Die Zelloberflächen Adhäsionen sind von zentraler Bedeutung in Mechanotransduktion, da sie mechanische Spannung und initiieren die Signalwege beteiligt in Gewebshomöostase und Entwicklung übertragen. Hier stellen wir ein Protokoll für die biochemischen Wege Sezieren, die als Antwort auf Zug aktiviert werden, unter Verwendung von Liganden-beschichteten magnetischen Mikrokügelchen und Kraftbeaufschlagung Adhäsionsrezeptoren.
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Methodenartikel
Analyse Zelloberflächenhaftung Remodeling in Reaktion auf mechanische Spannung Mit Magnetic Beads
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Mechanosensitiven Zelloberfläche Adhäsionskomplexe erlauben Zellen die mechanischen Eigenschaften ihrer Umgebung zu erfassen. Jüngste Studien haben beide Kraftmess Moleküle an Haftstellen und kraftabhängige Transkriptionsfaktoren identifiziert, die linienspezifische Genexpression regulieren und phänotypische Ausgänge gilt. Allerdings haben die Signalisierungsnetze Umwandlung mechanischer Spannung in biochemischen Wege blieb schwer zu fassen. Um die Signalwege erkunden bei einer mechanischen Spannung in Eingriff angewendet Zelloberflächenrezeptor, können superparamagnetische Mikrokügelchen verwendet werden. Hier präsentieren wir ein Protokoll für magnetische Kügelchen mit Kräften an Zelloberflächen Adhäsionsproteine anzuwenden. Mit diesem Ansatz ist es möglich, nicht nur kraftabhängige Wege cytoplasmatischen Signal zu untersuchen, indem verschiedene biochemische Ansätze, sondern auch Remodeling Adhäsion durch magnetische Trennung von Haftkomplexen gebunden an den Liganden-beschichteten Kügelchen. Dieses Protokoll umfasst die Herstellung von Ligand-coATED superparamagnetische Perlen, und die Anwendung von Zugkräften durch biochemische Analysen gefolgt definieren. Darüber hinaus bieten wir eine repräsentative Stichprobe von Daten, dass die Spannung an Integrin-basierte Haftung Haftung Umbau angewendet demonstriert löst und verändert Proteintyrosinphosphorylierung.
Einleitung
In Metazoen leitet mechanische Spannung Gewebeentwicklung und Homöostase durch die Regulierung einer Vielzahl von zellulären Prozessen, wie Proliferation, Differenzierung und das Überleben 1, 2. Mechanische Spannung kann von der extrazellulären Matrix entstehen oder durch anhaftenden Zellen erzeugt werden, die Probe ihre extrazelluläre Umgebung durch die Aktomyosin Kontraktions Maschinen, die auf extrazelluläre Matrix zieht und Sonden ihre Steifigkeit durch spannungsempfindliche Moleküle. Als Reaktion auf die Spannung, durchlaufen mechanosensitive Adhäsionsproteine Konformationsänderungen, die komplexe Sign....
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Protokoll
1. Ligand Konjugation an Magnetic Beads
Hinweis: Ligand Konjugation durchgeführt unter Verwendung von superparamagnetischen Tosyl-aktivierte Kügelchen mit einem 2,8 & mgr; m Durchmesser (Konzentration der Stammlösung 10 8 Perlen / ml, 30 mg Perlen / ml). Das folgende Protokoll basiert auf Proben von ca. 2 x 10 5 Zellen, die MRC-5 - Zellen entsprechen , zu 80% Konfluenz in einer 60 mm - Gewebekulturplatte gezüchtet. Stellen Sie die Lautstärke von Perlen und Reagenzien entsprechend, wenn die Platten in verschiedenen Größen oder Zellen bei verschiedenen confluences verwenden. Verwenden Sie eine Menge an superparamagnetisc....
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Ergebnisse
Die schematische Darstellung der Technik ist in 1a veranschaulicht. Folgende Liganden Konjugation werden magnetische Perlen für 20 min mit Zellen inkubiert, und dann wird ein Permanentmagnet verwendet, um Zugkräfte von etwa 30-40 pN für verschiedene Zeitdauer anzuwenden. Abbildung 1b zeigt 2,8 um FN-beschichteten magnetischen Kügelchen gebunden zu MRC5- Zelladhäsionsrezeptoren.
Die Waschschritte der superparamagnetischen Perlen nach der Zelllyse sind entsche.......
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Diskussion
Das hier beschriebene Verfahren stellt einen einfachen Ansatz Spannung an Zelloberflächen Adhäsionsrezeptoren aufzutragen und ihre nachfolgende Reinigung ermöglichen. Jedoch sind einige Schritte kritische effiziente Haftung Reinigung und mögliche Optimierung ausführen kann in Abhängigkeit von den angestrebten Adhäsionsrezeptoren erfolgen. Wir präsentieren potenzielle Probleme der Benutzer unten auftreten können.
Wir verwendeten 2,8 um Durchmesser magnetische Kügelchen, aber größere Kügelchen.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Danksagungen
CG wird durch Zuschüsse der Agence Nationale de la Recherche (ANR-13-JSV1-0008), von der Europäischen Union Siebten Rahmenprogramm (Marie-Curie-Career Integration n˚8304162) und vom European Research Council (ERC) im Rahmen der Europäischen Union Horizon unterstützt 2020 Forschungs- und Innovationsprogramm (ERC Starting Grant n˚639300).
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Neodym-Magnete (auf der Oberseite der 60-mm-Schüssel) | K& J Magnetics, Inc | DX88-N52 | Klasse N52 Abmessung: 1 1/2" Durchmesser x 1/2" dicke |
| Neodym-Magnete (auf der Unterseite der 60 mm Schüssel) | K& J Magnetics, Inc | D84PC-BLK | Klasse N42 Abmessung: 1/2" Durchmesser x 1/4" dick Schwarzer Kunststoff beschichtet |
| Dynabeads M280 Tosylactivated | Thermofisher | 14203 | superparamagnetische Kügelchen |
| DynaMag-2 Magnet | Thermofisher | 12321D | |
| Fibronektin | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | Fibronektin aus Rinderplasma |
| Poly-D-Lysin | Sigma-Aldrich | P7280-5MG | |
| Apo-Transferrin | Sigma-Aldrich | T1428-50MG | Rinder-Apo-Transferrin |
| Rinderserumalbumin | Sigma-Aldrich | A7906-500G | |
| DMEM mit hohem Glukosegehalt, GlutaMAX-Ergänzung, Pyruvat | Life Technologies | 31966-021 | DMEM+GlutaMAX-I 500 ml |
| 60*15 mm Kulturschale | Falcon | 353004 |
Referenzen
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. 310 (5751), Science. New York, N.Y. 1139-1143 (2005).
- DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nat Rev Mol ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
