Identifizierung von Plasmodesmal Lokalisierung Sequenzen in Proteine In Planta

Summary

Pflanze interzelluläre Verbindungen, die Plasmodesmata (Pd), spielen zentrale Rollen im Werk Physiologie und Pflanzenvirus Interaktionen. Entscheidend für den Pd-Transport sind Signale, die Proteine zu Pd direkte sortieren. Unser Wissen über diese Sequenzen ist jedoch noch in den Kinderschuhen. Wir beschreiben eine Strategie zur te-Lokalisierung-Signalen in Pd gezielt Proteine zu identifizieren.

Abstract

Plasmodesmata (Pd) sind Zell-Zell-Verbindungen, die als Gateways fungieren durch die kleine und große Molekülen zwischen den Pflanzenzellen transportiert werden. Während Pd Transport von kleinen Molekülen, wie Ionen und Wasser, angenommen wird, dass passiv auftreten, Zell-Zell-Transport von biologischen Makromolekülen, solche Proteine am ehesten erfolgt über einen aktiven Mechanismus, spezifische targeting Signale auf der Molekül transportiert. Die Knappheit der identifizierten Plasmodesmata (Pd) Lokalisierung Signale (PLSs) hat stark eingeschränkt, das Verständnis der Protein-Sortierung Bahnen beteiligt zu Pflanzen, makromolekulare Transport von Zelle zu Zelle und Kommunikation. Aus einer Fülle von Pflanzen endogene und virale Proteine bekannt für den Verkehr durch Pd, nur drei PLSs gemeldet wurden bis heute wurden alle von endogenen pflanzlichen Proteinen. So ist es wichtig, eine zuverlässige und systematische experimentelle Strategie um einen Funktionsablauf PLS zu identifizieren, die sowohl notwendig und ausreichend für Pd-targeting, direkt im Wohnzimmer zu entwickeln Pflanzenzellen. Hier beschreiben wir eine solche Strategie verwenden als Paradigma der Zelle zu Zelle Bewegung Protein (MP) das Tabakmosaikvirus (TMV). Diese Experimente, die identifiziert und charakterisiert die erste virale PLS plant, kann für Entdeckung der PLS-Sequenzen in den Pd-bezogenen Proteinen angepasst werden.

Introduction

Plasmodesmata (Pd) Funktion als Kanäle für den interzellulären Transport der wichtigsten Regulatoren der Pflanzenentwicklung und Morphogenese von Transkriptionsfaktoren bis hin zu mRNA und kleine RNA-Moleküle. Darüber hinaus ist dieser makromolekularen Transport Pd durch die meisten Pflanzenviren für ihre interzellulären Ausbreitung während der Infektion ausgelastet; um Pd zu durchlaufen, entstanden Pflanzenviren spezialisierte Proteinen bezeichnet Bewegung Proteine (MPs), die gezielt auf Pd^{1,2,3,4,5,<....}

Protocol

(1) Pflanzenmaterial

1. Wahl der Pflanzenarten
2. Verwenden Sie die Pflanzenarten heimisch in das Protein von Interesse, d. h., die dieses Protein für körpereigene Proteine kodiert oder der natürliche Wirt für den Erreger für virale Proteine darstellt. Darüber hinaus müssen die ausgewählten Pflanzenarten der gewählten Methode der Transienten genetische Transformation zugänglich sein.
   Hinweis: Die Studien beschäftigen routinemäßig Nicotiana Benthamiana, die einen guten Gastgeber für TMV darstellt und effizient durch die gentechnische Transformation mit Agrobakterien-vermittelten Technik, d. h., Agroinfiltration umgewandelt (s....

Results

Die repräsentativen Daten, die treu illustrieren die beschriebenen Protokolle erwarteten Ergebnisse und der TMV MP PLS zu identifizieren, werden angepasst von Yuan Et al. ²¹. Abbildung 1A zuerst fasst wichtige Konstrukte, die mit dem Ausdruck der Full-length TMV MP (1-268), TMV MP PLS (bestehend aus den ersten 50 Aminosäurereste des Proteins, 1-50), und seine Alanin Scannen V4A Derivate mit GFP (generiert als verschmolzen beschriebenen Sch.......

Discussion

Dieses Protokoll hat vier Kern-Bestandteile: das Konzept der Identifizierung einer Sequenz, die notwendig und ausreichend für die Zielgruppenadressierung auf Pd, systematische Einteilung des Proteins des Interesses der Fragmente, die in der Länge, degressiv sind Absicherung der getesteten Fragmente, ein Autofluorescent Protein, die dient sowohl als Tag als makromolekulare Fracht- und funktionelle Assay für Pd-targeting in lebenden Pflanzen Gewebe nach transiente Expression von den getesteten Fusionsproteinen. Beachten Si.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM)	Zeiss	LSM5	Jedes CLSM mit ähnlichen Fähigkeiten ist geeignet
Zen-Software für die Bildgebung von konfokalen Mikroskopen	Zeiss	Version 2009 Die	Software sollte mit dem von CLSM verwendeten
ortsgerichteten Mutagenese-Kit Quickchange II	Agilent	200523
Acetosyringon	Sigma-Aldrich	D134406
MES	Sigma-Aldrich	69892
Spritzen ohne Nadeln	BD	309659
MgCl2	FisherScientific	M33-500
Spectinomycin	Sigma-Aldrich	S4014
Rifampicin	Sigma-Aldrich	R3501
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A0166