Polydimethylsiloxanhaltigen Polycarbonat Mikrofluidiksysteme für Zellmigrationsstudien unter Perpendicular Chemische und Sauerstoff Gradients

Zusammenfassung

Die Kontrolle von chemischen und Sauerstoffgradienten ist essentiell für Zellkulturen. In diesem Artikel wird über ein mikrofluidisches Gerät aus Polydimethylsiloxan-Polycarbonat (PDMS-PC) berichtet, das in der Lage ist, zuverlässig Kombinationen von chemischen und Sauerstoffgradienten für Zellmigrationsstudien zu erzeugen, die in biologischen Labors ohne ausgefeilte Instrumente praktisch eingesetzt werden können.

Zusammenfassung

Dieser Artikel berichtet über ein mikrofluidisches Gerät aus Polydimethylsiloxan (PDMS) mit einer eingebetteten Polycarbonat (PC) Dünnschicht, um die Zellmigration unter Kombinationen von chemischen und Sauerstoffgradienten zu untersuchen. Sowohl chemische als auch Sauerstoffgradienten können die Zellmigration in vivo stark beeinflussen; Aufgrund technischer Einschränkungen wurde jedoch nur sehr wenig Forschung durchgeführt, um ihre Auswirkungen in vitro zu untersuchen. Das in dieser Forschung entwickelte Gerät nutzt eine Reihe von serpentinförmigen Kanälen, um die gewünschten chemischen Gradienten zu erzeugen, und nutzt ein räumlich begrenztes chemisches Reaktionsverfahren zur Erzeugung von Sauerstoffgradienten. Die Richtungen der chemischen und Sauerstoffgradienten sind senkrecht zueinander, um eine einfache Interpretation der Migrationsergebnisse zu ermöglichen. Um die Sauerstoffgradienten effizient und mit minimalem Chemikalienverbrauch zu erzeugen, wird die eingebettete PC-Dünnschicht als Gasdiffusionsbarriere eingesetzt. Das entwickelte mikrofluidische Gerät kann durch Spritzenpumpen betätigt und während der Zellmigrationsexperimente in einen herkömmlichen Zellinkubator eingesetzt werden, um die Einrichtung zu vereinfachen und die Zellkulturbedingungen zu optimieren. In Zellexperimenten haben wir das Gerät verwendet, um die Migration von adenokarzinomischen humanen alveolären Basalepithelzellen, A549, unter Kombinationen von Chemokin (Stromal cell-derived factor, SDF-1α) und Sauerstoffgradienten zu untersuchen. Die experimentellen Ergebnisse zeigen, dass das Gerät stabil senkrechte Chemokin- und Sauerstoffgradienten erzeugen kann und zellverträglich ist. Die Ergebnisse der Migrationsstudie deuten darauf hin, dass Sauerstoffgradienten eine wesentliche Rolle bei der Steuerung der Zellmigration spielen können und dass das zelluläre Verhalten unter Kombinationen von Gradienten nicht von denen unter einzelnen Gradienten vorhergesagt werden kann. Das Gerät bietet Forschern ein leistungsstarkes und praktisches Werkzeug, um Wechselwirkungen zwischen chemischen und Sauerstoffgradienten in Zellkulturen zu untersuchen, was bessere Zellmigrationsstudien in eher in vivo-ähnlichen Mikroumgebungen fördern kann.

Einleitung

Die räumliche Verteilung löslicher Faktoren und der Sauerstoffspannung kann eine Reihe wichtiger zellulärer Funktionen in vivo regulieren^1,2,3,4. Um ihre Wirkung auf Zellen besser untersuchen zu können, ist eine in vitro Zellkulturplattform, die in der Lage ist, stabile chemische und Sauerstoffgradienten zu erzeugen, sehr wünschenswert. Verschiedene lösliche Faktoren spielen eine Schlüsselrolle bei biologischen Aktivitäten und beeinflussen das zelluläre Verhalten. In jüngster Zeit wurden aufgrund der Weiterentwicklung mikrofluidischer Techniken eine Reihe von mikrofluidischen Geräten entwickelt, die in der Lage sind, stabile chemische Gradienten zu erzeugen, um die Zellmigration zu untersuchen⁵. Darüber hinaus haben mehrere Studien auch gezeigt, dass die Sauerstoffspannung für in vitro Zellkulturen notwendig ist^6,7,8. Die Regelung der Sauerstoffspannung für die Zellkultur beruht jedoch hauptsächlich auf der direkten chemischen Zugabe für die Sauerstoffabscheidung oder Zellinkubatoren mit Druckgasflaschen. Die direkte chemische Zugabe verändert das Zellkulturmedium und beeinflusst die zellulären Reaktionen. Inkubatoren zur Sauerstoffkontrolle erfordern ein spezielles Inkubatordesign, eine präzise Gasflussregelung und ein großes Volumen an Stickstoffgas, um Hypoxiebedingungen zu erreichen. Darüber hinaus ist es unmöglich, die räumliche Verteilung von Sauerstoff mit diesem Aufbau zu kontrollieren, was die Untersuchung des zellulären Verhaltens unter verschiedenen Sauerstoffspannungen und -gradienten verzögert. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde eine Reihe von mikrofluidischen Geräten entwickelt, um Sauerstoffgradienten für Zellkulturanwendungen zu erzeugen⁹. Die meisten von ihnen werden jedoch mit Druckgasen betrieben, die zu Verdampfungs- und Blasenbildungsproblemen führen können. Daher erfordern sie oft eine ausgeklügelte Instrumentierung und sind für Langzeit-Zellkulturstudien möglicherweise nicht zuverlässig.

Um die Herausforderungen zu meistern und die Wechselwirkungen zwischen chemischen und Sauerstoffgradienten für die Zellmigration weiter zu untersuchen, haben wir ein mikrofluidisches Zellkulturgerät aus Polydimethylsiloxan (PDMS) mit einer eingebetteten Dünnschicht aus Polycarbonat (PC) entwickelt¹⁰. Das Gerät besteht aus zwei mikrofluidischen Kanalschichten, die durch eine PDMS-Membran getrennt sind. Die oberste Schicht ist eine PDMS-PC-Schicht zur Erzeugung von Sauerstoffgradienten; Die untere Schicht besteht aus PDMS für die Erzeugung chemischer Gradienten und die Zellkultur. Das Gerät kann gleichzeitig senkrechte Chemikalien- und Sauerstoffgradienten erzeugen, ohne Gasflaschen und ausgeklügelte Durchflussregelungssysteme zu verwenden. In dem Gerät bietet PDMS eine hohe optische Transparenz, Gasdurchlässigkeit und biologische Verträglichkeit für Zellkultur und Bildgebung. Die eingebettete PC-Folie dient als Gasdiffusionsbarriere für eine effiziente Regelung der Sauerstoffspannung. Im mikrofluidischen Kanal haben wir eine Reihe von serpentinförmigen Kanälen verwendet, um chemische Gradienten zu erzeugen. Das Design wurde aufgrund seiner Zuverlässigkeit und seines einfachen Versuchsaufbaus in großem Umfang zur Erzeugung chemischer Gradienten in mikrofluidischen Geräten für verschiedene Anwendungen genutzt. Darüber hinaus können die chemischen Gradientenprofile entworfen werden, indem die Kanalgeometrien zuvor mit numerischer Simulation variiert werden. Für die Erzeugung von Sauerstoffgradienten haben wir die Vorteile der räumlich begrenzten chemischen Reaktionsmethode genutzt, die zuvor in unserem Labor entwickelt wurde^10,11,12. Der Sauerstoff kann aus den dafür vorgesehenen Bereichen abgefangen werden, ohne dass Stickstoff gespült wird. Für den praktischen Einsatz in biologischen Laboren ist der gesamte Versuchsaufbau mit herkömmlichen Zellkultur-Inkubatoren kompatibel. Durch die Integration dieser Methoden können wir gleichzeitig stabile chemische und Sauerstoffgradienten ohne große Gasflaschen und ausgeklügelte Instrumente erzeugen, um die Zellmigration zu untersuchen.

Protokoll

1. Herstellung des mikrofluidischen Geräts

HINWEIS: Das gesamte mikrofluidische Gerät wird mit dem Soft-Lithographie-Replik-Formverfahren hergestellt¹³.

1. Herstellung von Formen für die PDMS-Schichten in der mikrofluidischen Baurichtung
   1. Entwerfen Sie die mikrofluidischen Kanalmuster mit handelsüblicher Illustrations- oder Zeichensoftware. Senden Sie die Datei an ein Unternehmen für den hochauflösenden Druck von Fotomasken mit Transparenz¹⁴.
   2. Reinigen Sie Siliziumwafer mit Aceton (≥99,5 %), Isopropylalkohol (IPA; ≥99,9 %) und gepuffertem Oxidätzen (BOE; 6:1 NH₄F.HF). Spülen Sie mit deionisiertem (DI) Wasser und dehydrieren Sie den Wafer mit einer Stickstoffpistole.
   3. Schleudern Sie ca. 20 g Negativton-Fotolack SU-8 2050 bei 500 U/min für 15 Sekunden und dann 2.000 U/min für 30 Sekunden auf die Wafer
      HINWEIS: Die Spin-Beschichtungsbedingung sollte nach der optischen Lithographie SU-8 2050-Fotolackschichten mit einer Dicke von ca. 75 μm auf den Wafern ergeben.
   4. Die Waffeln auf einer 65 °C heißen Platte 3 min und anschließend 9 min bei 95 °C weich backen. Nach dem Softbake belichten Sie die Wafer mit einem Masken-Aligner mit den entworfenen Transparenzmasken unter UV-Licht; Die Gesamtexpositionsenergie sollte etwa 300 mJ/cm² betragen. Nach der Belichtung (PEB) werden die Wafer 2 min lang bei 65 °C und anschließend 7 min lang bei 95 °C gebacken.
   5. Tauchen Sie die Wafer nach dem PEB für 7 min in den SU-8-Entwickler unter starkem Rühren oder in ein Ultraschallbad (37 kHz und 180 W effektive Ultraschallleistung). Spülen Sie den Wafer mit Aceton und IPA, um die Reste von SU-8 zu entfernen.
   6. Legen Sie den Wafer und 100 μl Silan (1H,1H,2H,2H-Perfluoroctyltrichlorsilan) in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 6 cm in einen Exsikkator, der mit einer Membranvakuumpumpe für die Silanisierung der Waferoberfläche verbunden ist, um eine unerwünschte Bindung zu verhindern. Schalten Sie die Pumpe für 15 Minuten ein, schalten Sie sie aus und verschließen Sie den Exsikkator 30 Minuten lang mit einem Vakuum
   .
   7. Nehmen Sie die silanisierten Wafer aus dem Exsikkator und kleben Sie sie auf Petrischalen mit einem Durchmesser von 15 cm für den folgenden Softlithographie-Prozess:
2. Herstellung und Montage von PDMS-Schichten
   1. Vorbereitung des PDMS-Prepolymers
      1. Mischen Sie das PDMS-Monomer (Base) und das Härter im Verhältnis 10:1 (v/v). Entgasen Sie das Gemisch in der Exsikkatoranlage für 60 min.
   2. Herstellung der PC-eingebetteten Deckschicht
      1. Übertragen Sie 2 g des PDMS-Präpolymers auf die Form mit den fluidischen Kanalmustern der oberen Schicht, um eine dünne Schicht PDMS herzustellen. Platzieren Sie die Form in der Exsikkator-Setup, um das PDMS 60 Minuten lang zu entgasen.
      2. Stellen Sie die Form über Nacht in einen 60 °C heißen Ofen, um sie mit PDMS auszuhärten. Achte darauf, dass sich die Form auf einer horizontalen Ebene befindet.
      3. Kühle die Form auf Raumtemperatur ab. Gießen Sie weitere 13 g PDMS-Prepolymer auf die Form und entgasen Sie das PDMS im Exsikkator-Setup für 60 min.
      4. Betten Sie langsam eine 1 mm dicke PC-Folie als Gasdiffusionsbarriere in die frische PDMS-Schicht ein und stoßen Sie bei Bedarf Blasen aus.
      5. Stellen Sie die Form über Nacht in den 60 °C heißen Ofen und achten Sie darauf, dass sie auf einer horizontalen Ebene steht.
      6. Kühlen Sie das ausgehärtete PDMS auf Raumtemperatur ab. Schneiden Sie das Gerät mit einem Skalpell auf eine Fläche von ca. 5,5 x 5 cm² zu, die alle Kanalmuster abdecken kann, und ziehen Sie die PDMS-Platte aus der Form ab.
      7. Stanzen Sie Löcher für Ein- und Auslässe mit einem Biopsiestempel mit einem Durchmesser von 2 mm. Lagern Sie die gefertigte obere PDMS-PC-Schicht für die spätere Montage vor Umgebungsstaub geschützt.
   3. Herstellung der unteren PDMS-Schicht
      1. Gießen Sie 11 g des PDMS-Prepolymers auf die Form für die untere Schicht. Legen Sie die Form in den Exsikkator, um das PDMS 60 Minuten lang zu entgasen. Bewahren Sie die Form über Nacht in einem 60 °C Ofen auf, um das PDMS auszuhärten. Stellen Sie sicher, dass es auf einer horizontalen Ebene liegt.
      2. Kühlen Sie das PDMS auf Raumtemperatur ab. Schneiden Sie das Gerät auf eine Fläche von ca. 5,5 x 5 cm² zu, die alle Kanalmuster abdecken kann, und ziehen Sie es aus der Form. Lagern Sie die vorgefertigte untere PDMS-Schicht für die spätere Montage fern von Umgebungsstaub.
   4. Herstellung der PDMS-Membran
      1. Schleudern Sie ca. 4 g PDMS-Prepolymer auf einen silanisierten Blank-Wafer bei 100 U/min für 90 Sekunden und dann 3.000 U/min für 4 Sekunden. Backen Sie den geschleuderten Wafer über Nacht in einem 60 °C-Ofen.
   5. Montage des Gerätes
      1. Legen Sie die gefertigte PDMS-PC-Deckschicht und den Wafer mit der spinnbeschichteten PDMS-Membran mit den Bondflächen nach oben in eine O₂ Plasma-Oberflächenbehandlungsmaschine. Die PDMS-Oberflächen werden 40 Sekunden lang mit 90 W O₂ -Plasma behandelt.
      2. Kleben Sie die Deckschicht direkt nach der O₂ -Plasma-Oberflächenbehandlung auf die PDMS-Membran. Legen Sie ein Gewicht (ca. 600 g) auf die Verbundlagen und stellen Sie sie über Nacht in einen 60 °C heißen Ofen, um die Verklebung zu fördern.
      3. Kühlen Sie die Verbundschichten auf Raumtemperatur ab und schneiden Sie die mit der Deckschicht verklebte Membran mit einem Skalpell auf eine Fläche von ca. 5,5 x 5 cm² ab, die alle Kanalmuster abdecken kann. Ziehen Sie die gebundene Struktur vom Siliziumwafer ab und stanzen Sie mit einem Biopsiestanzer mit einem Durchmesser von 2 mm Löcher an den Ein- und Auslässen des chemischen Gradientenkanals.
      4. Die membrangebundene Deckschicht und die gefertigte PDMS-Unterlage werden mit den Klebeflächen nach oben in die O₂ Plasma-Oberflächenbehandlungsmaschine gelegt, um die PDMS-Oberflächen mit dem Plasma bei 90 W für 40 Sekunden zu aktivieren.
      5. Befestigen Sie die obere und untere Schicht für die Verklebung unmittelbar nach der Oberflächenbehandlung miteinander. Legen Sie ein Gewicht (ca. 600 g) auf das gesamte verklebte Gerät und stellen Sie es über Nacht in einen 60 °C heißen Ofen.
      6. Nehmen Sie das gesamte gefertigte Gerät aus dem Ofen und kühlen Sie es auf Raumtemperatur ab.

2. Mikrofluidischer Zellmigrationsassay

HINWEIS: In diesem Artikel verwenden wir eine häufig verwendete Zelllinie, die adenokarzinomische humane alveoläre Basalepithelzelle (A549), und ein Chemokin, Stromazell-abgeleiteter Faktor (SDF-1α), als Beispiele. Für Forscher, die an anderen Zellen und Chemokinen arbeiten, passen Sie bitte die experimentellen Prozesse entsprechend an.

1. Tag 0: Vorbereitung der Zellen
   1. Kultivieren Sie den Bestand an A549-Zellen in einem vollständigen Wachstumsmedium, das DMEM F12 L-Glutaminersatz, 10 % (v/v) fötales Rinderserum (FBS) und 1 % (v/v) antimikrobiver-antimykotische Lösung enthält. Subkultur durch Dissoziation mit 0,25% Trypsin-EDTA.
   2. Bereiten Sie Zellsuspensionen für die Experimente vor, indem Sie dissoziierte Zellen bei 140 x g für 3 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Für die mikrofluidischen Geräteexperimente werden die Zellen mit einem Hämozytometer gezählt und mindestens 1 x 10⁶ Zellen in einen T75-Kolben mit 10 ml vollständigem Wachstumsmedium ausgesät.
      HINWEIS: Alle Zellkulturprozesse werden in einem Inkubator mit einer Atmosphäre von 37 °C und 5 % CO₂ durchgeführt.
2. Tag 1: Vorbereitung des Geräts
   1. Setzen Sie das Gerät in die O₂ -Plasmamaschine ein und behandeln Sie es 40 Sekunden lang mit O₂ -Plasma bei 90 W, um die mikrofluidischen Kanaloberflächen hydrophil zu machen.
   2. Unmittelbar nach der Oberflächenbehandlung installieren Sie zwei stumpfe 14-G-Nadeln, indem Sie die Nadeln direkt in die Löcher mit einem Durchmesser von 2 mm einführen, die in die PDMS-Schicht an den Einlässen des chemischen Gradientenkanals gestanzt sind. Achten Sie darauf, dass die Nadeln die mikrofluidischen Kanäle nicht blockieren. Entnehmen Sie 0,8 ml ddH₂O mit einer 1 ml Spritze und einer stumpfen 14 G Nadel. Injizieren Sie das ddH₂O vom Auslass in den chemischen Gradientenkanal, bis das Wasser aus beiden Nadeln an den Einlässen austritt.
   3. Bereiten Sie 1 ml 50 μg/ml Fibronektinlösung vor, indem Sie Fibronektinbrühe mit Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) verdünnen.
   4. Die Fibronektinlösung wird aus dem Auslass des chemischen Gradientenkanals mit einer 1-ml-Spritze mit einer stumpfen 14-G-Nadel infundiert, bis die Lösung aus beiden Nadeln an den Einlässen austritt.
   5. Inkubieren Sie das gesamte Gerät über Nacht in einem herkömmlichen Zellkultur-Inkubator.
3. Tag 2: Zellaussaat und mikroskopische Bildgebung
   1. Aussaat von Zellen
      1. Aspirieren Sie das Medium aus den Zellen, die seit Tag 0 kultiviert wurden, und waschen Sie die Zellen 2 Mal mit 5 ml DPBS. Das DPBS wird aspiriert, 2 ml Trypsin-EDTA zugegeben und die Zellen 5 Minuten lang im Inkubator inkubiert, um die Zellen von der Kolbenoberfläche zu lösen.
      2. Warten Sie, bis sich die Zellen gelöst und in der Lösung suspendiert haben, und geben Sie 8 ml serumfreies Medium (DMEM F12 + 1% (v/v) antimikrobisch-antimykotische Lösung) in den Kolben. Die gesamte Flüssigkeit in ein konisches 15-ml-Röhrchen umfüllen und bei 140 x g 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren.
      3. Der Überstand wird nach dem Zentrifugieren aspiriert und eine angemessene Menge des serumfreien Mediums hinzugefügt, um die endgültige Zelldichte auf 1 x 10⁶ Zellen/ml zu erhöhen. Nehmen Sie das an Tag 1 vorbereitete mikrofluidische Gerät heraus. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer oder einem anderen automatischen Zellzählinstrument.
      4. Injizieren Sie serumfreies Medium aus dem Auslass des chemischen Gradientenkanals mit einer 1-ml-Spritze mit einer stumpfen 14-G-Nadel, bis das Medium aus beiden Nadeln an den Einlässen austritt. Injizieren Sie 200 μl der Zellsuspension aus dem Auslass des chemischen Gradientenkanals.
      5. Beobachten Sie die Zellkulturkammer im Gerät unter einem Mikroskop, um zu bestätigen, dass die Zellen in den mikrofluidischen Kanal eingeführt wurden. Stellen Sie das Gerät in einen feuchten Behälter (z. B. eine Plastikbox mit ddH₂O darin) und bewahren Sie es 5 Stunden lang in einem Zellkultur-Inkubator auf, um die Adhäsion der Zellen auf der Geräteoberfläche zu fördern.
   2. Vorbereitung von Reagenzien für die Erzeugung chemischer Gradienten
      1. Bereiten Sie die Chemikalie (SDF-1α) in der gewünschten Konzentration (100 ng/ml) in einem serumfreien Medium vor. Ziehen Sie das serumfreie Medium mit und ohne Chemikalie in zwei separate 3-ml-Spritzen, die mit hochreinen Schläuchen verbunden sind. Setzen Sie die Spritzen für den späteren Gebrauch auf eine Spritzenpumpe mit einer Durchflussmenge von 1 μl/min.
   3. Vorbereitung der Reagenzien für die Erzeugung von Sauerstoffgradienten
      1. 15 ml 1 M NaOH-Lösung und 15 ml 200 mg/ml Pyrogallol-Lösung herstellen. Ziehen Sie die NaOH- und Pyrogallol-Lösungen in zwei separate 15-ml-Spritzen, die mit hochreinen PTFE-Schläuchen bzw. hochreinen Schläuchen verbunden sind. Setzen Sie die Spritzen für den späteren Gebrauch auf eine Spritzenpumpe mit einer Durchflussmenge von 5 μl/min.
   4. Aufbau eines mikrofluidischen Geräts
      1. Nehmen Sie nach der 5-stündigen Inkubation das gesamte Gerät heraus und legen Sie es auf eine Petrischalen mit einem Durchmesser von 15 cm. Befestigen Sie das Gerät mit Klebemasse in der Petrischale. Übertragen Sie die Petrischale in ein Mikroskop mit lebenden Zellen in einem Inkubator.
      2. Verbinden Sie den Schlauch von den Spritzen für die Erzeugung des chemischen Gradienten mit den Einlässen des chemischen Gradientenkanals. Verbinden Sie den Auslass mit einem Schlauch, der zu einem Abfallbehälter führt. Schalten Sie die Spritzenpumpe mit den Spritzen ein, um den chemischen Gradienten zu erzeugen.
      3. Verbinden Sie den hochreinen Schlauch von den Spritzen, die NaOH und Pyrogallol enthalten, mit den Einlässen des Sauerstoffgradientenkanals. Schließen Sie den Schlauch an den Auslass an, um den Abfall aufzufangen. Schalten Sie die Spritzenpumpe mit den Spritzen ein, um den Sauerstoffgradienten zu erzeugen.
      4. Geben Sie etwa 15 ml ddH₂O in die Petrischale, um das Gerät mit Feuchtigkeit zu versorgen. Richten Sie das Mikroskop für die Bildgebung lebender Zellen für die Aufnahme von Bildern im Zeitraffer ein und nehmen Sie alle 15 Minuten ein Bild auf.
4. Tag 3: Datenerhebung und -analyse
   1. Übertragen Sie die erfassten Bilddateien auf einen Computer. Analysieren Sie die Bilder mit einer Open-Source-Bildanalysesoftware, ImageJ, mit einem Open-Source-Plugin für manuelles Tracking (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html) und einer kostenlosen Chemotaxis Tool-Software (http://ibidi.com/xtproducts/en/Software-and-Image-Analysis/Manual-Image-Analysis/Chemotaxis-and-Migration-Tool)^15,16.

3. Charakterisierung der Farbverläufe

HINWEIS: Die chemischen und Sauerstoffgradienten können vor oder nach den Zellexperimenten charakterisiert werden.

1. Numerische Simulation des chemischen Gradienten
   1. Schätzen Sie die laminare Strömungsnatur der Mikrofluidik mit Hilfe der CFD-Simulation (Computational Fluidic Dynamics).
2. Experimentelle Charakterisierung des Sauerstoffgradienten
   1. Bereiten Sie einen sauerstoffempfindlichen Fluoreszenzfarbstoff, Tris(2,2′-bipyridyl)ruthenium(III)-chlorid-Hexahydrat, in Wasser in einer Konzentration von 5 mg/ml vor.
   2. Die sauerstoffempfindliche Farbstofflösung wird in zwei separate 3-ml-Spritzen gegeben, die mit einem hochreinen Schlauch verbunden sind. Stellen Sie die Spritzen auf eine Spritzenpumpe mit einer Durchflussrate von 1 μl/min (identisch mit den Durchflussraten, die für die Erzeugung des chemischen Gradienten verwendet werden).
   3. Verbinden Sie den Schlauch von den Spritzen mit den Einlässen des chemischen Gradientenkanals. Verbinden Sie den Auslass mit einem Schlauch, der zu einem Abfallbehälter führt. Schalten Sie die Spritzenpumpe mit den Spritzen ein, um den chemischen Gradienten zu erzeugen.
   4. Messen Sie die Fluoreszenzintensität mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop, wobei das Anregungslicht durch einen optischen Filter von 470 ± 20 nm fällt. Sammeln Sie das Emissionslicht durch einen 515-nm-Langpass-Emissionsfilter mit einer coolen CCD-Kamera.
   5. Verbinden Sie den hochreinen Schlauch von den Spritzen, die NaOH und Pyrogallol enthalten, mit den Einlässen des Sauerstoffgradientenkanals. Schließen Sie den Schlauch an den Auslass an, um den Abfall aufzufangen. Schalten Sie die Spritzenpumpe mit den Spritzen ein, um den Sauerstoffgradienten zu erzeugen.
   6. Sammeln Sie die Fluoreszenzbilder des sauerstoffempfindlichen Farbstoffs, der in der Zellkulturkammer fließt.
   7. Stoppen Sie den Durchfluss für die Erzeugung von Sauerstoffgradienten und trennen Sie alle Schläuche vom Sauerstofferzeugungskanal. Schließen Sie hochreine Schläuche von den Gasflaschen an den Auslass des Sauerstoffgradientenkanals an.
   8. Sammeln Sie die Fluoreszenzbilder des sauerstoffempfindlichen Farbstoffs, der in der Zellkulturkammer fließt, wenn Luft, reiner Stickstoff und reiner Sauerstoff in den Schlauch strömt, der mit dem Sauerstoffgradientenkanal verbunden ist.
   9. Schätzen Sie die Sauerstoffgradienten durch Analyse der Fluoreszenzbilder unter Verwendung der Stern-Volmer-Gleichung gemäß den Referenzen 10 und 11.

Ergebnisse

Hergestelltes PDMS-PC-Hybrid-Mikrofluidik-Zellkulturgerät. Abb. 1 zeigt ein Foto und eine Illustration des mikrofluidischen Geräts. Die untere Schicht enthält vier Ebenen von serpentinförmigen Kanälen, um Lösungen aus Reagenzien zu erzeugen, die von zwei getrennten Einlässen mit sechs verschiedenen Mischungsverhältnissen eingebracht werden. Theoretisch sind die sechs verschiedenen Mischungsverhältnisse 1:0, 4:1, 3:2, 2:3, 1:4 und 0:1 (links:rechts) zwischen den beiden Lösungen, die aus den Einlässen eingeführt werden. Die chemischen Gradienten, die durch die sechs verschiedenen Mischungsverhältnislösungen gebildet werden, können in der nachgeschalteten Zellkulturkammer erzeugt werden. Die obere und untere Schicht sind durch eine PDMS-Membran getrennt. In der obersten Schicht werden die Reagenzien für die chemische Reaktion zur Sauerstoffgewinnung aus zwei getrennten Einlässen in den mikrofluidischen Kanal eingebracht. Die Reagenzien werden für die Reaktion unmittelbar miteinander vermischt, bevor sie auf die Zellkulturkammer fließen, um den Sauerstoff aus dem unteren Kanal ohne direkten chemischen Kontakt abzufangen. Die eingebettete PC-Folie mit einem geringeren Gasdiffusionskoeffizienten im Vergleich zu PDMS fungiert als Diffusionsbarriere, die die Sauerstoffabscheidung effizienter macht. Der Sauerstoff diffundiert allmählich durch das PDMS im Downstream-Bereich zurück in die Zellkulturkammer und bildet einen Sauerstoffgradienten entlang der Strömungsrichtung. Da die chemische Reaktion des Sauerstofffängers räumlich begrenzt ist, werden nur lokale Sauerstoffspannungen beeinflusst. Dadurch kann das Gerät in einem herkömmlichen Zellinkubator eingesetzt werden, ohne dessen globale Sauerstoffspannung zu verändern. Bei den Migrationsexperimenten werden die Zellen zur Beobachtung in die Zellkulturkammer ausgesät. Das Wachstumsmedium und die chemischen Reagenzien werden über Spritzenpumpen mit genau geregelten Durchflussmengen in das Gerät eingebracht.

Charakterisierung von chemischen und Sauerstoffgradienten, die im Gerät erzeugt werden. Aufgrund der laminaren Strömungsnatur der Mikrofluidik kann das Strömungsverhalten mit Hilfe der CFD-Simulation (Computational Fluidic Dynamics) vorhergesagt werden. In dieser Arbeit haben wir ein 3D-Modell konstruiert und die Simulation mit einer kommerziell erhältlichen Multiphysik-Modellierungssoftware durchgeführt. Abb. 2(a) zeigt einen Vergleich zwischen experimentell charakterisierten Fluorescein-Konzentrationsprofilen über die Breite der Zellkulturkammer auf Basis von Fluoreszenzintensitätsmessungen und den numerischen Simulationsergebnissen. Die Übereinstimmung zwischen den experimentellen und den Simulationsergebnissen deutet darauf hin, dass das CFD-Modell die im Inneren des Geräts erzeugten chemischen Gradienten gut abschätzen kann. Abb. 2(b) zeigt den simulierten SDF-1α-Gradienten, der in der Zellkulturkammer erzeugt wurde. Abb. 3 zeigt die Ergebnisse der Charakterisierung des Sauerstoffgradienten, indem der sauerstoffempfindliche Fluoreszenzfarbstoff vor den Zellexperimenten in die Zellkulturkammer geflossen wird. Das Ergebnis deutet darauf hin, dass mit dem oben genannten Protokoll ein Sauerstoffgradient von etwa 1 bis 16 % festgestellt werden kann.

Ergebnisse der Zellmigration. Zur Demonstration führten wir A549-Zellmigrationsstudien unter 4 Kombinationen von Chemokin (SDF-1α) und Sauerstoffgradienten durch: (1) kein Chemokin und keine Sauerstoffgradienten als Kontrolle, (2) mit einem Chemokingradienten und ohne Sauerstoffgradienten, (3) mit einem Sauerstoffgradienten und ohne Chemokingradient und (4) mit sowohl Chemokin- als auch Sauerstoffgradienten. Abb. 4 zeigt das Foto des gesamten Versuchsaufbaus. Die Experimente wurden alle in einem herkömmlichen Zellkultur-Inkubator durchgeführt, in dem sich der gesamte Aufbau (einschließlich der mikrofluidischen Geräte, Spritzenpumpen und Mikroskope für die Bildgebung lebender Zellen) befand. Die Ergebnisse der Zellmigration sind in Abb. 5 dargestellt. Abb. 5(a) zeigt die Bilder, die während der Experimente mit dem Live Cell Imaging Analyzer gesammelt wurden, und Abb. 5(b) und (c) zeigt die Zellmigrationsverläufe und durchschnittlichen Bewegungen unter den vier Kombinationen, die von der ImageJ-Software mit den Plugins analysiert wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass die durchschnittliche Zellmigrationsdistanz in der Kontrolle gegen Null geht, was auf eine zufällige Bewegung der Zellen im Experiment hindeutet. Im Gegensatz dazu verläuft bei nur dem Chemokin-Gradienten die durchschnittliche Bewegung der Zellen nach links, wo die SDF-1α-Konzentration höher ist. Die Ergebnisse deuten auf das SDF-1α-Chemotaxis-Verhalten von A549-Zellen hin, das bereits berichtet wurde. Im Experiment mit nur Sauerstoffgradienten verläuft die durchschnittliche Bewegung der Zellen nach oben, wobei die Sauerstoffspannung geringer ist. Interessanter ist, dass im Experiment mit senkrechten Chemokin- und Sauerstoffgradienten die durchschnittliche Bewegung der Zellen nach oben und ohne offensichtliche Bewegung in horizontaler Richtung (Chemokingradientenrichtung) erfolgt.

Abbildung 1: Hergestelltes mikrofluidisches Zellkulturgerät PDMS-PC. a) das experimentelle Foto der hergestellten Vorrichtung, die in der Lage ist, zuverlässig senkrechte chemische und Sauerstoffgradienten für Zellmigrationsstudien zu erzeugen. Der chemische Gradientenkanal ist mit blauen und gelben Lebensmittelfarbstoffen gefüllt, um die Gradientenerzeugung in der Zellkulturkammer zu demonstrieren. Der Sauerstoffgradientenkanal ist mit roter Lebensmittelfarbe gefüllt. Der Maßstabsbalken beträgt 1 cm. (b) Der Schaltplan des mikrofluidischen Geräts. Die oberste Schicht wird unter Verwendung von PDMS mit einer eingebetteten PC-Schicht als Gasdiffusionsbarriere für eine effiziente Kontrolle des Sauerstoffgradienten in der Zellkulturkammer hergestellt. c) Die Urformen für die Herstellung der oberen und unteren Schichten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Chemischer Gradient im Inneren des mikrofluidischen Zellkulturgeräts. (a) Numerisch simulierter und experimentell charakterisierter Fluorescein-Konzentrationsgradient innerhalb der Zellkulturkammer über die Breite der Zellkulturkammer (Y-Richtung). Die Ähnlichkeit zwischen den simulierten und experimentell gemessenen Gradienten deutet darauf hin, dass die Simulation den chemischen Gradienten gut vorhersagen kann. Der Einschub der Abbildung zeigt das dreidimensionale (3D) Modell, das für die Simulation konstruiert wurde. (b) Numerisches Simulationsergebnis des SDF-1α-Chemokingradienten über die Breite der Zellkulturkammer für Zellmigrationsstudien. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Sauerstoffgradient im Inneren des mikrofluidischen Zellkulturgeräts. Experimentell gemessene Sauerstoffgradienten innerhalb der Zellkulturkammer entlang der Strömungsrichtung. Die Gradienten wurden mit dem sauerstoffsensitiven Fluoreszenzfarbstoff und der Bildanalyse abgeschätzt. Die Gradienten von links nach rechts der Kammer sind charakterisiert, und die Ergebnisse zeigen konsistente Gradientenprofile über die gesamte Breite der Kammer.

Abbildung 4: Fotos des Versuchsaufbaus. Der gesamte Aufbau, einschließlich mikrofluidischer Geräte, Spritzenpumpen und eines Mikroskops für die Bildgebung lebender Zellen, befindet sich in einem herkömmlichen Zellkultur-Inkubator, um die Zellkulturbedingungen während der Experimente zu optimieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Ergebnisse der Zellmigrationsstudie unter senkrechten SDF-1α- und Sauerstoffgradienten. (a) Bilder, die vor und nach der 12-stündigen Zellmigrationsstudie aufgenommen wurden. Die Zellmigrationspfade können aus den aufgenommenen Zeitrafferbildern mit dem Lebendzellmikroskop analysiert werden. (b) Die Zellmigrationspfade und die analysierte durchschnittliche Migrationsbewegung aus den aufgenommenen Bildern unter 4 verschiedenen Gradientenkombinationen: kein Gradient, nur Chemokingradient, nur Sauerstoffgradient und sowohl Chemokin- als auch Sauerstoffgradienten. Die Bilder wurden alle 15 Minuten aufgenommen. Der Maßstabsbalken beträgt 250 μm. (c) Diagramme der durchschnittlichen Zellmigrationsabstände in senkrechter (Sauerstoffgradient) und horizontaler Richtung (Chemokingradient) unter vier verschiedenen Gradientenkombinationen. Die Daten werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt, der aus drei unabhängigen Versuchssätzen gewonnen wurde, und in jedem Experiment wurden 10 Zellen analysiert. Die statistisch signifikant unterschiedlichen Ergebnisse (ungepaarter Student's t-Test, p < 0,01) werden mit unterschiedlichen Buchstaben (a und b) gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Die wichtigsten Schritte bei der Herstellung des mikrofluidischen PDMS-Geräts mit einer eingebetteten PC-Dünnschicht sind: (1) das Ausstoßen aller Blasen beim Einsetzen der PC-Schicht in das PDMS-Prepolymer bei der Herstellung der PDMS-PC-Deckschicht und (2) das Sicherstellen, dass alle PDMS-Härtungsprozesse auf einer gut ebenen horizontalen Ebene durchgeführt werden. Für Zellmigrationsexperimente sind die kritischsten Schritte: (1) Beseitigung der Blasen im mikrofluidischen Gerät, in den Schläuchen und in den Spritzenpumpen während der Experimente; (2) Sicherstellung, dass das mikrofluidische Gerät während der Bildgebung lebender Zellen für die Beobachtung der Zellmigration auf einer gut ebenen horizontalen Ebene platziert wird; und (3) das Gerät mit Feuchtigkeit versorgt zu halten, indem während der Experimente ddH₂O in die Petrischale gegeben und sichergestellt wird, dass das Wasser nicht austrocknet.

Um das PDMS-PC-Hybrid-Mikrofluidikgerät erfolgreich ohne Delamination herzustellen, ist es entscheidend, alle Blasen während des Einlegens der PC-Folie zu entfernen. Die PC-Folie kann langsam aus einem Winkel (ca. 15 bis 30 Grad von der PDMS-Prepolymeroberfläche entfernt) eingelegt werden, um die Bildung von Blasen beim Einsetzen der PC-Folie in das PDMS-Prepolymer zu verhindern. Bei Bedarf kann das gesamte PDMS-Prepolymer mit der eingebetteten PC-Folie für 10 min in den Exsikkator gelegt werden, der mit der Vakuumpumpe verbunden ist, um die eingeschlossenen Blasen auszutreiben. Schwebt die PC-Folie nach dem Vakuumvorgang nach oben, kann die PC-Folie mit einer Pipettenspitze auf die ausgehärtete PDMS-Schicht gedrückt werden. Wiederholen Sie bei Bedarf den Vakuum- und Pressvorgang.

Für die Zellexperimente ist das Fehlen von Luftblasen entscheidend für die mikrofluidische Zellkultur. Achten Sie darauf, dass beim Herstellen von Verbindungen keine Luftblasen in den gesamten mikrofluidischen Aufbau (einschließlich Spritzenpumpen, Schläuche und das mikrofluidische Gerät) eingebracht werden. Wenn innerhalb des mikrofluidischen Aufbaus aufgrund der Abnahme der Gaslöslichkeit unter der erhöhten Temperatur der Experimente im Inkubator Luftblasen entstehen, können alle experimentellen Komponenten (einschließlich der Spritzen und Schläuche) und Reagenzien (einschließlich des Wachstumsmediums, Pyrogallol und NaOH) vorher (mindestens 20 Minuten vor der Verwendung) in den Inkubator gegeben werden, um die Temperaturschwankungen zu minimieren. Spritzenpumpen erzeugen häufig Wärme aus dem Betrieb der Motoren innerhalb der Pumpen. In der Regel ist es akzeptabel, Spritzenpumpen in Inkubatoren zu betreiben; Überprüfen Sie jedoch während der Experimente die Temperatur des Inkubators. Wenn die Temperatur während der Versuche ansteigt, müssen zusätzliche Kühlvorgänge durchgeführt werden. Es können mehrere praktikable Kühlmethoden angewendet werden, wie z. B. das Platzieren einer Schachtel mit Eis in den Inkubator, das Reduzieren der Anzahl der im Inkubator platzierten Spritzenpumpen oder die Verwendung eines Inkubators mit einem Zwangskühlsystem.

Das in dieser Arbeit entwickelte mikrofluidische Zellkulturgerät PDMS-PC ist in der Lage, zuverlässig senkrechte chemische und Sauerstoffgradienten für Zellmigrationsstudien zu erzeugen. Die Einschränkung des entwickelten Geräts besteht darin, dass die erzeugten Sauerstoffgradientenprofile vom Gleichgewicht zwischen dem Sauerstofffluss, der durch chemisches Reaktionsabfangen angetrieben wird, und der Sauerstoffdiffusion aus der Umgebungsatmosphäre durch das Gerät und in das Medium abhängen. Dadurch können die Sauerstoffgradientenprofile im Inneren des Gerätes nicht beliebig gesteuert werden. Im Vergleich zu bestehenden mikrofluidischen Zellkulturplattformen ist das in dieser Arbeit entwickelte Gerät das erste, das in der Lage ist, Zellkulturstudien unter Kombinationen von chemischen und Sauerstoffgradienten durchzuführen. Das gesamte Gerät kann mit dem herkömmlichen Softlithographie-Replik-Formverfahren hergestellt werden, ohne langwieriges Ausrichten und teure Instrumente. Die Gradienten können numerisch simuliert und experimentell charakterisiert werden, um physiologischere mikroumgebungsähnliche Bedingungen für in vitro Zellstudien zu schaffen. Durch die Verwendung eines räumlich begrenzten chemischen Reaktionsverfahrens mit einer PC-Folie als Gasdiffusionsbarriere kann der Sauerstoffgradient ohne den Einsatz von Druckgasflaschen und ausgeklügelten Gasdurchflussregelungseinheiten erzeugt werden. Darüber hinaus benötigt der Aufbau nur geringe Mengen an Chemikalien (weniger als 10 ml pro Tag), um die Sauerstoffgradienten aufrechtzuerhalten. Da die Sauerstoffspannungsregelung lokal um den mikrofluidischen Kanal herum begrenzt ist und die Sauerstoffkonzentration in der Umgebung nicht stört, kann der gesamte Aufbau ohne zusätzliche Temperatur-, Feuchtigkeits- und CO₂ -Kontrollinstrumente in einem herkömmlichen Zellkultur-Inkubator platziert werden. Dadurch hat das entwickelte Gerät großes Potenzial für den praktischen Einsatz in biologischen Laboren.

Aufgrund technischer Einschränkungen wurde das zelluläre Verhalten unter Sauerstoffspannungen in der vorhandenen Literatur bisher selten untersucht. Mit Hilfe des in dieser Arbeit entwickelten Geräts können Zellkulturen unter Sauerstoffgradienten auf einfache Weise durchgeführt werden, was Zellstudien unter Sauerstoffgradienten stark fördert. Darüber hinaus kann ein ähnliches Funktionsprinzip angewendet werden, um andere physiologisch relevante gasförmige Gradienten, wie Kohlendioxid und Stickstoffmonoxid, für in vitro Zellkulturstudien zu erzeugen¹⁷. Diese Fähigkeiten zeigen, dass das mikrofluidische Gerät PDMS-PC ein großes Potenzial für verschiedene Zellkulturanwendungen aufweist, einschließlich Wirkstofftests und Zellproliferations- und Migrationsassays, um In-vitro-Zellkulturstudien voranzutreiben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1 ml Spritze	Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ	302104
1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen	Smartgene	6011-000
10 ml Spritze	Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ	302151
15 ml Zentrifugenröhrchen	ThermoFisher Scientific,Waltham, MA	Falcon 352096
150 mm Petrischale	Dogger Science	DP-43151
1H,1H,2H,2H-Perfluoroctyltrichlorsilan	Alfa Aesar, Ward Hill, MA	78560-45-9
3 ml Spritze	Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ	302118
4'' Silizium Dummy Wafer	Wollemi Technical, Taoyuan, Taiwan
Aceton	ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan	AH3102-000000-72EC
AG Double Expose Mask Aligner	M& R Nano Technology, Taoyuan, Taiwan	AG500-4D-D-V-S-H
Antibiotisch-antimyotische Lösung	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA	GIBCO 15240-062
Biopsie-Stanze	Miltex, Plainsboro, NJ	33-31
Stumpfe Nadel	JensenGlobal, Santa Barbara, CA	Gauge 14
Bright-Line-Hämozytometer	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	Z359629	für die Zellzählung
Buffered Oxide Etch	ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan	PH3101-000000-72EC
Zellkultur-Inkubator	Caron, Marietta, OH	6016-1
COMSOL Multiphysics	COMSOL, Burlington, MA	Ver. 4.3b	für die numerische Simulation chemischer Gradienten im Gerät
D-PBS	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA	GIBCO 14190-144
Exsikantor	A-VAC Industries, Anaheim, CA	35.10001.01
DMEM/F12+GlutaMax-1	ThermoFisher Scientific,Waltham, MA	GIBCO 10565-018
Fötales Rinderserum	ThermoFisher Scientific,Waltham, MA	GIBCO 10082
Fibronektin aus menschlichem Plasma	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	F2006
Invertiert Fluoreszenzmikroskop	Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland	DMIL LED
Isopropylalkohol (IPA)	ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan	CMOS112-00000-72EC
JuLi Smart Fluorescence Cell Imager	NanoEnTek, Seoul, Korea	DBJ01B
Mechanischer Kongressofen	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA	Lindberg Blue M MO1450C
NaOH	Showa Chemical Industry, Tokio, Japan	1943-0150
Plasmabehandlungssystem	Nordson MARCH, Concord CA	PX-250	für die Oberflächenbehandlung von Sauerstoffplasma-Polycarbonat
(PC)-Folie	Quantum Beam Technologies, Tainan Taiwan
Polydimehtylsiloxan (PDMS)	Dow Corning, Midland, MI	SYLGARD 184
Pyrogallol	Alfa Aesar, Ward Hill, MA	A13405
Abnehmbarer Klebekitt	3M	860
Sorvall Legend Mach 1.6R Tischzentrifuge	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA
Spin Coater	ELS Technology, Hsinchu, Taiwan	ELS 306MA
SU-8 2050	MicroChem, Westborough, MA	SU-8 2050
SU-8 Entwickler	MicroChem, Westborough, MA	Y020100
Chirurgische Klinge	Feather, Osaka, Japan	5005093	zum PDMS-Schneiden
Spritzenpumpe	Chemyx, Houston, TX	Fusion 400
T75 Zellkulturflasche	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA	Nunc 156367
Trypanblaue Lösung, 0,4	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA	15250061
Trypsin-EDTA	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA	GIBCO 25200
Tygon PTFE-Schlauch	Saint-Gobain Performance Plastics, Akron, OH
Tygon Schlauch	Saint-Gobain Performance Plastics, Akron, OH	621