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Die Induktion einer entzündlichen Reaktion in der Primär Hepatozyten-Kulturen von Mäusen

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DOI:

10.3791/55319

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10. März 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Katz Family Drug Discovery Center and Division of Nephrology and Hypertension, Department of Medicine, University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 2Department of Cell Biology and Anatomy, University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier zeigen wir eine enzymatische Annäherung an primären Hepatozyten aus erwachsenen Mäusen zu isolieren, und wir beschreiben die Quantifizierung einer Entzündungsreaktion mittels ELISA und real-time PCR.

Zusammenfassung

Die Leber spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulation der systemischen Entzündung. Bei chronischen Nierenerkrankungen insbesondere reagiert die Leber in Reaktion auf die urämischen milieu, oxidativer Stress, Endotoxämie und die verminderte Clearance von proinflammatorischen Zytokinen Zirkulieren durch eine große Anzahl von Akute-Phase-Reaktanden zu erzeugen. Experimentelle Werkzeuge zum Studium der Entzündung und die darunter liegende Rolle der Hepatozyten sind entscheidend für die Regulation und der Beitrag der hepatischen Zytokine zu einer systemischen Akutphasenreaktion und eine verlängerte proinflammatorischen Szenario, insbesondere in einer komplizierten Einstellung wie chronischer Nierenkrankheit zu verstehen. Seit dem Studium bieten komplexen Mechanismen der Entzündung in vivo bleibt eine Herausforderung, ressourcenintensiv und erfordert in der Regel die Verwendung von transgenen Tieren, primäre Hepatozyten isoliert ein robustes Werkzeug mechanistische Einblicke in die Leberakutphase - Antwort zu erhalten. Da diese in vitro - Technik zu moderaten Kosten, hohen WiederHerstellbarkeit und gemeinsame technische Wissen, primäre Hepatozyten isoliert auch als Screening-Ansatz leicht verwendet werden kann. Hier beschreiben wir eine enzymatische basierte Methode primären murinen Hepatozyten zu isolieren, und wir beschreiben die Beurteilung einer Entzündungsreaktion in diesen Zellen mittels ELISA und quantitative real-time PCR.

Einleitung

Chronischer Nierenerkrankung (CKD) kann als ein Zustand von akuten und chronischen Entzündungs 1 definiert werden. Bei Patienten mit CKD, die Serumspiegel des phosphaturic Hormon Fibroblasten - Wachstumsfaktor 23 (FGF23) steigen progressiv um Serum Phosphathomöostase 2 zu halten. Erhöhte Serum FGF23 Ebenen unabhängig mit kardiovaskulären Morbidität und Mortalität bei Patienten in Zusammenhang gebracht , die eine Hämodialyse - Behandlung beginnen , 3, 4. Außerdem haben mehrere klinische Studien eine starke Korrelation zwischen erhöhten FGF23 Ebenen und die Serumspiegel von C-reaktivem Protein (CRP), Interleukin-6 (IL-6) und Tumor - Nekrose - Faktor α (TNF & agr;) , 5, 6 gezeigt. Darüber hinaus wird in einer experimentellen Studie haben wir gezeigt, vor kurzem, dass FGF23 direkt Hepatozyten ausrichten können und verursachen eine entzündliche Reaktion durch eine Erhöhung CRP und IL-6 production in der Leber 7. FGF23 könnte daher wirken als zirkulierende Faktor, systemische Entzündung in CKD beiträgt.

In den frühen 70er Jahren, waren primäre Hepatozyten isoliert und untersucht zum ersten Mal 8. Seitdem primären kultivierten wurden Leberzellen verwendet worden , um ausgiebig 9 metabolische Verarbeitung, Hormonfunktion, Arzneimittel - Metabolismus und Toxizität sowie Immunität und entzündliche Reaktionen zu untersuchen, 10. Vorherige Protokolle wurden in erster Linie die enzymatische Isolierung von primären Hepatozyten aus menschlichem Lebergewebe 11, 12 beschrieben. Während ein hervorragendes Modell, lässt dies die Fähigkeit heraus zu untersuchen, wie die genetische Manipulation komplexer Lebersignalmechanismen sowie funktionelle Konsequenzen auf verschiedene Arten von Stimuli beeinflusst. Im Folgenden beschreiben wir die Isolierung von murinen primären Hepatozyten. Bemerkenswert ist , kann die Wirkung mehrerer Mediatoren der Leber Akute-Phase - Reaktion, wie beispielsweise Lipopolysaccharid (LPS), IL-6 und FGF23 in eine einfache, schnelle und reproduzierbare Weise 13 analysiert werden.

Hier stellen wir ein Protokoll für die enzymatische Trennung von Hepatozyten von erwachsenen Mäusen, und wir zeigen, dass etablierte Induktoren von Entzündungen, wie beispielsweise LPS und IL-6, sowie neuartige Entzündungsmediatoren wie FGF23, direkt Expression stimulieren kann und Sekretion von inflammatorische Zytokine, wie CRP und IL-6 in kultivierten Hepatozyten.

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Protokoll

Alle Tier Protokolle und experimentellen Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) der University of Miami Miller School of Medicine zugelassen.

1. Vorbereitung

  1. Vorheiz Leberperfusion Medien und Leber bei 37 ° C Medien in einem Wasserbad verdauen.
  2. Stellen Sie eine Perfusions-Pumpe bis (30 ml / min). Sorgfältig prefill das Schlauchsystem der Pumpe mit Leberperfusion Medien. Vermeiden Sie Luftblasen im System und bereiten die stereotaktische Mikroskop.
  3. Coat Zellkulturschalen unter Verwendung von Kollagen Typ I entsprechend dem Protokoll des Herstellers.

2. Leber Rettung

  1. Anästhesieren die Spendermaus Sauerstoff / Isofluran Inhalation (Isofluran 4% / 2 L / min Sauerstoff) verwendet wird .
    1. Aufrechterhaltung der Anästhesie von Isofluran zu 2-2,5% senken oder durch Injizieren Ketamin (100 mg / kg Körpergewicht intraperitoneal) und Xylazin (10 mg / kg Körpergewicht intraperitoneally). Kontinuierliche Isofluran-Narkose ist bevorzugt, da Ketamin senkt den Blutdruck und Hepatotoxizität verursachen können.
  2. Legen Sie die narkotisierten Maus auf einem absorbierenden Kissen. Befestigen Sie die Enden mit Klebeband der Maus.
  3. Rasur und den Bauch der Maus desinfizieren und führen Sie einen ventralen Laparotomie vom Schambein bis zum Schädelleberrand mit chirurgische Scheren mit scharfen / stumpfen Spitzen. Einzuschneiden die Bauchwand zu beiden Seiten, caudal der Membran.
  4. Setzen Sie die untere Hohlvene (IVC), indem Sie vorsichtig den Darm auf die rechte Seite zu bewegen. sezieren vorsichtig Fettgewebe um die IVC sterile Wattestäbchen Wattestäbchen und gebogener Spitze Pinzette.
  5. Inzision die suprahepatischen Membran und öffnen Sie die Brusthöhle durch zwei seitliche Schnitte mit feinen chirurgischen Schere mit scharfen / scharfen Spitzen. Ligieren der thorakalen IVC chirurgische Seide mit (5/0).
  6. Kanülieren die infra IVC ein abgeschirmtes iv Katheter vorsichtig die Nadel zu entfernen,die Transfusionspumpe anschließen und Perfusion der Leber beginnen. Wenn sie richtig durchgeführt wird, sollte die Leber sofort zu brühen und schwellen beginnen.
  7. TRANSECT die Pfortader ermöglicht geeignete Drainage von Blut und Perfusions-Medien unter Verwendung von feinen chirurgischen Schere.
  8. Perfundieren der Leber mit etwa 30 ml Leberperfusion Medien, und schalten dann Leber verdauen Medien (30 ml). Schalten Sie die Perfusions-Pumpe ab und entfernen Sie die Kanüle einmal Perfusion abgeschlossen ist.
  9. das Verbindungsgewebe verbindet die Leberlappen aussetzen vorsichtig den zentralen Bereich der Leber und zu lokalisieren. Besorgen Sie sich die zentrale Verbindungsfasern und sezieren sorgfältig alle Gewebe der Leber in Position zu halten und vorsichtig auf die Leber zu entfernen.
  10. Sofort übertragen die Leber in ein 50 ml Polypropylen konischen Röhrchen mit 15 ml Leber Medien verdauen.
    HINWEIS: Es gibt keine spezifische Zeit-Linie für diesen Schritt. Nach Perfusion bleibt die Leber in verdauen Medien für den Transport in eine sterile Zellkultur Kapuze. Alle subsequent Schritte sollten in einer sterilen Umgebung durchgeführt werden.

3. Isolierung und Behandlung von Zellen

  1. Innerhalb einer Zellkultur Kapuze, übertragen Sie die Leber aus dem 50-ml-Polypropylen-konische Röhrchen, das die Verdauung Medien in eine sterile Gewebekulturschale.
  2. Mit einer sterilen Pinzette vorsichtig reißen die vier Lappen der Leber. Wenn sie richtig durchgeführt wird, sollte Digestionsmedium trüb werden aufgrund von Hepatozyten aus der Leber zu isolieren.
  3. Unter Verwendung einer 25 ml sterile Pipettenspitze, filtern das trübe Digestionsmedium durch ein 70 um Nylon-Zellsieb in ein neues 50 ml Polypropylen-konisches Rohr unverdauten Gewebepartikel und die Zelltrümmer zu entfernen.
  4. Wiederholen Sie die Schritte 3.2 und 3.3 mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Dies hilft bei der alle restlichen Hepatozyten aus der Leber zu entfernen.
  5. Zentrifuge bei 50 × g für 2 min bei 4 ° C. Den Überstand aspirieren überschüssige Zelltrümmer enthält, und sanft resuspendieren Zellen in 25 ml kaltem 1xWilliams 'Medium E.
  6. Unter Verwendung einer 25 ml sterile Pipettenspitze, filtern die Resuspension durch eine neue 70 & mgr; m Nylon-Zellsieb in ein 50 ml Polypropylen konischen Rohr eine sauberere Suspension zu erzielen.
  7. Wiederholen Sie die Schritte 3.5 und 3.6 für drei zusätzliche Wäschen kalt Williams 'Medium E 1x mit einer klareren Zellsuspension zu erhalten.
  8. Nach dem letzten Waschschritt, Überstand absaugen überschüssige Zelltrümmer zu entfernen. Re-suspendieren und Filterzellen in 25 ml warmem Williams 'Medium E 1x dass primäre Hepatozyten Auftauens enthält und Plattieren Ergänzungen durch eine neue 70 & mgr; m Nylon-Zellsieb in ein 50 ml Polypropylen-konisches Rohr.
  9. Zählen von Zellen in der 25 ml Zellsuspension unter Verwendung eines Hämozytometers. Im Durchschnitt erwarten 15-20000000 Zellen pro Erwachsener Leber. Bestimmen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen Trypanblau-Färbung verwendet wird.
  10. Platte Zellen in 2 ml Williams 'Medium E 1x die primäre Hepatozyten Auftauen enthält und Plattierung Ergänzungen auf einer Kollagen-beschichteten 6-Well-cell Kulturcluster (9 x 10 5 Zellen pro Vertiefung).
  11. Nach 4 h Medien E 1x ändern Medien zu Williams ', die Wartung ergänzt primäre Hepatozyten enthält.
  12. Nach 24 h Serum Zellen mit Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) Medium hungern 1x für 6 h.
  13. Behandlung von Zellen mit PBS als Vehikel, FGF23 (25 ng / ml), LPS (100 ug / ml) oder IL-6 (50 ng / ml) in serumfreien Medium und Inkubation für 24 h.

4. Isolierung von RNA

  1. Bereiten RNA Kommerzielle Zentrifugiersäule-Kit nach den Anweisungen des Herstellers.

5. Erzeugen von cDNA aus isolierten RNA durch Reverse Transkription

  1. In 200 ng der isolierten RNA-Probe zu einem PCR-Röhrchen.
  2. In 14 & mgr; l Endonuklease freien H 2 O zu PCR - Röhrchen aus Schritt 5.1.
  3. Hinzufügen 4 ul reverse Transkriptase, um PCR-Röhrchen aus Schritt 5.1.
  4. Re-suspend Inhalt sanft Mischung homogen zu machen; Zentrifuge sanft.
  5. Platzieren PCR-Röhrchen die Mischung in einem Thermocycler enthält. Führen Thermocycler für die reverse Transkription: 1 Zyklus von 25 ° C (5 min), 42 ° C (30 min), 85 ° C (5 min) und Halten bei 4 ° C. Das Endprodukt wird die gewünschte cDNA sein.

6. Analyse von Zellen, die durch quantitative Real-time PCR (qPCR)

  1. Bereiten Sie die 96-Well - Platte.
    1. Legen Sie alle Komponenten von qPCR Reaktion auf Eis: 1 ul cDNA, 0,25 & mgr; M Vorwärts-Primer, 0,25 uM Reverse-Primer, 5 ul SYBR Green, 3,5 & mgr; l PCR-Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 10 & mgr; l. Mit SYBR Green, bereiten Master-Mix alle Proben in dreifacher Ausfertigung zu laufen.
    2. Sobald der Master-Mix abgeschlossen ist, um Wirbel homogen zu machen. Aliquotieren 9 ul qPCR-Mastermix in jede Vertiefung einer 96-wll Platte. Nach dem Fügen Sie vorsichtig 1 ul cDNA in jede Vertiefung. Die gesamte Reaktionsvolumen 10 & mgr; l werden.
    3. Nach dem Ladevorgang abgeschlossen ist, Siegel 96-Well-Platte mit optischenKlebefolie und kurz zentrifugieren 96-Well-Platte (50 × g für 1 min).
  2. Führen Proben in einem Echtzeit-PCR - Instruments. Legen Sie versiegelt 96-Well - Platte in Echtzeit-PCR - Instrument und laufen Proben pro Instrument Herstellerempfehlungen. Beispiele für Standard- und schnelle Zyklen sind unten enthalten.
    1. Für Standardzyklusparameter, verwenden Sie die folgende: anfängliche Denaturierung bei 94 ° C für 120 s, dann 40 Zyklen von 94 ° C für 15 s, 60 ° C für 60 s, und dann bei 4 ° C optional halten.
    2. Für die schnelle Zyklusparameter: Verwenden Sie die folgenden Schritte aus: anfängliche Denaturierung bei 94 ° C für 30 s, dann 40 Zyklen von 95 ° C für 5 s, 58 ° C für 15 s, und dann 72 ° C für 10 s.
  3. Siehe Instrument Handbuch nach, wie Daten zu analysieren.

7. Analyse von Zeilüberstände durch ELISA

HINWEIS: Alle Schritte werden durchgeführt nach dem Protokoll des Herstellers.

  1. Probenvorbereitung
    1. Dispense 398 & mgr; l Verdünnungsmittel in getrennte Röhren. Pipette 2 ul der Zellüberstand Probe in das 398 & mgr; l Verdünnungsröhrchen. Dies wird eine Verdünnung Falte 200 bereitzustellen.
    2. Wiederholen Sie Schritt 7.1.1 für jede Probe getestet werden.
  2. Verfahren
    1. Je 100 & mgr; l von 200-fach verdünnten Probe und ein Standard in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte.
    2. Inkubiere die Platte mit 96 Vertiefungen bei 25 ° C für 45 min auf einem Schüttler bei 150 Umdrehungen pro Minute.
    3. Waschen Sie die Vertiefungen 5 mal mit 1x Waschpuffer. Sobald die letzte Wäsche abgeschlossen ist, entfernen Sie alle Restwaschlösung mit saugfähigem Papier.
    4. In 500 ul von HRP-Konjugat-Reagens in jede Vertiefung.
    5. Wiederholen Sie die Schritte 7.2.2 - 7.2.3.
    6. Je 100 ul Tetramethylbenzidin (TMB) Reagenz in jede Vertiefung von 96-Well-Platte.
    7. Vorsichtig mischen 96-Well-Platte bei 25 ° C für 20 min auf einer MikrotiterplatteSchüttler bei 150 Upm. Die Reaktion durch direkte Zugabe von 100 & mgr; l Stopplösung in jede Vertiefung geben und vorsichtig mischen. Sobald der Stop-Lösung die Farbe hinzugefügt wird, sollte gelb. Dies informiert, dass die Stop-Lösung korrekt gemischt.
    8. Verwendung eines Mikrotiterplatten-Lesegerät, bestimmen die optische Dichte bei 450 nm innerhalb der ersten 5 min.
  3. Berechnung der Ergebnisse
    1. Berechnen Sie eine Tabelle der durchschnittlichen Absorptionswerte (A 450) für jede Probe und jeder Standard.
    2. Bauen Sie eine Standardkurve durch den A 450 Mittelwert jeder Standard - Verschwörung gegen seine Standardkonzentration in ng / ml auf einem linearen Graphen. Lassen Sie die x-Achse die Konzentration und die y-Achse zu repräsentieren eine 450 - Werte zu repräsentieren.
    3. Unter Verwendung der A 450 aus jeder verdünnten Probe bedeuten, bestimmen die Konzentration des gewünschten Proteins in ng / ml aus der Standardkurve.
    4. Multiplizieren Sie die Probenkonzentration durch die Verdünnung factor. Dies ermöglicht für die tatsächliche Konzentration des gewünschten Proteins in dem Zellüberstand Probe zu bestimmen.
    5. Zeichnen Sie die konstruierte Tabelle von Proben in einem Liniendiagramm. Wenn OD 450 Werte , die außerhalb der Standardkurve fallen, sollten die Proben in geeigneter Weise und erneut getestet verdünnt werden.
    6. Normalisieren Ergebnisse zu 500.000 Zellen.

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Ergebnisse

Histologie

Repräsentative Lichtmikroskopie Bilder von primären isolierten und kultivierten Zellen sind in 1A dargestellt. Immunzytochemische Analyse zeigt, dass isolierte Hepatozyten sehr Albumin (rot) zum Ausdruck bringen sowie Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor 4 (FGFR4) (grün). Kerne werden mit 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) (blau) gefärbt. (1B).

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Diskussion

Isolierung von primären Hepatozyten von Mäusen ist ein schnelles, kostengünstiges und zuverlässiges Werkzeug Entzündungsreaktionen ex vivo zu untersuchen. Wenn es richtig durchgeführt wird, können die Ergebnisse leicht in einer fristgerechten und kosteneffiziente Art und Weise erzeugt und reproduziert werden. Die folgenden Punkte sollten sorgfältig, um eine erfolgreiche Trennung zu gewährleisten, beurteilt werden.

Der chirurgische Einschnitt und die Kanülierung der IVC soll...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt zu erklären.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch die NIH (R01HL128714 zu CF) und (F31DK10236101 KS) und der American Heart Association (CF und AG) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Verbrauchsmaterialien
Cell Sieb 70 μ m Nylon-ZellsiebFalcon352350
BD Insyte AutoguardBD381412
50 mL konisches Polypropylen-RohrFalcon352098
100 6-Zoll-Applikatoren mit Baumwollspitze Puritan806-WC
1cc U-100 Insulinspritze 28 g 1/2Becton Dickinson329420
Gewebekulturschale 100 x 20 mm StyleCorning353003
6 Well ZellkulturclusterCostar3516
5/0 Schwarz geflochtene chirurgische Seide (100 Yards)LOOKSP115<
strong>NameCompanyKatalognummerKommentare<
strong>Ausrüstung
Minipuls 3 PerfusionspumpeGilsonF155007
Hämazytometer-Kits, PropperVWR48300-474
Hämazytometer-Abdeckgläser, PropperVWR48300-470
Chirurgische Schere - Scharf/BluntF.S.T.14001-12
Iris Schere-ToughCut GeradeF.S.T.14058-11
Dumont SS-45 PinzetteF.S.T.11203-25
Studentische GewebezangeF.S.T.991121-12
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Reagenzien
Essigsäurelösung, 2,0 NSigma      A8976-100ML
Isofluran, USP 250 mLPiramal Healthcare    66794-013-25
KetaVed 1.000 mg/10 mL (100 mg/ml)VEDCO      50989-161-06
Xylazin 100 mg/mlanaSed Injektion139-236
Willams' Medium E (1x)gibco12551-032
Leberperfusionsmedium (1x)gibco17701-038
Leberverdaumedium (1x)Life Technologies17703034
Auftauen und Beschichten von primären Hepatozyten NahrungsergänzungsmittelLife TechnologiesCM3000
Primäre Hepatozyten-ErhaltungsergänzungenLife TechnologiesCM4000
Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS) pH 7,4ThermoFisher wissenschaftliche10010031
Kollagen Typ 1Corning354236
Trypanblau LösungVWR45000-717

Referenzen

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Schlagwörter

Isolierung prim rer HepatozytenKultur muriner HepatozytenBeurteilung der Entz ndungsreaktionELISA Zytokindetektionquantitative Real Time PCRLPS BehandlungsprotokollFGF23 StimulationIL6 ExpressionsanalyseMessung der CRP SekretionHepatozyten Hungermethode

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