Methodenartikel

Biosensing Motor Neuron Membran Potenzial in Live Zebrafisch Embryos

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DOI:

10.3791/55297

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26. Juni 2017

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1Department of Medical Biotechnology and Translational Medicine, Università degli Studi di Milano, 2Department of Neuroscience; Department of Cell Biology, Howard Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine, 3Program in Cellular Neuroscience, Neurodegeneration and Repair, Yale University School of Medicine, 4Department of BioSciences, Università degli Studi di Milano

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die hier beschriebenen Protokolle ermöglichen die Untersuchung der elektrischen Eigenschaften erregbarer Zellen unter den meisten nicht-invasiven physiologischen Bedingungen, indem Zebrafischembryonen in einem in vivo-System zusammen mit einem auf Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) basierenden genetisch kodierten Spannungsindikator (GEVI) verwendet werden, der selektiv in dem interessierenden Zelltyp exprimiert wird.

Zusammenfassung

Die hier beschriebenen Protokolle ermöglichen es Forschern, die Zellkommunikation zu untersuchen, ohne die Integrität der Umgebung, in der sich die Zellen befinden, zu verändern. Konkret wurden sie entwickelt, um die elektrische Aktivität von erregbaren Zellen, wie z.B. Spinalneuronen, zu analysieren. In einem solchen Szenario ist es entscheidend, die Integrität der Wirbelsäulenzelle zu erhalten, aber es ist auch wichtig, die Anatomie und die physiologische Form der beteiligten Systeme zu erhalten. In der Tat muss das Verständnis der Art und Weise, wie das Nervensystem - und andere komplexe Systeme - funktionieren, auf einem systemischen Ansatz beruhen. Aus diesem Grund wurde der lebende Zebrafischembryo als Modellsystem ausgewählt und die Spannungsänderungen der Spinalneuronenmembran bewertet, ohne die physiologischen Bedingungen der Embryonen zu beeinträchtigen.

Hier wird ein Ansatz beschrieben, der die Verwendung von Zebrafischembryonen mit einem FRET-basierten Biosensor kombiniert. Zebrafischembryonen zeichnen sich durch ein stark vereinfachtes Nervensystem aus und eignen sich aufgrund ihrer Transparenz, die den Einsatz von fluoreszenzbasierten Spannungsindikatoren an der Plasmamembran während der Entwicklung des Zebrafisches ermöglicht, besonders für bildgebende Anwendungen. Die Synergie zwischen diesen beiden Komponenten ermöglicht es, die elektrische Aktivität der Zellen in intakten lebenden Organismen zu analysieren, ohne den physiologischen Zustand zu stören. Schließlich kann dieser nicht-invasive Ansatz mit anderen Analysen (z. B. spontanen Bewegungsaufzeichnungen, wie hier gezeigt) koexistieren.

Einleitung

In-vivo- systemische Komponentenanalyse ermöglicht es Wissenschaftlern, zelluläres Verhalten auf die zuverlässigste Weise zu untersuchen. Dies trifft besonders dann zu, wenn die zu prüfende Aktivität stark durch Zell-Zell-Wechselwirkungen (sowohl kontakt- als auch berührungsabhängig) beeinflusst wird, wie im Nervensystem, wo Membranspannungsänderungen die Kommunikation zwischen erregbaren Zellen antreiben. Das Verständnis der Informationen, die von diesen elektrischen Signalen codiert werden, ist der Schlüssel zum Verständnis der Art und Weise, wie das Nervensystem sowohl in physiologischen als auch in Krankheitszuständen arbeitet.

Um zelle elektrische Eigenschaften in den meisten nicht-invasiven physiologischen Bedingungen zu untersuchen, wurden vor kurzem mehrere genetisch codierte Spannungsindikatoren entwickelt 1 . Im Gegensatz zu den bisherigen Generationen von optischen Spannungssensoren (hauptsächlich spannungsempfindlichen Farbstoffen) 2 erlauben GEVIs in vivo Analysen des intakten neuronalen Systems undIhre Expression kann auf bestimmte Zelltypen oder Populationen beschränkt sein.

Der Zebrafisch-Embryo ist der in vivo "Substrat" ​​der Wahl, um das große Potenzial zu nutzen, das GEVIs zugeschrieben wird. Tatsächlich ermöglicht das Zebrafisch-Modell dank seiner optischen Klarheit und seines vereinfachten, aber dennoch evolutionär konservierten Nervensystems die einfache Identifikation und Manipulation jeder zellularen Komponente in einem Netzwerk. In der Tat führte die Beschäftigung der FRET-basierten GEVI Mermaid 3 zur Identifizierung von prä-symptomatischen Veränderungen im Wirbelsäulenmotor-Neuron-Verhalten in einem Zebrafisch-Modell der amyotrophischen Lateralsklerose (ALS) 4 .

Das folgende in vivo- Protokoll beschreibt, wie die elektrischen Eigenschaften von Wirbelsäulenmotor-Neuronen in intakten Zebrafisch-Embryonen, die Meerjungfrau in einer neuronalspezifischen Weise exprimieren, überwacht werden. Darüber hinaus zeigt es, wie pharmakologisch induzierte chanGes in solchen elektrischen Eigenschaften können mit Veränderungen in der Häufigkeit der embryonalen Spontanspulen verbunden sein, die stereotypische motorische Aktivität, die das Bewegungsverhalten des Zebrafischs in sehr frühen Entwicklungsstadien charakterisiert.

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Protokoll

1. pHuC_Mermaid-Plasmid-Erzeugung

HINWEIS: Meerjungfrau ist ein Biosensor, der durch die Paarung der spannungsempfindlichen Domäne (VSD) der Ciona intestinalis (jetzt) ​​entwickelt wurde Ciona robusta ) 5 Spannungssensor mit Phosphatase (Ci-VSP) mit dem FRET-Partner Fluorophoren Umi-Kinoko Green (mUKG: Donor) und einer monomeren Version des orange emittierenden fluoreszierenden Proteins Kusabira Orange (mKOk: Akzeptor). Für diesen Biosensor erhöhen Konformationsänderungen der VSD-Domäne, die durch Membrandepolarisation induziert werden, die Nähe der Donor- und Akzeptor-Fluoreszenzproteine, wodurch die Energieübertragung zwischen ihnen erhöht wird (Erhöhung des FRET-Verhältnisses) 3 . Die VSD sichert die effiziente Lokalisierung des Biosensors an der Plasmamembran. Die neuronale Expression des Biosensors (im Rückenmark, das Signal ist sowohl bei Interneuronen als auch bei motorischen Neuronen nachweisbar) wird durch Klonierung der Meerjungfrau opEn Leserahmen (ORF) unter dem Zebrafisch-pan-neuronalen Promotor HuC 6 .

  1. Amplifizierung durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) des Mermaid-ORF aus dem pCS4 + Meerjungfern-Plasmid 3 mit Pfu (Korrekturlesen) DNA-Polymerase unter Verwendung des T3 Universal-Primers und des Mermaid Sma I-Primers (5'TATCCCGGGATTCGACGGTTCAGATTTTA), um eine SmaI- Restriktionsstelle stromaufwärts einzuführen Der Meerjungfrau ORF.
    1. Verwenden Sie die folgende PCR-Mischung: 0,5 μl Pfu-DNA-Polymerase, 7,5 μl des spezifischen 10x Puffers, 1 μl 10 mM dNTPs, 2,5 μl Dimethylsulfoxid (DMSO), 0,5 μl (50 ng) des Plasmidpräparates und 1 ΜL von 20 & mgr; M Stammlösungen von jedem Primer in einem Gesamtvolumen von 50 & mgr; l
    2. Die PCR-Mischung für 15 s bei 95 ° C erhitzen, für 15 s bei 50 ° C betragen und für 4 min bei 72 ° C für insgesamt 35 Zyklen verlängern.
  2. Gel-reinigen die spezifischen stumpfPCR-Produkt unter Verwendung eines handelsüblichen Gelreinigungskits nach dem Protokoll des Herstellers.
  3. Klonen Sie das DNA-Fragment in den pCMV-SC-stumpfen Vektor nach dem Protokoll des Herstellers.
  4. Linearisieren Sie das Mermaid-positive Plasmid (genannt pCMV-SC_Mermaid) mit dem Sma I Restriktionsenzym für die folgende Insertion des HuC-Promotors.
    1. Stellen Sie die Restriktionsreaktion wie folgt ein: 0,5 μl (10 U) Sma I Restriktionsenzym, 2 μl des Kit 10x Puffers und 5 μg Plasmid DNA in einem Gesamtvolumen von 20 μl. Inkubieren Sie die Reaktion bei 25 ° C für 1 h.
  5. Gel-reinigen des verdauten Plasmids unter Verwendung eines handelsüblichen Gelreinigungskits nach dem Protokoll des Herstellers.
  6. PCR-amplifizieren den HuC-Promotor (pHuC) mit Pfu-DNA-Polymerase und Zebrafisch-Genom-DNA als Matrize unter Verwendung eines Paares von HuC-spezifischen Primern (HuCprom-forw1_SalI: 5'-GTAGTCGACCAGACTTGTCAAAAGGGTCCA und HuCproM-rev1: 5'-TCCATTCTTGACGTACAAAGATG) und überspannt eine 3,150-bp-Region stromaufwärts des ATG.
    1. Stellen Sie die PCR-Mischung nach folgendem Schema ein: 0,5 μl Pfu-DNA-Polymerase, 7,5 μl des spezifischen 10x-Puffers, 1 μl 10 mM dNTPs, 2,5 μl DMSO, 200 ng genomische DNA und 1 μl 20 μM Stammlösungen von jedem Primer in einem Gesamtvolumen von 50 μl.
    2. Nach einem anfänglichen Schritt von 2 min bei 95 ° C wird die PCR-Mischung für 15 s bei 95 ° C erhitzt, für 15 s bei 50 ° C vorgelegt und für 4 min bei 72 ° C für insgesamt 35 Zyklen verlängert .
  7. Gel-reinigen Sie das spezifische stumpfe PCR-Produkt unter Verwendung eines handelsüblichen Gelreinigungskits nach dem Protokoll des Herstellers.
  8. Ligat eine äquimolare Menge des gereinigten pCMV-SC_Mermaid (Schritt 1.5) und der pHuC-DNA (Schritt 1.7) unter Verwendung von 1 μl T4-DNA-Ligase und 1 μl des spezifischen 10X-Puffers in einem Gesamtvolumen von 10 μl. Inkubieren Sie die Reaktion für 16 h bei4 ° C
  9. Umwandlung eines Aliquots kompetenter Zellen mit 5 μl der Ligationsreaktion (Schritt 1.8) nach den Anweisungen des Herstellers.
  10. Wählen Sie die pHuC-positiven Klone (pHuC_Mermaid) mit dem in die richtige Orientierung eingeführten Promotor durch eine Sal I- Eco RV-Doppelverdauung (die Sal I-Restriktionsstelle wurde stromaufwärts des Promotorfragments in Schritt 1.6 eingefügt, während die Eco RV-Restriktionsstelle Ist stromabwärts der Polyadenylierungsregion, PolyA, des pCMV-SC-Plasmids angeordnet).
    1. Stellen Sie die Restriktionsreaktion wie folgt ein: 0,5 μl (10 U) sowohl der Sal I als auch der Eco RV Restriktionsenzyme, 2 μl des Kit10X Puffers und 1 μg pHuC_Mermaid DNA in einem Gesamtvolumen von 20 μl. Inkubieren Sie die Reaktion bei 37 ° C für 1 h. Führen Sie die Reaktionen auf ein Agarosegel.

2. Embryo Mikroinjektion

  1. Übertragen Sie den befruchteten zBGs, erhalten aus Wildtyp (AB-Stamm) oder Sod1-G93R erwachsenen Zebrafisch 4 zu einer 10 mm Petrischale unter Verwendung einer Plastikpipette.
  2. Spülen Sie die Embryonen in kaltem (4 ° C) Fischwasser und mischen Sie sie sofort in das Eigelb mit 200 pg pHuC_Mermaid-Plasmid unter Verwendung eines Mikroinjektors (für eine Gesamt- und detaillierte Beschreibung des Mikroinjektionsprozesses siehe Literatur 7 und 8).
  3. Mit einer Plastikpipette die Embryonen in eine Petrischale überführen und in Fischwasser bei 28 ° C inkubieren bis sie die gewünschte Entwicklungsstufe (20-24 h nach der Befruchtung, hpf) für die folgenden Analysen erreichen.

3. Spontane Tail Coiling Analyse

HINWEIS: Bewerten Sie das spontane Schwanzaufwicklungsverhalten in 20-24 hpf Embryonen mit oder ohne Drogenriluzol.

  1. Übertragen Sie einen Embryo auf eine 90-mm-Runde Petrischale mit Fischwasser mit 0,2% DMSO (Riluzol-Träger) gefüllt und manuell dechorionieren mit twO Juwelier Pinzette mit scharfen Spitzen. Den Embryo für 5 min inkubieren.
  2. Erkennung der Schwanzaufwicklung bei RT während einer 1-minütigen Videoaufnahme mit einer Digitalkamera, die auf einem Stereomikroskop montiert ist. Erwerben Sie Zeitreihen zu einer Zeitauflösung von 30 Bildern / s.
  3. Berechnen Sie die Häufigkeit der spontanen Schwanzwicklungen, indem Sie die Anzahl der Biegungen (sowohl kontralateral als auch ipsilateral) pro Zeiteinheit zählen.
  4. Um die Wirkung des Medikamenten-Riluzols zu bewerten, verwenden Sie vorsichtig eine Plastik-Pasteur-Pipette, um den Embryo auf eine neue 90-mm-Petrischale zu bringen, die mit Fischwasser mit 5 μM Riluzol gefüllt ist.
    1. Inkubieren Sie den Embryo für 5 Minuten, bevor Sie ein 1-minütiges Video aufzeichnen und die Verhaltensanalyse wie oben durchführen.

4. Imaging-Setup für Meerjungfrau Biosensor Visualisierung in lebenden Embryonen: Simultane Erkennung von Spender- und Akzeptorsignalen

  1. Montieren Sie die 20 - 24 hpf Embryonen in 1% niedrigschmelzender Agarose in Fischwasser bei37 ° C in einer 35 mm Glasboden-Aufnahmeschale. Orientiere die Embryos an ihren Seiten. Warten Sie, bis die Agarose bei Raumtemperatur erstarrt.
  2. Übertragen Sie die bildgebende Schale auf die Bühne eines umgekehrten konfokalen auf einem invertierten Mikroskop montiert. Identifizieren Sie Motorneuronen, die den Biosensor mit einem 20X-Objektiv (0,7 numerische Apertur, NA) ausdrücken, indem Sie das mUKG mit der 488 nm Argon-Laserlinie anregen und seine Emission zwischen 495 und 525 nm aufzeichnen.
  3. Für eine FRET-Messung wird mUKG, der Spender des FRET-Paares, mit der 488 nm Laserlinie angeregt. Gleichzeitig mit einem Resonanzscanner, der bei 8000 Hz im bidirektionalen Modus arbeitet, die von dem Donor emittierte Fluoreszenz (zwischen 495 und 525 nm) und die vom mKOk-Akzeptor emittierte Fluoreszenz (zwischen 550 und 650 nm, FRET-Kanal). Falls vorhanden, verwenden Sie den 473 nm Laser.
    HINWEIS: Die Erregungseffizienz des Spenders wird leicht reduziert (85% statt 93% bei 488 nm), aber die Kreuzerregung des Akzeptors wirdAuch reduziert werden (von 17% bei 488 nm bis 9% bei 473 nm Laserlinie).
  4. Um die Phototoxizität und die Fluorophor-Bleiche zu reduzieren, minimieren Sie die Beleuchtung der Probe durch Verringerung der Leistung der Laserlinie (auf dem Strahlengangfenster der Erfassungssoftware).
  5. Optimieren Sie die Erregung, um den Verstärkungs- und Offset-Parametern zu entsprechen, die zu Beginn des Experiments eingestellt sind und während der gesamten Sitzung konstant gehalten werden. Um den Offset einzustellen, ändern Sie die Farbe des Bildes in Intensitätswerte (mit der Q-Look-Up-Tabelle) und drehen Sie beim Scannen mit dem Laser den Offset-Regler (smart offset), so dass die Hintergrundpixel eine Intensität haben Höher als null. Mit der gleichen Nachschlagtabelle, durch Umschalten des Lasers beim Scannen, drehen Sie den Verstärkungsknopf (intelligente Verstärkung), um das Signal-Rausch-Verhältnis zu maximieren, wobei darauf geachtet wird, dass gesättigte Pixel vermieden werden.
  6. Mit einem geöffneten Pinhole (2 luftige Einheiten) erwerben 16-Bit-Bilder, um einen ausreichenden Dynamikbereich für quantitativ zu liefernE analysiert. Vermeiden Sie die Mittelung, um die Erfassungsgeschwindigkeit zu erhöhen und das Photobleichen zu minimieren.
  7. Wählen Sie im Software-Erfassungsfenster aus dem Dropdown-Menü eine Bildfeldgröße von 512 x 64 Pixel (Pixelgröße: 605 nm) aus.
  8. Wählen Sie aus dem Erfassungsmodus-Fenster xyt (Zeitraffer auf einer einzelnen xy-Ebene) aus dem Dropdown-Menü und notieren Sie die Änderungen der Embryo-Wirbelsäulenneuronspannung durch Erfassen einer einzelnen xy-Ebene, indem Sie die Erfassungsparameter einstellen, um jeweils ein Bild aufzuzeichnen Ms für 1 min.
  9. Um die Wirkung der Riluzol-Verabreichung auf die Membrandepolarisation im selben Neuron zu bewerten, erhält man nach der Zugabe von Fischwasser, das 5 μM Riluzol enthält, einen neuen Datensatz.
  10. Für die FRET-Analyse verwenden Sie den ImageJ-Makro Biosensor_FRET (Ausdrücken von einkettigen FRET-Biosensoren.
  11. Bewerte das Basalmembran-FRET-Verhältnis jedes Neurons bei t 1 als ((FRET mean - FRET-Hintergrund) / (Donor mean - Donor Hintergrund)), wo FRET und DonOder mittlere Intensität ist die mittlere Fluoreszenzintensität, die in der gleichen Region von Interesse (ROI) berechnet wird, die um die Zelle für jeden erworbenen Kanal gezogen wird, und der FRET- und Donorhintergrund ist die mittlere Fluoreszenzintensität, die in einem ROI des Gesichtsfeldes ohne die Fluoreszenzprobe berechnet wird.
    HINWEIS: Eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Beschreibung der Verwendung des Plugins finden Sie auf der Website www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fret .
  12. Verwenden Sie eine Grafiksoftware, um die Frequenz, die Amplitude und die Dauer der Depolarisation zwischen verschiedenen experimentellen Paradigmen zu vergleichen. Vergleichen Sie zwei Gruppen mit einem ungepaarten Student's t- test und betrachten Mittelwerte als statistisch anders, wenn P <0,05.

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Ergebnisse

Ein Expressionsvektor, der die FRET-basierte Mermaid-Biosensor-codierende Sequenz unter der Kontrolle des pHuC-pan-neuronalen Promotors trägt, der die Synthese des Proteins ausschließlich im Nervensystem antreibt, wurde mittels einer Mikroinjektion in Einzelzell-befruchtete Eier zugeführt Um transiente transgene Embryos zu erhalten ( Abbildung 1 , Linke Tafel). Nach der Beherrschung der Mikroinjektionstechnik lag der Prozentsatz der Meerjungfrau-positi...

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Diskussion

Das hier vorgestellte Protokoll erlaubte es uns, die Assoziation zwischen den elektrischen Eigenschaften von Zebrafisch-Embryo-Wirbelsäulenmotor-Neuronen und dem spontanen Wickelverhalten zu erforschen, die früheste stereotypische motorische Aktivität, die um 17 hpf der embryonalen Entwicklung auftritt und bis 24 hpf 10 dauert.

Unser Ansatz bietet Forschern ein Werkzeug, um das neuronale System der intakten Embryonen zu studieren, wobei die Komplexität der Wechselwirk...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren danken Simona Rodighiero für ihre unschätzbare Unterstützung bei der FRET-Bildgebungsanalyse.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Agarose mit niedrigem SchmelzpunktSigma-AldrichA9414
DMSO Sigma-AldrichW387520
RiluzolSigma-AldrichR116
Pfu Ultra HQ DNA-Polymerase Agilent Technologies - Stratagene Products Division600389
T3 Universal-Grundierung Sigma-Aldrich
Wizard SV Gel und PCR Clean-Up SystemPromegaA9280
Universal SmaI Primer Eurofins
StrataClone Säugetier-Expressionsvektor-System / pCMV-SC stumpfer VektorAgilent Technologies - Geschäftsbereich Stratagene Products
SmaI New England BiolabsR0141S
T4 DNA-LigasePromegaM1801
SalINew England BiolabsR0138S
EcoRVNew England BiolabsR0195S
35 mm, Bildgebungsschale mit GlasbodenIbidi81151
PinzetteSigma-AldrichF6521
StereomikroskopLeica MicrosystemsM10 F
DigitalkameraLeica MicrosystemsDFC 310 FX
Leica Application Suite 4.7.1 Software Leica Microsystems
QuickTime Player, v10.4Apple
Konfokalmikroskop (invers)Leica MicrosystemsTCS SP5
Mikroinjektor Eppendorf Femtojet
ImageJ Makro Biosensor_FRET 
GraphPad Prism 6.0c GraphPad Software, Inc
240228

Referenzen

  1. Knöpfel, T., Gallero-Salas, Y., Song, C. Genetically encoded voltage indicators for large scale cortical imaging come of age. Curr Opin Chem Biol. 27, 75-83 (2015).
  2. Chemla, S., Chavane, F. Voltage-sensitive dye imaging: Technique review and models. J Physiol Paris. 104 (1-2), 40-50 (2010).
  3. Tsutsui, H., Karasawa, S., Okamura, Y., Miyawaki, A. Improving membrane voltage measurements using FRET with new fluorescent proteins. Nat Methods. 5 (8), 683-685 (2008).
  4. Benedetti, L., et al. INaP selective inhibition reverts precocious inter- and motorneurons hyperexcitability in the Sod1-G93R zebrafish ALS model. Sci Rep. 6, 24515(2016).
  5. Pennati, R., et al. Morphological differences between larvae of the Ciona intestinalis species complex: hints for a valid taxonomic definition of distinct species. PLoS ONE. 10 (5), 0122879(2015).
  6. Park, H. C., et al. Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic zebrafish with fluorescent neurons. Dev Biol. 227 (2), 279-293 (2000).
  7. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. (27), (2009).
  8. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
  9. Drapeau, P., et al. Development of the locomotor network in zebrafish. Prog Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).
  10. Brustein, E., et al. Steps during the development of the zebrafish locomotor network. J Physiol Paris. 97 (1), 77-86 (2003).
  11. Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish. J Neurosci Methods. 88, 1-13 (1999).
  12. Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, Suppl 1S7 (2007).
  13. Sungmoo, L., et al. Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors. J Vis Exp. (108), e53566(2016).

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Schlagwörter

FRET Biosensorspinale NeuronenKonfokalmikroskopieFluoreszenzbildgebunggenetische KodierungSpannungsindikatorenRiluzol BehandlungTail Coiling Analyse

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