Zusammenführen von Ionenkonzentration Polarisierung zwischen Juxtaposed Ionenaustauschermembranen zu blockieren die Ausbreitung der Polarisations Zone

Zusammenfassung

Das Protokoll für eine neuartige Ionenkonzentrationspolarisation (ICP) Plattform, die die Ausbreitung der ICP Zone stoppen kann, unabhängig von den Betriebsbedingungen beschrieben. Diese einzigartige Fähigkeit der Plattform liegt in der Verwendung von Ionenerschöpfungs und Anreicherung verschmelzenden, die zwei Polaritäten des ICP Phänomen sind.

Zusammenfassung

Die Ionenkonzentrationspolarisation (ICP) Phänomen ist einer der vorherrschenden Methoden Niedrigfluss biologischen Proben vorzukonzentrieren. Die ICP induziert eine noninvasive Region für geladene Biomoleküle können (dh die Ionenverarmungszone) und Targets auf dieser Bereichsgrenze vorkonzentriert werden. Trotz der hohen preconcentration Auftritte mit ICP, ist es schwierig, die Betriebsbedingungen der Nichtausbreitungsionenverarmungszonen zu finden. Um diesen engen Arbeitsfenster zu überwinden, haben wir vor kurzem eine neue Plattform für räumlich-zeitlich fixiert preconcentration. Im Gegensatz zu Verfahren , die nur vorhergehenden Ionenabreicherungskammern verwenden, diese Plattform verwendet auch die entgegengesetzte Polarität der ICP (dh Ionenanreicherungs) , um die Ausbreitung der Ionenverarmungszone zu stoppen. Durch die Konfrontation mit der Anreicherungszone mit der Verarmungszone, verschmelzen die beiden Zonen miteinander und zu stoppen. In diesem Papier beschreiben wir ein ausführliches Versuchsprotokoll dieses räumlich-zeitlich definiert ICP Plattf zu bauenorm und die Vorkonzentration Dynamik der neuen Plattform charakterisieren indem man sie mit denen der herkömmlichen Vorrichtung verglichen wird. Qualitative Ionenkonzentrationsprofile und aktuelle Zeit Antworten erfolgreich erfassen die unterschiedliche Dynamik zwischen der fusionierten ICP und der Stand-alone-ICP. Spannung (0,5 bis 100 V), der Ionenstärke: Im Gegensatz zu den herkömmlichen, die die preconcentration Lage nur ~ 5 V beheben können, kann die neue Plattform eine ziel kondensiert Stecker an einer bestimmten Stelle in den weiten Bereichen der Betriebsbedingungen erzeugen (1-100 mM) und pH (3,7 bis 10,3).

Einleitung

Ionenkonzentrationspolarisation (ICP) bezieht sich auf ein Phänomen , das während der Ionenanreicherungs und Ionenverarmungs auf einer permselektiven Membran auftritt, was zu einem zusätzlichen Spannungsabfall mit Ionen Konzentrationsgradienten ^{1, 2.} Dieser Konzentrationsgradient ist linear, und es wird steiler als eine höhere Spannung (Ohmsche Regime), bis die Ionenkonzentration auf der Membran aufgebracht wird, gegen Null geht (Begrenzungsregelung). An dieser diffusionsbegrenzten Zustand, der Gradient (und entsprechende Ionenfluß) ist bekannt, ¹ maximiert / gesättigt. Jenseits dieser herkömmlichen Verständnis, wenn die Spannung (oder Strom) weiter erhöht wird, wird ein overlimiting Strom beobachtet, mit flachen Verarmungszonen und sehr scharfe Konzentrationsgradienten an der Zonengrenze ^{1, 3.} Die flache Zone hat eine sehr niedrige Ionenkonzentration, aber mit Oberflächenleitfähigkeit, elektro-osmoti c Strömung (EOF), und / oder elektroosmotischen Instabilität Ionenfluss fördern und ein overlimiting Strom ^{3, 4, 5} induzieren. Interessanterweise dient die flache Verarmungszone als eine elektrostatische Barriere, die ^{6 herausfiltert, 7, 8, 9} und / oder Vorkonzentraten ^{10 Ziele, 11.} Da es eine unzureichende Menge an Ionen ist, die Oberflächenladungen von geladenen Teilchen (für die Befriedigung der Elektro) zu screenen, können die Partikel nicht durch diese Verarmungszone passieren und deshalb an seiner Grenze ausrichten. Diese nichtlineare ICP - Effekt ist ein Phänomen generic in verschiedenen Arten von Membranen ^{10, 11, 12, 13,}> 14 und Geometrien ^{6, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21;} Dies ist , warum Forscher verschiedene Arten von Filtrations ^{6, 7, 8,} zu entwickeln , konnten ⁹ und preconcentration ^{10, 11} Geräte , die nicht - lineare ICP.

Selbst mit so hoher Flexibilität und Robustheit, ist es immer noch eine praktische Herausforderung, die Betriebsbedingungen für die nichtlinearen Vorrichtungen ICP zu klären. Die nichtlinearen Bereich des ICP entfernt schnell Kationen durch einen Kationenaustauschmembran, die die Verschiebung von Anionen in Richtung der Anode bewirkt, bewegt. Als einDadurch breitet sich die flache Verarmungszone schnell, was Schockausbreitung ²² erinnert. Mani et al. genannt ²³ schocken diese Dynamik der Entionisierung (oder Erschöpfung). Auf Ziele in einer bestimmten Abtastposition vorzukonzentrieren, die Ausdehnung des Ionenverarmungszone verhindern , ist erforderlich, beispielsweise um ²⁴ EOF oder druckbetriebenen Anströmung des Expansionszone aufgebracht wird . Zangle et al. ²² verdeutlicht die Kriterien für ICP Ausbreitung in einem eindimensionalen Modell, und es hängt in hohem Maße von der elektrophoretischen Mobilität ^17, der Ionenstärke ^18, pH ^25, und so weiter. Dies zeigt an, dass die richtige Betriebsbedingungen werden entsprechend den Probenbedingungen verändert werden.

Hier präsentieren wir detaillierte Design und experimentelle Protokolle für eine neue ICP-Plattform, die Ziele innerhalb eines spatiotemp Vorkonzentratenoral definierte Position ^26. Die Expansion der Ionenverarmungszone wird durch die Ionenanreicherungszone blockiert, ein stationäres preconcentration Stecker an eine zugewiesene Position zu verlassen, und zwar unabhängig von der Betriebszeit, der angelegten Spannung, der Ionenstärke und pH. Diese detaillierte Videoprotokoll soll die einfachste Methode, um zu zeigen, Kationenaustauschmembranen in mikrofluidischen Vorrichtungen zu integrieren und die Vorkonzentration Leistung der neuen ICP-Plattform im Vergleich zu dem herkömmlichen zu demonstrieren.

Protokoll

1. Herstellung von Kationenaustauschermembran-integrierten mikrofluidischen Chips

1. Herstellung von Silizium - Meister
   1. Design zwei Arten von Silizium-Mastern: eine für Strukturieren eines Kationenaustauscherharzes und die andere für den Aufbau eines Mikrokanals mit Polydimethylsiloxan (PDMS).
      HINWEIS: Die Detailgeometrie wird in den Schritten 1.3.1 und 1.4.1 beschrieben.
   2. Fabrizieren die Silizium - Master entweder durch herkömmliche Photolithographie oder Deep Reactive Ion Etching ²⁷ verwendet wird .
   3. Silanisieren die mikrostrukturierten Silizium Meister mit Trichlorsilan (~ 30 & mgr; l) in einem Vakuumgefäß 30 min.
      ACHTUNG: Trichlorsilan ist eine pyrophore Flüssigkeit , die leicht entflammbar und hat eine akute Toxizität (Inhalation, orale Einnahme).
2. Herstellung von PDMS Formen
   1. Mischen Sie eine Siliconelastomerbasis mit einem Härter in einem Verhältnis 10: 1 und die Tasse mit diesem nicht ausgehärteten PDMS(30-40 ml für Mikrostrukturen auf einem Wafer 4-in Silizium zu replizieren) in einem Vakuumgefäß für 30 Minuten um die Blasen zu entfernen.
      HINWEIS: Die Silikonbasis enthält Siloxanoligomerer endet mit Vinylgruppen und ein Katalysator auf Platinbasis. Das Härtungsmittel enthält Oligomere Vernetzungs das drei silicium Hydrid - Bindungen ²⁸ haben.
   2. Gießen Sie die nicht ausgehärteten PDMS auf den Silizium Meister, entfernen Sie die Blasen mit einem Gebläse, und heilen die PDMS bei 80 ° C für 2 h in einem Umluftofen.
   3. Lösen Sie die gehärtete PDMS aus den Silizium - Master und Form richtig die PDMS mit einem Messer (squared Formen, wie in Abbildung 2a-b gezeigt, iv).
3. Strukturieren der Kationenaustauschermembranen
   1. Schneiden Sie die Hälfte der PDMS-Form senkrecht zu den beiden parallelen Mikrokanälen und lochen an den Enden der PDMS-Kanäle mit einem 2,0-mm-Biopsie Punch.
      HINWEIS: Die PDMS-Form zur Strukturierung der kationenselektive Membran hat zwei parlel Mikrokanäle (Breite: 100 & mgr; m; Höhe: 50 & mgr; m; Inter Abstand: 100 & mgr; m; Abbildung 1a). Die ursprüngliche Form der Form kann durch Spiegelung des geschnittenen Form entlang der Schnittlinie vorstellen. L-förmige Mikrokanäle sind zum Stanzen der beiden Löcher empfohlen ohne Überlappung.
   2. Reinigen Sie einen Glasobjektträger und die PDMS-Form mit Klebeband und ein Gebläse und legen Sie die Form auf dem Glasträger reversible Bindung zwischen ihnen zu schaffen.
   3. Gemäß der Mikroströmungsstrukturierungstechnik ^29, Freisetzung ~ 10 & mgr; l eines Kationenaustauscherharzes am offenen Ende des Kanals, der im Schritt 1.3.1 (Abbildung 1b) geschnitten wurde. Setzen Sie den Spritzenkopf auf die gestanzten Löcher und ziehen Sie den Kolben (schwarze Pfeile in Abbildung 1b); ein leichter Unterdruck wird das Kationenaustauschharz und das Harz füllt die beiden Kanäle zu ziehen.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, dass die Höhe des Mikrokanals ist größer als 1581; m, weil die hohe Viskosität des Harzes erfordert einen hohen Druck, um die Kanäle zu füllen. Auf der anderen Seite, ist es besser, dass die Höhe nicht 100 überschreitet um, da die strukturierte ionenselektive Membran dicker als 1 & mgr; m werden wird; solch eine dicke Membran ¹³ einen Spalt zwischen der Membran und der PDMS - Kanal erzeugen können.
   4. Nehmen Sie die PDMS-Form, ohne das gemusterte Harz zu berühren, und legen Sie den Glasobjektträger auf die Heizung auf 95 ° C für 5 min das Lösungsmittel in dem Harz zu verdampfen.
      HINWEIS: Die Dicke der gemusterten Membran ist in der Regel weniger als <1 um. Die Form wird durch Anlenkung der Form auf der offenen Seite (gestrichelte Linie und Pfeil in Abbildung 1b) vorsichtig abgelöst. Es empfiehlt sich, die Form weniger als 1 min nach dem Einfüllen des Harzes zu lösen. Wenn die Form ein paar Minuten später abgelöst wird, dickere Membranen erhalten werden konnte, aber sie würden eine konkave Form aufgrund der Kapillarwirkung haben.
   5. Ziehen Sie die unnötigenTeil der gemusterten Membran mit einer Rasierklinge, so dass zwei getrennte Linienmuster (Abbildung 1c).
      ANMERKUNG: Das Kationenaustauschmaterial hier verwendete Gruppen perfluoriert, ist das Muster das heißt nicht stark an das Glas gebunden ist. Daher kann das einfache Verfahren leicht Beschaufelung die unnötige Teil der Membran zu entfernen.
4. Integration des Mikrokanals und der Membran-strukturierten Substrats
   1. Stanzen zwei Löcher an den Enden der Mikrokanäle und zwei weitere Löcher, wo die Membranmuster wird nach dem Bonden des PDMS-Kanal an die Membran-strukturierten Substrats in Schritt 1.3 hergestellt befinden.
      Hinweis: Der PDMS Mikrokanal weist einen Kanal (Breite: 50-100 & mgr; m; Höhe: 10 & mgr; m), aber es wird an den Enden des benachbarten Kanals (1d) verbunden ist .
   2. Bond, die PDMS-Mikrokanal an die Membran-strukturierte Substrat unmittelbar nach der Sauerstoffplasmabehandlung für 40 s bei 100 W und 50 mTorr.
      HINWEIS: Legen Sie die gemusterten Membran senkrecht auf der Mitte des Mikrokanals.

2. ICP-Anreicherung

1. Vorbereitung für das Experiment
   1. Bereiten verschiedener Testlösungen, einschließlich 1-100 mM KCl, 1 mM NaCl (pH ~ 7), wobei die Mischung von 1 mM NaCl und 0,2 mM HCl (pH ~ 3,7), der Mischung von 1 mM NaCl und 0,2 mM NaOH (pH ~ 10.3) und 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung.
   2. Fügen Sie einen negativ geladenen fluoreszierenden Farbstoff (~ 1,55 uM) zu den Testlösungen.
      HINWEIS: Die Konzentration des zugegebenen Farbstoffs sollte viel niedriger sein als die der Salzionen (<10 & mgr; M) , so dass die geladenen Farbstoffe tragen nicht zu einem elektrischen Strom ^{30, 31.}
   3. Laden der Probenlösung in einem Reservoir des Kanals und gelten Unterdruck zu dem anderen Behälter um den Kanal mit der Lösung zu füllen. Verbinden Sie die beiden Reservoirs durch hydrodynamisch releasing einen großen Tröpfchen des Druckgradienten entlang des Kanals (2a) zu beseitigen.
   4. Füllt die zwei Reservoiren, die an die Kationenaustauschmuster verbunden sind, mit Pufferlösungen (1 M KCl oder 1 M NaCl) unter Verwendung einer Spritze oder einer Pipette für die ICP-Effekt in den Reservoirs zu kompensieren.
   5. Legen Sie die Drähte an den Stauseen, über die beiden strukturierten Membranen (Anode auf der linken Reservoir und Kathode auf der rechten Seite ), und verbinden sie mit einer Quelle Messeinheit (Abbildung 2a).
2. Visualisierung des ICP Phänomen und ICP preconcentration
   1. Legen Sie das ICP-Gerät auf einem invertierten Epifluoreszenzmikroskope. Tragen Sie eine Spannung (0,5100 V) und messen die Stromantwort mit einer Quelle Messeinheit.
   2. Erfassen Fluoreszenzbilder mit einer Charge-Coupled Device Kamera und analysieren , um die Fluoreszenzintensität mit Bildbearbeitungssoftware ^32.

Ergebnisse

Die schematischen Herstellungsschritte eines membran integrierten mikrofluidischen Vorkonzentrator sind in Abbildung 1 dargestellt. Eine detaillierte Beschreibung der Herstellung ist in dem Protokoll gegeben. Das Muster und die Vorrichtungsbilder der räumlich - zeitlich definiert Vorkonzentrator ²⁶ sind mit denen eines konventionellen Vorkonzentrator ¹¹ (Abbildung 2) kontrastiert. Die ICP - Phänomen in der ...

Diskussion

Wir haben das Herstellungsprotokoll und die Leistung eines raum-zeitlich definiert Vorkonzentrator in einem Bereich der angelegten Spannung (0,5-100 V), Ionenstärke (1-100 mM) beschrieben und pH (3,7 bis 10,3), eine 10.000-fache zu erreichen preconcentration von Farbstoffen und Protein innerhalb von 10 min. Wie wie frühere ICP-Geräte wird die preconcentration Leistung besser bei höherer Spannung und bei niedrigeren Ionenstärke. Ein zusätzlicher Parameter, den wir hier zu betrachten ist, kann der Abstand zwischen zwei Ka...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Sylgard 184 Silikon Elastomer Bausatz	Dow Corning
Trichlorsilan	Sigma Aldrich	175552	Hochgiftiges
Nafion Perfluorharz, 20 Gew.-	% Sigma Aldrich	527122
Natriumchlorid	Sigma Aldrich	71394
Kaliumchlorid	Sigma Aldrich	60121
Alexa Fluor 488 Carbonsäure, Succinimidylester	Invitrogen	A20000
Isothiocyanat-konjugiertes Albumin	Sigma Aldrich	A9771
Phosphatpuffer Kochsalzlösung, 1x	Wengene	LB004-02
Tween 20	Sigma Aldrich	P1379
Epifluoreszenzmikroskop	Olympus	IX-71
Geladengekoppelt Kamera für Geräte	Hamamtsu Co.	ImageEM X2
Quellenmessgerät	Keithley Instruments	2635A
Covance-MP	Femto Science