Während die Infiltrierung von Makrophagen kontinuierlich zu erwachsenen Geweben aus zirkulierenden Vorläufern rekrutiert wird, säen sich residente Makrophagen ihr Gewebe während der Entwicklung, wo sie ohne weitere Eingaben von Vorläufern aufrechterhalten werden. Die Vorläufer für Resident-Makrophagen wurden vor kurzem identifiziert. Hier stellen wir Methoden für die genetische Schicksalskartierung der residenten Makrophagen-Vorläufer vor.
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Methodenartikel
Identifizierung von Erythromyeloid Progenitoren und deren Nachkommen in der Maus Embryo Durch Durchflusszytometrie
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Makrophagen sind professionelle Phagozyten aus dem angeborenen Arm des Immunsystems. Im stationären Zustand werden sessile Makrophagen in erwachsenen Geweben gefunden, wo sie als Frontline-Sentinels der Infektion und Gewebeschädigung wirken. Während andere Immunzellen kontinuierlich von hämatopoetischen Stammzellen und Progenitorzellen (HSPC), die sich im Knochenmark befinden, erneuert werden, wurde gezeigt, dass eine Reihe von Makrophagen, die als Resident-Makrophagen bekannt sind, in Geweben ohne Input von Knochenmark-HSPCs selbstgehalten werden. Diese Linie wird durch Mikroglia im Gehirn, Kupffer Zellen in der Leber und Langerhans Zellen in der Epidermis unter anderem veranschaulicht. Die Darm- und Colon-Lamina-Propria sind die einzigen erwachsenen Gewebe ohne HSPC-unabhängige Resident-Makrophagen. Neuere Untersuchungen haben festgestellt, dass residente Makrophagen aus der extra-embryonalen Dottersack-Hämatopoese von Progenitor (en) stammen, die sich von fetalen hämatopoetischen Stammzellen (HSC) unterscheiden. Unter Dottersack endgültige Hämatopoese, eRythromyeloid-Vorläufer (EMP) ergeben sowohl erythroide als auch myeloide Zellen, insbesondere residente Makrophagen. EMP werden nur innerhalb des Dottersackes zwischen E8.5 und E10.5 Tagen der Entwicklung erzeugt und sie wandern in die fetale Leber, sobald die Zirkulation verbunden ist, wo sie sich erweitern und differenzieren bis mindestens E16.5. Ihre Nachkommenschaft umfasst Erythrozyten, Makrophagen, Neutrophilen und Mastzellen, aber nur EMP-abgeleitete Makrophagen bestehen bis zum Erwachsenenalter in Geweben. Die vorübergehende Natur von EMP-Emergenz und die zeitliche Überlappung mit HSC-Generation macht die Analyse dieser Vorläufer schwierig. Wir haben ein Tamoxifen-induzierbares Schicksal-Mapping-Protokoll auf der Grundlage der Expression des Makrophagen-Cytokin-Rezeptor-Csf1r-Promotors zur Charakterisierung von EMP- und EMP-abgeleiteten Zellen in vivo durch Durchflusszytometrie etabliert.
Einleitung
Es gibt mehrere aufeinanderfolgende, aber überlappende Wellen von hämatopoetischen Vorläufern während der Entwicklung, deren myeloide Nachkommen im Erwachsenenalter bleiben. Zuerst treten in der Maus-Dottersack 1 , 2 zwischen E7.5-E8.25 unipotent "primitive" Vorläufer auf und geben embryonale Makrophagen ohne monozytische Zwischenstufe hervor. Ob Makrophagen aus primitiven Vorläufern im erwachsenen Gehirn bestehen, da die Mikroglia ein Gegenstand der aktiven Untersuchung bleibt. Zweitens entstehen Erythro-Myeloid-Vorläufer (EMPs) im Eigelb-Sack bei E8.5, treten in den Blutkreislauf ein und kolonisieren den Embryo. EMPs entstehen aus dem hämogenen Endothel des Dottersackes in einem Runx1-abhängigen endothelial-zu-hämatopoetischen Übergang 3 , 4 . Während EMP in Makrophagen im Dottersack differenzieren kann, kolonisieren sie auch die fetale Leber vom embryonalen Tag (E) 9 5 und unterscheiden sichIn Erythrozyten, Megakaryozyten, Makrophagen, Monozyten Granulozyten und Mastzellen eindringen 6 . Die Makrophagen, die sich aus EMPs ergeben, zeigen proliferative Kapazitäten in Entwicklungs- und Erwachsenengeweben. Ob EMP-abgeleitete Makrophagen die Monozytenstadien der Differenzierung umgehen, ist noch umstritten, da sehr wenig über ihren Differenzierungsweg 7 , 8 bekannt ist . Schließlich treten Hämatopoetische Stammzellen (HSCs) bei E10.5 innerhalb des Embryos aus der Aorta-Gonaden-Mesonephros-Region auf und wandern in die fetale Leber. HSCs mit Langzeit-Wiederauffüllungsvermögen werden erst nach E11 (bei der 42 Somite-Pair-Stufe) erkannt 9 . Dort erweitern und unterscheiden sie sich von E12.5 bis die endgültige Hämatopoese beginnt, sich auf das Knochenmark zu verlagern, das die vorherrschende Stelle der Blutzellproduktion für die Dauer des postnatalen Lebens wird 10 .
Die spAtiale und zeitliche Überlappung beim Auftauchen sowie gemeinsame immuno-phänotypische Marker hat damit unsere Fähigkeit, die spezifischen Beiträge dieser Wellen von embryonalen hämatopoetischen Vorläufern zu unterscheiden, behindert. Während sowohl EMP als auch HSC in einer Runx1-abhängigen Weise erzeugt werden und der Transkriptionsfaktor Myb und der Wachstumsfaktor-Rezeptor Csf1r (Colony-Stimulating Factor 1 Receptor, auch bekannt als Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor-Rezeptor) genannt werden, können sich EMPs unterscheiden HSCs durch ihren Mangel an lymphoiden Potenzialen, sowohl in vitro als auch in vivo , ihr Mangel an langfristigem Rezyklierungspotential und mangelnde Oberflächenexpression des Linienmarkers Sca-1 11 . Genetische Schicksal-Mapping-Modelle sind erforderlich, um Makrophagen-Ontogenese zu charakterisieren, da sie die Ausrichtung embryonaler Progenitoren in einer zellspezifischen und zeitspezifischen Weise ermöglichen. Hier stellen wir das Schicksal-Mapping-Protokoll vor, das in unserem Labor verwendet wird, um zwischen den beiden Linien zu unterscheidenS von Makrophagen, die in den meisten erwachsenen Geweben gefunden wurden: HSC-abgeleitete infiltrierende Makrophagen und HSC-unabhängige Resident-Makrophagen.
Gewebe-residente Makrophagen wurden auf Myb-unabhängige Vorläuferzellen zurückgeführt, die den Cytokinrezeptor Csf1r 12 exprimieren und im Embryo bei E8.5-E10.5 unter Verwendung von drei komplementären Fate-Mapping-Strategien vorhanden sind 6 . Um die Dottersack-Hämatopoese ohne Etikettierung von fetalen HSCs zu untersuchen, verwenden wir einen transgenen Stamm, Csf1r MeriCreMer , der ein Tamoxifen-induzierbares Fusionsprotein von 'verbesserter' Cre-Rekombinase und zwei Maus-Östrogen-Rezeptoren (Mer-iCre-Mer) unter der Kontrolle von Der Csf1r-Promotor. Daher wird die Cre-Rekombinase in Csf1r- exprimierenden Zellen während eines begrenzten Zeitfensters aktiv sein. Bei Verwendung eines Reporterstamms, der ein fluoreszierendes Protein stromabwärts einer lox-STOP-lox-Kassette (Rosa26 LSL-eYFP ) enthält, führt es zu einem bleibendenEnt genetische Markierung der zur Zeit der Induktion vorhandenen Zellen, aber auch ihrer Nachkommenschaft. Die Verabreichung von E8.5 der aktiven Form von Tamoxifen, 4-Hydroxytamoxifen (OH-TAM), Etiketten EMPs und Makrophagen, ohne Etikettierung von Dottersack-Unipotenten "primitiven" Vorläufern oder fetalen HSCs. Dabei haben wir den Immunphänotyp von EMPs und ihre Nachkommen bei der embryonalen Entwicklung charakterisiert und den Beitrag von Dottersack-abgeleiteten Makrophagen zu den erwachsenen Makrophagen-Pools beurteilt. Weitere Arbeiten sind erforderlich, um zu charakterisieren, ob primitive Progenitor-abgeleitete Makrophagen auch mit diesem Ansatz markiert werden und ob sie zu erwachsenen Makrophagenpools beitragen können.
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Protokoll
Tierische Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem anerkannten institutionellen Tierpflege- und Verwendungsausschuss des Instituts Pasteur (CETEA) durchgeführt.
1. In der Utero Pulse Markierung in Csf1r MeriCreMer Rosa LSL-YFP Embryos
- Bereiten Sie die Stammlösung von 4-Hydroxytamoxifen (OH-TAM, 50 mg / ml) vor.
- Unter der Fumehood die 25 mg-Durchstechflasche OH-TAM öffnen und 250 μl Ethanol (100%) zugeben.
- Übertragen Sie die OH-TAM-Lösung auf ein 2-mL-Mikrozentrifugenröhrchen mit einer abgeschnittenen Spitze und drehen Sie mit maximaler Geschwindigkeit für 10 min.
- Sonate 30 min in einem Sonicator Bad.
- Füge 250 μl PEG-35-Rizinusöl unter die Fumehood hinzu, um eine 50 mg / ml Stammlösung zu erhalten.
HINWEIS: PEG-35 Rizinusöl ist ein Lösungsmittel mit amphiphilen Eigenschaften, das hydrophobe Moleküle bindet und in wässrigen Lösungsmitteln löst. - Vortex für ca. 5 minMit maximaler Geschwindigkeit und Sonate 30 min in einem Sonicator Bad.
- Aliquot 90 μL (4,5 mg) pro Mikrozentrifugenröhrchen (1 Aliquot pro Injektion).
- Bei 4 ° C für 1 Woche oder bei -20 ° C für Langzeit wie oben beschrieben 13 lagern.
- Vorbereitung der Stammlösung von Progesteron (10 mg / ml)
- Füge 250 μl 100% Ethanol zu 25 mg Progesteron hinzu, um eine 10 mg / 100 μl Suspension unter der Fumehood herzustellen. Vortex vorsichtig
- Füge 2250 μl autoklaviertes Sonnenblumenöl hinzu, um 10 mg / ml Progesteronlösung unter der Haube zu produzieren.
- Vortex für ca. 5 min bei Höchstgeschwindigkeit, Aliquot und bei 4 ° C aufbewahren. Beachten Sie, dass die Lösung bei der Lagerung klar ist.
- Tamoxifen-Verabreichung
HINWEIS: Die embryonale Entwicklung wurde unter Berücksichtigung des Tages der vaginalen Plug-Bildung als embryonalen Tag (E) 0,5 geschätzt. Die Rekombination wird durch Einzelinjektion bei E8.5 induziertIn schwangere Csf1r MeriCreMer Frauen 12 . Nachtrag OH-TAM mit 37,5 μg pro g Progesteron zur Verringerung der Abtreibungsraten nach der Tamoxifen-Verabreichung. Injizieren um 13.00 Uhr (für Vaginalstecker am Morgen).- Am Morgen der Injektion, Sonic ein Aliquot der OH-TAM-Lösung für 10 min (oder bis vollständig resuspended).
- Füge 360 μl NaCl 0,9% unter dem Fumehood hinzu, um eine 10 mg / mL OH-TAM-Lösung zu erhalten und gründlich zu verwirren. Sonate, bis die Lösung klar und vollständig resuspendiert ist (mindestens 30 min).
- Vorwärmender Progesteron auf Raumtemperatur.
- Mischen Sie 450 μl OH-TAM und 225 μl Progesteron in einem Mikrozentrifugenröhrchen. Wirbel.
- Sonate mindestens 10 min und beladen auf eine 1 mL Spritze mit einer 25G Nadel.
- In der Tierhaltung wiegen die schwangere Frau ( Csf1r MeriCreMer Frauen sind in einem Inzucht-FVB genetischen Hintergrund und typische wiegen betweEn 25 und 33 g).
- Führen Sie eine intra-peritoneale Injektion durch langsames Einspritzen des berechneten Volumens in die Maus durch. Nach dem Abziehen der Nadel, sanft auf die Punktion Wunde drücken und massieren den Bauch, um die OH-TAM zu verteilen.
HINWEIS: Die OH-TAM-Injektionsdosis beträgt 75 mg / kg und die Progesteron-Dosis beträgt 37,5 mg / kg. Tabelle 1 liefert das Volumen, um in schwangere Frauen einzuspritzen.
| Mausgewicht (g) | Gesamtvolumen aus der Mischung (μL) |
| 25 | 281 |
| 26 | 292 |
| 27 | 303 |
| 28 | 315 |
| 29 | 326 |
| 30 | 338 |
| 31 | 348 |
| 32 | 360 |
| 33 | 371 |
| 34 | 382 |
| 35 | 394 |
Tabelle 1: Injektionsvolumen von 4-OH-Tamoxifen (OH-TAM). Volumen für eine Einzelinjektion bei E8,5 von 75 μg pro g (Körpergewicht) von OH-TAM, ergänzt mit 37,5 μg pro g Progesteron.
2. Dissektion der Dottersack (YS) und der fetalen Leber (FL)
ANMERKUNG: Rigoröse sterile Techniken sind nicht notwendig, wenn man Embryonen manipuliert, es sei denn, sie werden für die langfristige Kultur verwendet werden. Trotzdem muss der Arbeitsbereich sauber und in der Folie unter saugfähigem Papier abgedeckt werden.
- Bereiten Sie eiskaltes Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und die Verdauungsmischung vor (PBS, enthaltend 1 mg / ml Kollagenase D, 100 U / ml Deoxyribonuklease I (DNase I) und 3% fötales Rinderserum).
- Opfer schwangere Frauen von cerVikale Versetzung am geforderten Schwangerschaftstag ( zB embryonale Stufe E10.5).
- Klemmen Sie die Haut gerade über die Genitalien und machen Sie einen kleinen Einschnitt an der Mittellinie mit einer Schere. Ziehen Sie die Haut in Richtung Kopf, um die Körperwand ohne Pelz vollständig auszusetzen. Schneide die Bauchmuskeln, um die inneren Organe freizulegen und den Darm zu drücken, um die beiden Uterushörner freizulegen.
- Mit mittelgroßen, stumpfen Pinzetten, packt das Fett-Pad an den Eierstock und sanft ziehen Sie den Uterus. Schneiden Sie auf der zervikalen Ebene der Uterushörner und heben Sie die Hörner aus der Peritonealhöhle. Entfernen Sie das Fett-Pad, um die Uterushörner vollständig zu befreien und die Hörner aus dem Eierstock auf jeder Seite zu schneiden.
- Setzen Sie die Hörner in eiskaltes PBS in eine 10 mm Petrischale. Die Uterusmuskelschichten an einer Extremität (zervikales Ende) schnell greifen und feine Scheren zwischen der Muskelschicht und dem dezidualen Gewebe schieben, um die Embryonen mit dem umgebenden dezidualen Gewebe freizusetzen.
HINWEIS: Muskel neigt dazu, sich schnell zu beendenDie Extraktion, so muss dieser Schritt so schnell wie möglich sein. - Verwenden Sie ein Paar feine Zangen, um die Reichert-Membran und die Plazenta abzuschneiden.
- Entfernen Sie vorsichtig den Dottersack und legen Sie ihn in eine 24-Well-Gewebekulturplatte mit 0,5 ml Verdauungsmischung.
HINWEIS: In diesem Schritt kann embryonales Blut gesammelt werden.- Unmittelbar nach dem Abtrennen der Nabel- und Vitellingefäße den Embryo in eine 12-Well-Gewebekulturplatte mit 10 mM eiskalter Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) überführen. Entkapseln Sie den Embryo mit scharfen feinen Scheren, versuchen, so viel wie möglich zu beschränken Gewebe Dilatisierung. Inkubieren auf Eis für 10-15 min und sammle das EDTA mit dem Blut.
- Entfernen Sie das Amnion um den Embryo herum.
- Für Stufen
- Schneide den Kopf des Embryos unsPinzette oder feine Schere. Den Kopf auf eine 24-Well-Platte mit 0,5 mL Verdauungsmischung überführen.
ANMERKUNG: Der Neuroektoderm und das Gehirn in späteren Stadien werden weiter für die Durchflusszytometrieanalyse seziert; Den umliegenden Gefäßplexus vorsichtig entfernen. - Schneide den Embryo über dem Hinterbein und entferne die Forelimbs.
- Um die Leber zu isolieren, öffne den Thorax mit einem Paar feiner Pinzette. Klemmen Sie anteriorly zum Herzen und ziehen Sie leicht, während Sie die zweite Pinzette benutzen, um die Organe vom Körper zu befreien.
- Die fetale Leber sorgfältig von Herz und Darm trennen. Übertragen Sie die fetale Leber auf eine 24-Well-Platte mit 0,5 ml Verdauungsmischung. Die Übertragung unter dem Sektionsmikroskop sorgfältig überwachen.
- Sammeln Sie den Schwanzbereich (oder einen anderen Embryonteil) für die Genotypisierung durch den Polymerasekettenreaktionstest (PCR).
ANMERKUNG: Andere Gewebe und Organe können von E10.5 Embryonen für eine ähnliche Analyse mit Durchflusszytometrie geerntet werden. Blut, Kopf SkiN, Aorta-Gonaden-Mesonephros-Region (AGM), Herz und Neuroectoderm können bei E10.5 gesammelt werden. In späteren Stadien können auch Lunge, Niere, Milz und Bauchspeicheldrüse gesammelt werden. Eine detaillierte Beschreibung der Sektion der AGM in verschiedenen Entwicklungsstadien wurde zuvor beschrieben 14 .
3. Verarbeitung von embryonalen Geweben für die Durchflusszytometrie
- Inkubieren Sie die Organe (in den Verdauungsmischung) für 30 min bei 37 ° C.
- Übertragen Sie das Gewebe und die enzymatische Lösung auf ein 100 μm Sieb, das in eine 6-Well-Gewebekulturplatte gefüllt ist, die mit 6 ml FACS-Puffer (0,5% Rinderserumalbumin (BSA) und 2 mM EDTA in 1x PBS gefüllt ist). Mechanisch dissoziieren durch sanftes Zerkleinern mit dem schwarzen Gummikolben einer 2-ml-Spritze, um eine Einzeller-Suspension zu erhalten.
HINWEIS: Von nun an sollten alle Schritte bei 4 ° C durchgeführt werden. - Die Zellsuspension mit einer Pasteurpipette sammeln und in ein 15-ml-Röhrchen überführen.
- SpiN für 7 min bei 320 xg bei 4 ° C. Verwerfe den Überstand durch Aspiration.
- Resuspendieren des Pellets in 60 & mgr; l Fc-blockierenden Puffer (CD16 / CD32-blockierenden Antikörper, verdünnt 1/50 in FACS-Puffer).
- Übertragen Sie 50 & mgr; l der Einzelzell-Suspension pro Vertiefung in einer runden Boden 96 Multi-Well-Platte. Inkubieren für mindestens 15 min auf Eis.
HINWEIS: Die Färbung kann auch bei 5 ml Polystyrol-FACS-Röhrchen durchgeführt werden, wenn eine kleine Anzahl von Proben behandelt wird. - Übertragen Sie die restlichen 10 & mgr; l in ein 5 ml Polystyrol-FACS-Röhrchen, um einen Pool der Proben von jedem Gewebe zu erhalten. Dieser Pool dient als Kontrollen ( dh ungefärbte Proben und fluoreszierende minus eins (FMO) Kontrollen für jedes Fluorochrom). Übertragen Sie 50 μl des Pools für jede fluoreszierende minus eins (FMO) Kontrolle (eine pro Fluorochrom) auf die 96 Multi-Well Platte.
HINWEIS: Jede FMO-Kontrolle enthält alle Fluorochrom-gekoppelten Antikörper aus dem Antikörper-Panel, mit Ausnahme derjenigenDas wird gemessen. FMOs werden verwendet, um Gate-Grenzen zu identifizieren und für die spektrale Überlappung in mehrfarbigen Platten zu steuern. Um die Variationen im Hintergrund und die Autofluoreszenz zwischen verschiedenen Geweben korrekt anzugehen, ist es wichtig, diese Kontrollen aus dem Pool von Proben jedes Gewebes herzustellen. Die entsprechende Kontrolle für die YFP-Expression sind die Proben von Cre-negativen Embryonen, die durch PCR-Genotypisierung bestätigt werden.
- Übertragen Sie 50 & mgr; l der Einzelzell-Suspension pro Vertiefung in einer runden Boden 96 Multi-Well-Platte. Inkubieren für mindestens 15 min auf Eis.
4. Oberflächen-Antigen-Färbung
- Bereiten Sie den Antikörper-Mix in FACS-Puffer vor (Tabelle 2). 50 μl Antikörpermischung pro Probe zubereiten.
- Verwenden Sie die folgenden Fluorochrom-gekoppelten Antikörper: anti-CD45.2 (Klon 104); Anti-CD11b (Klon M1 / 70); Anti-F4 / 80 (Klon BM8); Anti-AA4.1 (Klon AA4.1); Anti-Kit (Klon 2B8); Und anti-Ter119 (Klon Ter119).
- Vorbereitung von sechs Antikörpermischungen für die FMO-Kontrollen im FACS-Puffer. 50 μl Antikörpermischung pro Kontrollprobe zubereiten.
NEINTE: Die Antikörperverdünnung in der Antikörpermischung ist zweimal mehr konzentriert als die in der Materialtabelle angegebene Endkonzentration. Für ein Panel mit sechs Fluorochrom-gekoppelten Antikörpern werden 6 FMO-Kontrollen vorbereitet. Tabelle 2 liefert die Zusammensetzung der Antikörpermischung und FMO-Kontrollen für ein Röhrchen.
| Volumen (& mgr; l) des Antikörpers (Endvolumen 50 & mgr; l) | ||||||||
| Antikörper | Klon | Antikörper-Mix | FMO CD45.2 | FMO CD11b | FMO F4 / 80 | FMO AA4.1 | FMO-Kit | FMO Ter119 |
| Anti-CD45.2 | 104. | 1 | 0 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| Anti-CD11b | M1 / 70 | 0,5 | 0,5 | 0 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| Anti-F4 / 80 | BM8 | 1 | 1 | 1 | 0 | 1 | 1 | 1 |
| Anti-AA4.1 | AA4.1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0 | 1 | 1 |
| Anti-Kit | 2B8 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0 | 0,5 |
| Anti-Ter119 | Ter119 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0 |
| FACS-Puffer | 45.5 | 46.5 | 46 | 46.5 | 46.5 | 46 | 46 | |
Tabelle 2: Volumen der Antikörper, die für die Färbung und Fluoreszenz von minus eins (FMO) Kontrollen verwenden. Volumen (& mgr; l) des Antikörpers, der für ein Endvolumen von 50 & mgr; l erforderlich ist.
- Füge 50 μl der Antikörpermischung zu den Proben in der 96-Multiwell-Platte hinzu (Endvolumen während der Färbung beträgt 100 μl). Vorsichtig zweimal abtupfen und 30 Minuten auf Eis aufkochen lassen.
- Die 96-Multiwell-Platte für 7 min bei 320 xg bei 4 ° C drehen und den Überstand verwerfen. Resuspend in 200 μl FACS-Puffer.
- Wiederholen Sie den Waschvorgang (Schritt 4.3) zweimal mit 150 μL FACS-Puffer.
- Filtriere die Proben und die Kontrollen (FMOs und ungefärbte Poolproben) in 5 ml Polystyrolröhrchen durch ein 70 μm Sieb. Auf Eis aufbewahren bis zum Erwerb.
5. Identifizierung von EMPs und YS-abgeleiteten Makrophagen durch Durchflusszytometrie
HINWEIS: Dieses Protokoll wurde mit einem 4 Laser-Durchflusszytometer eqMit einem 405 nm Violett-Laser, einem 488 nm Blue Laser, einem 562 nm gelben Laser und einem 638 nm Red Laser.
- Bereiten Sie Kompensationsperlen für jeden gekoppelten Antikörper nach den Anweisungen des Herstellers vor. Verwenden Sie ungefärbte Proben und Kompensationsperlen, um Laserintensitäten zu optimieren.
- Um Torgrenzen zu identifizieren, verwenden Sie FMO (Fluoreszenz minus eins) Kontrollen für jeden Antikörper.
- Um tote Zellen auszuschließen, füge 1 μl DAPI (1 mg / ml) dem Röhrchen (enthaltend 200 μl gefärbte Zellsuspension) 1 min vor der Akquisition zu. Verwenden Sie das starke DAPI-Signal und den vorwärts gestreuten Parameter (FSC), um den Ausschluss von toten Zellen und Trümmern auszuführen.
HINWEIS: Verwenden Sie Software aus dem Durchflusszytometer, um Tore während der Akquisition zu ziehen. Kompensationsmatrix und Analyse können nach der Probenerfassung mit anderen handelsüblichen Software durchgeführt werden. - Verwenden Sie Vorwärts- und Seitenstreuung (FSC vs SSC), um Live-Zelle und Doublet-Diskriminierung aus Gesamtereignissen durchzuführen.
- Erstellen Sie Fluoreszenz-Punkt-Diagramme in der Log-Skala-Achse und zeichnen Sie Tochter-Gates, um zuerst Erythrozyten (Ter119 + ) auszuschließen und dann Vorläuferzellen (Kit + ) und hämatopoetische Zellen (CD45 + Kit neg ) zu identifizieren (siehe Abbildung 1 ).
- Erstellen Sie Fluoreszenzhistogramme, um die Markierungseffizienz von YFP unter den verschiedenen identifizierten Populationen im YS ( Abbildung 2 ), der fetalen Leber ( Abbildung 3 ) und des Gehirns zu quantifizieren ( Abbildung 4 ).
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Ergebnisse
Die genetische Schicksal-Kartierung wurde durch Verabreichung bei E8.5 von OH-TAM in Csf1r-Mer-iCre-Mer-Weibchen, die mit Männern zusammenhingen, die einen Rosa26-LSL-eYFP-Reporter tragen, erreicht. In Gegenwart von OH-TAM führt die Exzision der Stop-Kassette zur permanenten Expression von YFP in den Zellen, die Csf1r exprimieren . Wir sammelten zwei hämatopoetische Gewebe: den Dottersack und die fetale Leber und ein nicht-hämatopoetisches Gewebe, das Neuroectoderm, von den Embr...
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Diskussion
Die verschiedenen Wellen der hämatopoetischen Vorläuferzellen überlappen sich teilweise innerhalb eines kurzen Zeitrahmens, was die Analyse des Beitrags jeder Welle der Entwicklungshämatopoese zu den Immunzellen technisch sehr anspruchsvoll macht.
Tamoxifen-induzierbare Cre-Systeme bieten die Möglichkeit, spezifische Zellen zeitlich induzierbar zu markieren und eine Abstammungsanalyse bei Embryonen oder Erwachsenen durchzuführen, ohne die Ex-vivo- oder In-vitro- Kultur oder...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Die Autoren danken Prof. Frederic Geissmann und Prof. Christian Schulz für aufschlussreiche Diskussionen; Dr. Hannah Garner für kritische Lektüre des Manuskripts, Dr. Xavier Montagutelli und Dr. Jean Jaubert und die Mitarbeiter des Institut Pasteur Tieres zur Unterstützung bei der Maushaltung; Und Pascal Dardenne und Vytaute Boreikaite, ein Amgen Scholar, für ihre technische Unterstützung. Die Forschung im EGP-Labor wird vom Institut Pasteur, dem CNRS, dem Cercle FSER (FRM und einem Startpaket vom Institut Pasteur und dem REVIVE-Konsortium) gefördert. LI wird von einem Promotionsstipendium des REVIVE-Konsortiums unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| #5 Gerade Pinzette | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| MC19/B Pascheff-Wolff Federschere | Fine Science Tools | 15371-92 | |
| 8,5 cm gerade Schere | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Anti-Mouse Kit-PE (Klon 2B8) | BD Pharmingen | 553355 | 1/200 Verdünnung in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD45.2 APC-Cy7 (Klon 104) | Sony | 1149120 | 1/100 Verdünnung in FACs Buffer |
| Anti-Mouse AA4.1-APC (CD93, Klon AA4.1) | eBioscience | 17-5892 | 1/100 Verdünnung in FACs Buffer |
| Anti-Mouse Ter119 PerCP-Cy5.5 (Klon Ter119) | Biolegend | 560512 | 1/200 Verdünnung in FACs Buffer |
| Anti-Mouse F4/80-BV421 (Klon BM8) | BD Pharmingen | 123137 | 1/100 Verdünnung in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 (Klon M1/70) | BD Pharmingen | 552850 | 1/200 Verdünnung in FACs Buffer |
| Anti-Maus CD16/CD32 (Maus BD Fc Block, Klon 2.4G2) | BD Biosciences | 553142 | |
| PBS 1x | Fischer Scientific | 12559069 | |
| Fötales Rinderserum | Fischer Scientific | 11570506 | |
| Kollagenase D | Roche | 11088882001 | |
| Desoxyribonuklease I | Sigma | D4527-20KU | |
| 6-Well-Gewebekulturplatte | Dutscher Dominique | 353046 | |
| 12-Well-Gewebekulturplatte | Dutscher Dominique | 353224 | |
| 24-Well-Gewebekulturplatte | Fischer Scientific | 11874235 | |
| 96 Wells U-förmige Bodengewebekultur Teller | Dutscher | Dominique 353227 | |
| Spritze Plastipak 2 mL | Dutscher Dominique | 300185 | |
| Nylon Gitter 100 & Mikro; m cell Siebe | Dutscher Dominique | 352360 | |
| Nylon Gitter 70 & micro; m Zellsiebe | Dutscher Dominique | 352350 | |
| 15 ml Falcon Röhrchen | Dutscher Dominique | 352096 | |
| Stericup GP Millipore Filtrationsset, 0,2 μ m | Dutscher Dominique | 51246 | |
| Rinderserum Albumin | Sigma | A7906-500G | |
| (Z)-4-HYDROXYTAMOXIFEN 25mg | Sigma | H7904-25MG | Besondere Vorsicht ist geboten bei der Zubereitung und Verarbeitung von Tamoxifen und seinen Derivaten. Verwenden Sie immer geeignete persönliche Schutzausrüstung |
| Progesteron | Sigma | P3972 | Verwenden Sie immer geeignete persönliche Schutzausrüstung |
| PEG-35 Rizinusöl (Kolliphor/Cremophor EL) | Sigma | C5135 | |
| Sonnenblumenöl | Sigma | S5007-250ML | |
| Ethanol | Sigma | 24103-1L-R-D | Verwenden Sie immer geeignete persönliche Schutzausrüstung und verwenden Sie sie unter dem Abzug |
| EDTA | Sigma | E9884-500G | |
| DAPI, 1 ML (1 MG/ML IN WASSER) | Fischer Scientific | 10116287 | |
| CytoFLEX S B2-R3-V4-Y4 Durchflusszytometer | Beckman Coulter | B75408 | |
| CytoFLEX Daily QC Fluorosphären | Beckman Coulter | B53230 | |
| VersaComp Antikörper-Capture-Bead-Kit (2x5 mL) | Beckman Coulter | B22804 | |
| FVB-Tg(Csf1r-cre/Esr1*)1Jwp/J | Das Jackson-Labor | 19098 | |
| B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J | Das Jackson-Labor | 6148 |
Referenzen
- Bertrand, J. Y., et al. Three pathways to mature macrophages in the early mouse yolk sac. Blood. 106 (9), 3004-3011 (2005).
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