Mit dem Hauptneurosphäre Kulturen Primäre Cilia zu studieren

Zusammenfassung

Das primäre cilium ist von fundamentaler Bedeutung in neuralen Vorläuferzellproliferation, die neuronale Differenzierung, und adulten neuronalen Funktion. Hier beschreiben wir ein Verfahren ciliogenesis und den Handel mit Signalproteinen zu Zilien in neuralen Stamm- / Progenitorzellen und differenzieren Neuronen unter Verwendung von primären Kulturen Neurosphäre zu studieren.

Zusammenfassung

Das primäre Zilium ist grundlegend wichtig für die Proliferation von neuralen Stamm-/Vorläuferzellen und für die neuronale Differenzierung während des embryonalen, postnatalen und adulten Lebens. Darüber hinaus besitzen die meisten differenzierten Neuronen primäre Zilien, die Signalrezeptoren wie G-Protein-gekoppelte Rezeptoren und Signalmoleküle wie Adenylylcyclasen beherbergen. Das primäre Zilium bestimmt die Aktivität mehrerer Entwicklungswege, einschließlich des sonic hedgehog Signalwegs während der embryonalen neuronalen Entwicklung, und unterstützt auch die kompartimentelle subzelluläre Signalübertragung während der adulten neuronalen Funktion. Es überrascht nicht, dass Defekte in der primären Zilienbiogenese und -funktion mit Entwicklungsanomalien des Gehirns, zentraler Adipositas sowie Lern- und Gedächtnisdefiziten in Verbindung gebracht wurden. Daher ist es unerlässlich, die primäre Zilienbiogenese und den ziliären Transport im Kontext von neuralen Stamm-/Vorläuferzellen und differenzierten Neuronen zu untersuchen. Kultivierungsmethoden für primäre Neuronen erfordern jedoch beträchtliches Fachwissen und sind nicht für Frost-Tau-Zyklen geeignet. In diesem Protokoll diskutieren wir Kultivierungsmethoden für gemischte Populationen von neuralen Stamm-/Vorläuferzellen unter Verwendung primärer Neurosphären. Die Neurosphären-basierten Kultivierungsmethoden bieten die kombinierten Vorteile der Untersuchung primärer neuraler Stamm-/Vorläuferzellen: Zugänglichkeit für mehrere Passagen und Gefrier-Tau-Zyklen, Differenzierungspotenzial in Neuronen/Glia und Transfektionsfähigkeit. Wichtig ist, dass wir festgestellt haben, dass neurale Stamm-/Vorläuferzellen und differenzierte Neuronen in Kultur zilieniert sind und Signalmoleküle, die für die Ziliarfunktion relevant sind, in diesen Kompartimenten lokalisieren. Unter Verwendung dieser Kulturen beschreiben wir außerdem Methoden zur Untersuchung der Ziliogenese und des Ziliartransports in neuralen Stamm-/Vorläuferzellen und differenzierten Neuronen. Diese Neurosphären-basierten Methoden ermöglichen es uns, zilienregulierte zelluläre Signalwege, einschließlich der G-Protein-gekoppelten Rezeptor- und Sonic-Hedgehog-Signalwege, im Kontext von neuralen Stamm-/Vorläuferzellen und differenzierten Neuronen zu untersuchen.

Einleitung

Das primäre cilium ist ein Mikrotubulus-basierte dynamischer subzellulären Kompartiment, das als sensorische Antenne in zellulären Signalweg koordinierenden, einschließlich der Sonic Hedgehog (Shh) -Weg während der embryonalen neuronalen Entwicklung ^{1, 2} und compartmentalized subzellulären Signalgebung in adulten neuronalen Funktion ^{3, 4} . Signalisierungs Komponenten dieser Wege, wie der Shh - Rezeptor ⁵ Patched; der Weg Aktivator Smoothened (Smo) ^6; und Gpr161 ⁷ ein Orphan - G - ....

Protokoll

1. Isolierung von Neurosphären aus der erwachsenen Maus-Gehirn

1. Euthanize einen erwachsenen Maus (etwa 2 Monate alt) durch eine Überdosis Isofluran. Doppelklicken Sie sicher, dass die Maus Atmung und seziert unmittelbar nach dem Tod gestoppt hat.
2. Mit einer Schere, machen Sie einen Mittellinienschnitt, den Schädel zu öffnen. Entfernen Sie das Gehirn.
3. Legen Sie das Gehirn in kaltem PBS in einer 10 cm Schale auf Eis. Folgen Sie der whole-mount Dissektion Methode ⁴⁸ die SVZ von der lateralen Ventrikel zu erhalten.
4. Platzieren Sie den lateralen Ventrikel in ein 1,5 ml-Röhrchen, 500 & mgr; l von 0,05% Trypsin-E....

Ergebnisse

Die Zellen aus dem SVZ in NSC - Medium für eine Woche nach dem Plattieren floating Neurosphären wurden (2A) beobachtet. Die Größen der Kugeln variiert zwischen 50 und 200 um. Um zu untersuchen, ob die Kugeln aus neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen abgeleitet wurden, wurden die Neurospheres ausplattiert PLL- und Laminin-beschichtete Deckgläser in NSC-Medium für 2 Tage. Sie wurden dann immunhistochemisch gegen die neuralen Stammzellen / Vorläuferzellmarker, Nestin. Zwei.......

Diskussion

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Erzeugung und Neurosphere Kulturen von adulten Maus SVZ zu halten. Einige relevanten Punkte, die Kulturen in Bezug auf sind wie folgt. Erstens sind die Größen der Kugeln typischerweise zwischen 50 bis 200 & mgr; m. Unserer Erfahrung nach, wenn ein Neurosphere größer als 300 & mgr; m im Durchmesser bekommt, hat die optimale Zeit für Passagierung verfehlt. Diese größeren Kugeln enthalten tote Zellen im Kern. Zweitens, wie Neurosphären üblicherweise verwendet werden, neurale S.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
12 mm rundes Deckglas	Fisherbrand	12-545-80
24-Well-Platte	Falcon	353047
4 % Paraformaldehyd (PFA)	Affymetrix	19943
50 mL Röhrchen	Falcon	352098
95 mm x 15 mm Petrischale, aufschiebbarer	Deckel Fisherbrand	FB0875714G	10 cm Schale
70 & Mikro; m-Zell-Sieb	Falcon	352350
Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Kaninchen IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch	711-545-152	Donkey Anti Rabbit, Alexa 488 Sekundärantikörper
Arl13B, Klon N295B/66	Neuromab	AB_11000053
B-27 Supplement (50X), serumfrei	ThermoFisher Scientific	17504001	B27
Zentrifuge	Thermo scientific	ST 40R
Kryo-Fläschchen	Corning	430488
DAPI	Sigma	D9542-10MG
Desoxyribonuklease I aus der Rinderpankrese	Sigma	D5025-15KU	Dnase I
Dimethylsulfoxid	Sigma	D8418-100ML	DMSO
Einweg-Vinyl-Probenformen	Sakura Tissue-Tek Cryomold	4565	10 mm x 10 mm x 5 mm
Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung 10X, modifiziert, ohne Calciumchlorid und Magnesiumchlorid, flüssig, sterilfiltriert, geeignet für Zellkultur	Sigma	D1408-500ML	DPBS
Dumont #5 Pinzette	Feinwissenschaftliche Werkzeuge	11254-20
Fötales Rinderserum (FBS)	Sigma	F9026-500ML
Fluormount-G Lösung	Southern Biotech	0100-01	Eindecklösung
GFAP	DAKO	Z0334
Ziege Anti Maus IgG1 Sekundärantikörper, Alexa Fluor 555 Konjugat	ThermoFisher Scientific	A-21127	Ziege Anti Maus IgG1, Alexa 555 Sekundärantikörper
Ziege Anti Maus IgG2a Sekundärantikörper, Alexa Fluor 555 Konjugat	ThermoFisher Scientific	A-21137	Ziege Anti Maus IgG2a, Alexa 555 Sekundärantikörper
Gpr161	hausgemacht	N/A
human bFGF	Sigma	F0291	FGF
Hämozytometer	Hausser Scientific	0.100 mm tief	verbessert neubauer
Isothesie	Henry Schein	NDC 11695-0500-2	Isofluoran
Laminin aus Engelbreth-Holm-Swarm Sarkom Basalmembran	Sigma	L2020	Laminin
L-Glutamin (200 mM)	Sigma	G7513
Lipofectamine 3000 Transfektionsreagenz	ThermoFisher Scientific	L3000
Mr. Frosty	Nalgene	5100-0036
N-2 Ergänzung (100X)	ThermoFisher Scientific	17502001	N2
Neurobasales Medium	Gibco	21103-049
Normales Eselsserum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
OCT Verbindung	Sakura Tissue-Tek	4583	OCT
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P4333-100ML
Poly-L-Lysin (PLL)	Sigma	P4707
Rekombinantes humanes EGF-Protein, CF	F- und Entwicklungssysteme	236-EG-200
EGF-Schere	Feinwissenschaftliche Werkzeuge	14060-10
Superfrost plus Objektträger	Fisher Scientific	12-550-15	Objektträger
Triton X-100	Bio-Rad	161-0407
Trypsin-EDTA-Lösung (10X)	Sigma	T4174-100	Trypsin
COSTAR 6-Well-Platte, mit Deckel mit flachem Boden, Polystyrol mit extrem geringer Haftfläche, steril	Corning	3471	6-Well-Platte
β-Tubulin III	Covance	MMS-435P	TUJ1