state oxygen gradients in vitro: application to liver zonation. Biotechnol. Bioeng. 82 (3), 253-262 (2003).
- McCord, A. M., Jamal, M., Shankavaram, U. T., Lang, F. F., Camphausen, K., Tofilon, P. J. Physiologic oxygen concentration enhances the stem-like properties of CD133+ human glioblastoma cells in vitro. Mol. Cancer Res. 7 (4), 489-497 (2009).
- Lo, J. F., Sinkala, E., Eddington, D. T. Oxygen gradients for open well cellular cultures via microfluidic substrates. Lab Chip. 10 (18), 2394-2401 (2010).
- Chang, C. W., et al. A polydimethylsiloxane-polycarbonate hybrid microfluidic device capable of generating perpendicular chemical and oxygen gradients for cell culture studies. Lab Chip. 14 (19), 3762-3772 (2014).
- Chen, Y. A., et al. Generation of oxygen gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially confined chemical reactions. Lab Chip. 11 (21), 3626-3633 (2011).
- Peng, C. C., Liao, W. H., Chen, Y. H., Wu, C. Y., Tung, Y. C. A microfluidic cell culture array with various oxygen tensions. Lab Chip. 13 (16), 3239-3245 (2013).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Ann. Rev. Mate. Sci. 28, 153-184 (1998).
- Friend, J., Yeo, L. Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane. Biomicrofluidics. 4 (2), 026502 (2010).
- Cordelières, F. P. Manual Tracking. , Institute Curie. Orsay, France. https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/Manual%20Tracking%20plugin.pdf (2005).
- Asano, Y., Horn, E. Instructions Chemotaxis and Migration Tool 2.0. , ibidi GmbH. Martinsried, Germany. http://ibidi.com/fileadmin/products/software/chemotaxis_tool/IN_XXXXX_CT_Tool_2_0.pdf (2013).
- Chen, Y. H., Peng, C. C., Cheng, Y. J., Wu, J. G., Tung, Y. C. Generation of nitric oxide gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially controlled chemical reactions. Biomicrofluidics. 7 (6), 064104 (2013).
