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Methodenartikel

Kultur von Adult transgener Zebrafische Retinal Explantate für das Live-Cell-Imaging von Multiphotonen-Mikroskopie

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DOI:

10.3791/55335

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24. Februar 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 2Department of Neurosurgery, Mayo Clinic

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Zebrabärbling retinale Regeneration hat meist unter Verwendung von Festnetzhäuten untersucht. Allerdings dynamische Prozesse wie interkinetic Kern Migration treten während der regenerativen Reaktion und erfordern Live-Cell-Imaging die zugrunde liegenden Mechanismen zu untersuchen. Hier beschreiben wir Kultur und Abbildungsbedingungen Interkinetic Kern Migration (INM) in Echtzeit unter Verwendung von Multiphotonen-Mikroskopie zu überwachen.

Zusammenfassung

Ein endogenes Regenerationsprogramm wird von Müller Glia im erwachsenen Zebrafisch (Danio rerio) Retina folgende neuronaler Schädigung und Tod eingeleitet. Die Müller Gliazellen wieder in den Zellzyklus und neuronale Vorläuferzellen erzeugen, die den folgenden Runden von Zellteilungen durchlaufen und in die verlorene neuronalen Zelltypen differenzieren. Sowohl Müller Glia und neuronaler Vorläuferzellkernen replizieren ihre DNA und durchlaufen die Mitose in bestimmten Orten der Netzhaut, also wandern sie zwischen dem basalen Inner Kernschicht (INL) und der äußeren Körnerschicht (ONL) verbunden sind, in einem Verfahren , wie Interkinetic beschrieben Nuclear Migration (INM). INM hat überwiegend in der Entwicklung von Netzhaut untersucht worden. Um die Dynamik von INM im erwachsenen Regenerieren Zebrabärbling Retina im Detail, Live-Cell-Imaging von fluoreszenzmarkierten Müller Glia / neuronale Vorläuferzellen zu untersuchen ist nicht erforderlich. Hier stellen wir die Bedingungen zu isolieren und Kultur dorsalen Retinaevon Tg [GFAP: nGFP] mi2004 Zebrabärbling , die für 35 h konstant starkem Licht ausgesetzt waren. Wir zeigen auch , dass diese Netzhautkulturen sind tragfähige Lebendzell - Imaging - Experimente durchführen, kontinuierlich z-Stapel - Bildern über die Dicke der retinalen Explantation für bis zu 8 h unter Verwendung von Multiphotonen - Mikroskopie zu überwachen das Zugverhalten von GFAP Erwerb: nGFP -positiven Zellen . Darüber hinaus beschreiben wir die Details post-Bildanalyse auszuführen, um die Geschwindigkeit der apikalen und basalen INM zu bestimmen. Zusammengefasst haben wir Bedingungen, die Dynamik von INM in einem Erwachsenen-Modell der neuronalen Regeneration zu untersuchen. Das wird unser Verständnis dieser entscheidenden zellulären Prozess voranbringen und es uns ermöglichen, die Mechanismen zu bestimmen, die INM steuern.

Einleitung

Im Gegensatz zu Menschen, Zebrabärbling (Danio rerio) zeigen eine robuste Regeneration Reaktion auf den Zelltod von retinalen Neuronen 1, 2, 3, 4. Tumor - Nekrose - Faktor α, ein Signalmolekül , das aus sterbenden retinalen Neuronen freigesetzt wird , induziert Müller Glia in der Basalschicht Inner Nuclear Wohnsitz (INL) der Netzhaut 5 zu proliferieren und neuronaler Vorläuferzellen erzeugen , die vor Differenzierung in die neuronale Zelle zur Proliferation fortzusetzen Typen , die 2 starben, 3, 4. Während der Proliferationsphase der Regenerierungsreaktion, die Kerne von Müller Glia und deren abgeleiteten neuronalen Vorläuferzellen durchlaufen eine sich wiederholende Migrationsmuster in Phase mit dem Zellzyklus (Interkinetic Nuclear Migration, INM) 6 > 7. Nuclei positioniert in der basalen INL replizieren ihre DNA vor zu den Äußeren Kernschicht Migration (ONL), wo sie sich teilen, bevor die entstehenden Kerne basal zum INL zurückzukehren. Dieser Prozess wurde erstmals während neuroepithelial Entwicklung mit histologischen Methoden beschrieben, während Live-Cell - Imaging Ansätze bestätigt später die Interpretation von Sauer 8, 9, 10, 11, 12. Beide histochemische und Live-Cell - Imaging Ansätze verwendet wurden Mechanismen zur Bestimmung zugrunde liegenden INM und seine Funktion bei der Entwicklung von Neuroepithels einschließlich der Netzhaut 9, 11, 12, 13. Jedoch haben die Mechanismen INM im erwachsenen Retina Regenerieren nicht sehr detailliert untersucht wordenxref "> 6, 7. Live-Cell - Imaging wird eine unschätzbare Ansatz sein , unsere Kenntnisse über die Signalwege zu fördern , die INM im erwachsenen regenerierende Retina steuern.

Bis vor kurzem wurde der Abbildung lebender Zellen von INM in der Retina beschränkt auf entweder live Genaktivität oder Hühnerembryonen oder postnatale Maus retinalen Explantate 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16. Während der Netzhaut Explantate von erwachsenen Tieren aus einer Vielzahl von Arten , einschließlich Maus, Ratte und Zebrabärbling haben für verschiedene zellbiologische Ansätze 17, 18, 19, 20, Live-Cell - Imaging Experimente mit retinalen Explantate ha genutzt wordenve beschränkt Zeiträume zu kurz und nicht kontinuierlich über mehrere Stunden 21 ausgeführt worden ist , 22. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Kultur lichtgeschädigter erwachsenen Zebrafisch Retina Abbildung lebender Zellen Experimente Überwachung INM mit Multi-Photonen - Mikroskopie 6 durchzuführen. Live - Cell - Imaging-Ansätze sind vorteilhaft gegenüber immunhistochemischen Methoden , wenn die Mechanismen zu untersuchen INM Controlling, wie die Dynamik des INM, zum Beispiel Geschwindigkeiten betroffen sein könnten , anstatt die Lage der Mitose, die würde möglicherweise nicht mit Immunzytochemie nachgewiesen werden.

In der Zukunft hat dieses Verfahren auch das Potential geändert werden zu studieren andere dynamische Vorgänge bei Netzhautregeneration, wie Phagozytose von Photorezeptoren durch Müller Glia oder das Verhalten von Mikroglia sterben.

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Protokoll

Hinweis: Zebrabärblinge wurden angehoben und in der Notre Dame Zebrabärbling Anlage im Freimann Life Sciences-Center erhalten. Die Verfahren in diesem Manuskript beschrieben werden von der University of Notre Dame Animal Care und Use Committee und sind in Übereinstimmung mit der Erklärung für die Verwendung von Tieren in der Forschung Vision von der Association for Research in Vision and Ophthalmology genehmigt.

1. Lösungen

  1. Bereiten Sie 70% Ethanol, um die Gewebekultur Haube zu sterilisieren und alle Geräte / Reagenzien, die in die Gewebekultur Haube übertragen werden.
  2. 2 mL 2-Phenoxyethanol auf 1 L des Systems Wasser (1: 500 2-Phenoxyethanol).
  3. Bereiten 0,1 mM NaHCO 3, pH 8,0. Verwenden einer 10 ml-Spritze und einer 0,2 & mgr; m Porengröße Spritzenfilter die Lösung in eine sterilisierte Gewebekulturhaube zu sterilisieren.
    HINWEIS: NaHCO 3 verwendet effizient die Zell- und Gewebeklebstoff auf der Deckfläche zu verteilen von fluorodishes (sieheSchritt 3.2).
  4. Bereiten 1,0 M CaCl 2 und 1,0 M MgCl 2. Sterilisieren mit einer 10 ml-Spritze und 0,2 & mgr; m Porengröße Spritzenfilter in einem sterilisierten Gewebekulturhaube.
  5. Hank's ausgewogene Salzlösung (HBSS), fügen Sie sterile CaCl 2 und sterile MgCl 2 bis 1x HBSS ohne Ca 2+ / Mg 2+, ohne Phenolrot bei einer Endkonzentration von 1 mM jeder vorzubereiten. Die Arbeit in einer sterilen Umgebung.
  6. Um Kulturmedium herzustellen, mischen 50% 1x Minimum Essential Medium (MEM) ohne Phenolrot, 25% HBSS enthaltend CaCl 2 und MgCl 2 (siehe Abschnitt 1.4), 25% Pferdeserum (HS), 10 Einheiten / ml Penicillin und 10 ug / ml Streptomycin. Die Arbeit in einer sterilen Umgebung.
    HINWEIS: Vermeiden Medium, das Phenol-Rot, wie es autofluoresces, wodurch Signal-Rausch-Verhältnis zu beeinflussen. 23
  7. Bereiten Sie 10 ml 1% niedrigschmelzender Agarose in 1x MEM ohne Phenolrot. Melt Agarose / 1x MEM mit einem microwave. Bereiten kleine Volumina von Agarose (zB 10 ml) als sich wiederholende Nacherwärmung wird lonenkonzentrationen aufgrund von Flüssigkeitsverdampfung verändern.
  8. Vor der Kultivierung sterilisieren 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen im Autoklaven.

2. Licht-Schaden Paradigm

  1. Dark-Anpassung
    1. Legen Sie 2 - 3 Tg [GFAP: nGFP] mi2004 Zebrabärbling (oder einer anderen transgenen Zebrafisch von Interesse) mit einem 6 - 14 Monate alt , in einer Umgebung frei von Licht für 14 d. Für weitere Detail Bezug nehmend auf 2, 6, 24, 25.
  2. Positionieren Sie den Tank mit 2 - 3 dunkeladaptierten transgenen Zebrafisch in System Wasser zwischen zwei Leuchtstofflampen , die Licht von 2.800 Lux emittieren 2, 6, 24, 25.
  3. Expose Zebrabärblingen konstant intensives Licht für 35 h. Während der Belichtung, sicherzustellen, daß die Wassertemperatur zwischen 31 aufrechterhalten wird - 33 ° C.

3. Vorbereitung für Anzucht (Am Tag der Retinal Isolation)

  1. Mit 70% Ethanol, sterilisieren die Gewebekultur Haube und die Komponenten / Werkzeuge, die in die Gewebekultur Haube übertragen werden (zB Flaschen mit MEM und HBSS, Pipetten, sterile Pipettenspitzen, usw.).
  2. Herstellung von fluorodishes
    1. Mantel ein fluorodish für jede Netzhaut mit Zell- und Gewebekleber (siehe Tabelle der Materialien).
    2. Verdünne die Zell- und Gewebekleber in 0,1 mM NaHCO 3 zu einer Endkonzentration von 70 ug / ml, werden 50 & mgr; l zu jedem fluorodish und verteilt die Lösung in der Mitte der fluorodish mit einer 200 & mgr; l - Pipettenspitze (etwa 1-1,2 cm Durchmesser ).
    3. Inkubieren der beschichteten fluorodishes mit 1 - 3 h bei RT; (Alternativ O / N bei 4 ° C inkubieren).
    4. Entfernen Sie die Lösung und spülen Sie 3x mit 500 ul 1x MEM für jede Wäsche. Um zu vermeiden, um die beschichteten fluorodishes vor dem Austrocknen, halten sie in MEM bis retinalen Explantate montiert sind.
  3. Bereiten Kulturmedium, wie in Schritt 1.6 beschrieben. Das Kulturmedium kann für bis zu 1 Woche bei 4 ° C gelagert werden.

4. Isolierung und Kultivierung von Retinal Explantate

HINWEIS: Das Protokoll ist unten beschrieben zur Isolierung der dorsalen Netzhaut, die das Netzhautregion, die überwiegend durch die beschriebene Licht-damage Paradigma läsionierten wird. Daher kann eine Beschädigung induzierte Proliferation und das zugehörige Ereignis von interkinetic Atommigration auftreten, in der dorsalen Retina. Netzhautregionen zu erhalten entsprechend den spezifischen Anforderungen der Forscher / Forschungsfrage kann jedoch die Isolierungsverfahren eingestellt werden.

  1. Euthanize ein lichtgeschädigter transgenen Zebrafisch einta Zeit in 1: 500 2-Phenoxyethanol.
  2. Entfernen von einem MEM fluorodish mit einer 1,000 & mgr; l-Pipette, so dass nur ein dünner Film von Flüssigkeit verbleibt.
  3. Übertragen Sie die Zebrabärbling auf ein trockenes Papiertuch, entfernen Sie das Auge mit einem gebogenen Paar Dumont Zange (Zange # 5, 45 ° Winkel) und übertragen sie auf den fluorodish.
  4. Mit Hilfe eines Stereomikroskops, richten das Auge mit der Pupille auf dem Deckglas des fluorodish so , dass die Rückseite des Auges mit dem Sehnerv sichtbar ist (Abbildung 1D).
  5. Mit einem Paar McPherson-Vannas Schere entfernen Sie den Sehnerv, Schneiden nahe an der Rückseite des Auges. Außerdem entfernen Bindegewebe die Außenseite des Auges auskleiden.
  6. Halten Sie das Auge zwischen den nasalen und temporalen Seite mit einem Paar # 5 Zange , während ein Schnitt an der Optik Stiel zu machen , indem sie mit einem Scherenblatt durch die Lamina cribrosa Lochen und Schneiden entlang sowohl der nasalen und temporalen Seiten des Auges (siehe Abbildung 1E , segmentierte line).
  7. Die Verwendung von zwei Paaren von # 5 Zange, eine für die dorsale Seite der Netzhaut hält und das andere Paar die ventral von der dorsalen Retina zu trennen, um das Gewebe zu ziehen.
    HINWEIS: Es ist ratsam, die dorsal Netzhaut zu orientieren, so daß die Linse und die Ganglienzellschicht der Deck Gesicht während der Sklera nach oben zeigt.
  8. Entfernen Sie die Sklera von der dorsalen Retina mit einem Paar von # 5 Zange, während die Linse hält , die mit einem zweiten Paar von # 5 Zange (Abbildung 1 H, I) an der Netzhaut verbunden ist.
  9. Um das Objektiv zu entfernen, verwenden McPherson-Vannas Schere und hinter der Linse schneiden , ohne die Netzhaut zu beschädigen (1I, J). Manchmal löst sich die Linse in Schritt 4.7. In diesem Fall entfernen Sie die Sklera vorsichtig mit einer Pinzette durch die Netzhaut an einer Schnittkante mit einem zweiten Paar von # 5 Pinzette.
  10. Entfernen Sie den Glaskörper, während die Linse zu entfernen, ohne die Netzhaut schädigen. Flatten die Netzhaut mit der Ganglienzellschicht mit Blick auf das Deckglasder fluorodish (Figur 1L, M).
  11. Surround die Netzhaut mit 10 & mgr; l von 1% mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose und lassen Sie die Agarose erstarren.
  12. Beobachten Sie, dass die flüssige Agarose nicht die Netzhaut abhebt als auch eine leichte Erhöhung der Fähigkeit beeinträchtigen könnten tief in das Gewebe zu fokussieren. Wenn Hebe beobachtet wird, verwenden Sie eine Pipette Agarose zu entfernen. Lassen Rest Agarose-Set, bevor Sie mehr hinzuzufügen.
  13. Wiederholen Sie Schritt 4.12 mehrmals vor dem 1% mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose Zugabe des gesamten fluorodish zu decken. Nach Erstarren der Agarose, 1,5 mL Kulturmedium.
  14. Pflegen Sie die Netzhaut Explantation Kultur in einem 5% CO 2 / Umgebungsluft bei 32 ° C eingestellt für ca. 12 h die Netzhaut zu ermöglichen , von dem Stress , der durch die Isolationsverfahren entstanden zu erholen. Stellen Sie die Temperatur auf 32 ° C Netzhäuten bei der gleichen Temperatur wie Licht behandelt Zebrabärbling zu halten (siehe Schritt 2.3).

5. Multiphotonen-Mikroskopie

Hinweis: Die Experimente in diesem Manuskript durchgeführt wurden , für ein Multi Mikroskop mit einem Infrarot - Laser (siehe Tabelle der Materialien), ein 40X Apo Fernwasser - Tauchziel (NA 1.15), ein Galvanometer - Scanner und eine komplett ausgestattete optimiert Klimakammer, die einen Einsatz für vier 35-mm-Petrischalen enthält. Die Bilder wurden mit einem nichtdescannte Detektor (R-NDD) erworben.

  1. Vor der Bildgebung, ins Gleichgewicht der Umweltkammer , die eine 5% CO 2 / Luftatmosphäre zu erreichen. Stellen Sie sicher, dass leere Petrischalen in die Halterung eingesetzt werden Austritt von Gas in den Raum zu vermeiden.
  2. Schalten Sie das Mikroskopiesystem.
  3. Sobald die Klimakammer ins Gleichgewicht gebracht wird, fügen Brechungsindex Flüssigkeit auf die 40X Apo Fernwasser-Tauchziel (NA 1.15).
    HINWEIS: Der Brechungsindex Flüssigkeit mit optischen Eigenschaften ähnlich wie Wasser verwendet wird während der Langzeitabbildungsverdampfung von Wasser zu vermeiden.
  4. Platz Grippeorodishes mit Retina-Explantate in die Kammer. Mit Hellfeld Licht, positionieren Sie die Probe in den Lichtweg und bringen den Mittelbereich der dorsalen Retina in der Fokusebene.
  5. Verwenden GFP epifluoreszenten Licht auf GFAP zu konzentrieren: nGFP -Positive Müller Glia Kerne (2A, C).
    HINWEIS: Wenn Explantate nicht montiert sind flach oder Agarose unter der Explantation angesammelt hat , wird es schwierig sein , auf die GFAP zu konzentrieren: nGFP -positiver Kerne oder sie werden schwach fluoreszieren.
    1. Überprüfen Sie, ob innerhalb der gleichen Netzhaut Explantation zu einem anderen Bereich bewegt, wird die Fokussierung Problem überwinden. bewegen Andernfalls zu einem anderen Netzhaut Explantation.
  6. In der Bildaufnahme-Software, öffnen Sie die "A1 MP GUI ', die' TiPad ', die' A1 Compact GUI" und der "ND Erwerb 'Fenster. Für Multi Bildgebung, sicherzustellen, dass die "IR NDD 'Option im' A1 Compact GUI 'gewählt wird.
  7. In der "setting 'Feld wählen IR-DM für die 1 dichroitischen Spiegel st und wählen Sie das Bandpassfilter 525/50 GFP - Fluoreszenz zu erwerben.
  8. Schalten Sie den IR-Laser im Fenster mit der Bezeichnung "A1MP GUI". Es dauert ein paar Minuten dauern, bis der Laser bereit zu sein. Stellen Sie die Wellenlänge auf 910 nm GFP-Fluoreszenz zu erregen und den Laser auszurichten, indem die 'Auto Ausrichtung "Taste in der" A1 MP GUI' Fenster klicken.
  9. Stellen Sie sicher, dass Raum und Ausrüstung Lichter ausgeschaltet sind oder abgedeckt, bevor Sie den Auslöser in der "A1 MP GUI 'Öffnen Überbelichtung des Photovervielfacherröhre zu vermeiden. Um den Lärmpegel, beherbergen das Mikroskop in abgedunkelter Umgebung zu reduzieren.
  10. Erwerben Bilder von einem Sichtfeld von 300 x 300 Pixel, bei einem Zoom von zwei und einer Pixel Verweilzeit von 4,8 & mgr; s / Pixel. Etwa die Laserleistung Fenster durch Änderung der "Erwerb Bereich" in der "A1MP GUI" und die Verstärkung in der 'A1 Compact GUI' eingerichtet.
  11. Einrichten des Z-Stapel
    1. Konzentrieren Sie sich auf das Ganglion Zellschicht der oberen Brennebene des Z-Stapel zu setzen in der 'Z'-Subwindow innerhalb des "ND Erwerb' Fenster. Einige GFAP: nGFP -positiven Zellen werden typischerweise in der Ganglienzellschicht befindet, welche die basale Grenze der Netzhaut (2A, D) zu identifizieren hilft.
    2. Bewegen , um die Fokusebene durch die Ebene der ONL (2A, B), die durch die Gegenwart von schwach markierten GFAP gekennzeichnet ist: nGFP -positiven Zellen , die rund sind und vergrößert relativ zu ihren Gegenstücken in der INL (2A, C) .
    3. Setzen Sie diese Ebene wie die Unterseite des z-Stack. Sicherzustellen , dass der gesamte ONL wird abgebildet (2A, B).
    4. Wenn Fokusebene Verschiebungen auftreten, die erfordern, während der Abbildungsperiode neu eingestellt wird, doppelklicken Sie auf die mittlere Position in der 'z' Subwindow es als die "Heimat" Position zuzuweisen. Wechseln Sie in "symmetrischen Modus definiert 'und klicken Sie auf "relative".
    5. Stellen Sie die z-Schrittweite zwischen 0,7 bis 1 um.
  12. Z-Intensität Korrektur:
    1. Wenden Sie z-Intensität Korrekturen für den Verlust der Pixelintensität zu kompensieren aufgrund der Lichtstreuung bei der Abbildung in den tiefen Schichten des Gewebes.
    2. So stellen Sie die Korrektur nach oben, öffnen Sie die "z-Intensitätskorrektur 'Fenster. So stellen Sie die 'z-Stack-Bereich ", wählen Sie" Aus ND'.
    3. Klicken Sie auf den unteren Brennebene in der "z-Intensitätskorrektur 'Fenster (in diesem Fall entspricht der Ganglion-Zellschicht) und stellen Sie die Laserintensität (" Erwerb Bereich "in der" A1MP GUI) und die Verstärkung (A1 Compact GUI ).
    4. Klicken Sie auf den Pfeil neben den 'z-Werte "in der" z-Intensitätskorrektur' Fenster, um die Einstellungen zu bestätigen, die später unter dem Posten "Geräteeinstellungen" in der "z-Intensitätskorrektur" Fenster für die gewählte Brennebene sind.
    5. Wiederholen Sie den Vorgang für die Mitte einnd oberen Ebenen, die Erhöhung der Laserleistung und der Verstärkung. Weitere Fokusebenen können bei Bedarf hinzugefügt werden. Siehe Tabelle 1 für bestimmte Laser und Verstärkungseinstellungen für Experimente in den Figuren 2 bis 4.
    6. Stellen Sie den "Erwerb Bereich" in der "A1 MP GUI 'Fenster. Vermeiden einen Erfassungsbereich größer als 15 und einen Verstärkungsfaktor höher als 126 zu Beginn der Bildgebungs Auswahl zu umgehen Photobleaching und eine erhöhte Geräuschentwicklung.
      HINWEIS: Laser und Photomultiplier-Röhren unterscheiden zwischen Mikroskopiesysteme, Test Laser und Verstärkungseinstellungen optimale Abbildungsbedingungen für das Mikroskop, während Photobleichens Vermeidung einrichten zu erhalten.
    7. Wählen Sie "relative Intensitätskorrektur" in der "z-Intensitätskorrektur 'Fenster.
  13. In der "Zeitreihen" Subwindow im Fenster "ND Erwerb", stellen Sie die Dauer bis 8 h und das Intervall auf "ohne Verzögerung". Dann stellen Sie sicher, dass die "Run z-Korrektur" in t zu klickener 'z-Stapel "Unterfenster im" ND Erwerb "Fenster, um die 3-D-Zeitreihen zu erwerben.
  14. Pflegen retinalen Explantate bei einer Temperatur von 27 - 29 ° C während der gesamten Dauer der Bildaufnahme.
  15. Während des gesamten Bildaufnahmeperiode, falls erforderlich, neu einzustellen, den Leistungspegel und Verstärkung, um die Bildqualität für die Post-Imaging-Analyse zu erhalten. Für Anpassungen führen Sie die Schritte 5.11.2 - 5.11.4.
  16. Wenn die Fokusebene verschiebt, Pause oder den Lauf zu stoppen und Schritt 5.11 erneut durchführen.
    HINWEIS: Wenn "relative z-Korrektur" in 5.12.7 Schritt gewählt wurde und Schritt 5.11.4 war es nicht notwendig, durchgeführt sollte Macht und Gewinn Ebenen, es sei denn, umfangreiche Photobleichens aufgetreten neu zu justieren.

6. Analyse der Geschwindigkeit

  1. Extrahieren Sie die Zeit, eine "Region of Interest" auf der Bildeinstellung. Verwenden Sie die "Zeitmessung" Werkzeug und exportieren Sie die Zeitwerte in eine Tabelle.
  2. Crop eine Region, die eine di enthältViding GFAP: nGFP -positiver Kern.
  3. Wählen die beschnittene Bereich, so dass sie mindestens einen Kern enthält, der nicht INM erfährt, um einen Referenzpunkt zu setzen, um anschließend die Abstände zu messen, die die Trennkern in Bezug auf die basale INL migriert. HINWEIS: einen Kern zu wählen, die in der basalen INL bleibt, hilft es, ein 3-D-Rekonstruktion der Zeitreihe vorzubereiten.
  4. Alternativ kann , wenn ein GFAP: nGFP -positiver Zelle in der ONL im gesamten Erfassungszeitraum beobachtet wird, eine vertikale Linie mit fester Länge aus dem ONL Kern zu den basalen INL Spanning verwenden , um einen Bezugspunkt zu identifizieren.
  5. Mit der Funktion 'show Scheiben Ansicht', erzeugen orthogonalen Projektionen. Anschließend ändern Sie den Modus von "Scheibe" auf "Maximum Intensity Projection '.
  6. Drehen Sie den 'xy' Ansicht der orthogonalen maximalen Projektion. Je nach Ausrichtung, bei der die wandernde / Dividieren Kern ist am besten sichtbar ist, einelso ausschalten entweder die 'xz'- oder die "yz'-Ansicht.
  7. Klicken Sie auf das restliche Bild mit der rechten Maustaste und extrahieren Sie die 'xz' oder 'yz'-Bild-Serie mit dem "Neues Dokument erstellen aus dieser Sicht' Funktion. Falls erforderlich, wird das Bild gedreht.
  8. Mit Hilfe der "manuellen Messung" Funktion, ziehen Sie eine horizontale Linie quer über das Bild auf der untersten Ebene des Kerns , die in den basalen INL bleibt und unterliegen nicht INM (= Bezugspunkt; 4A - E, Linie rot horizontal).
  9. Messen Sie den Abstand zwischen der Bezugslinie und der basalen Punkt des migrierenden Nukleus für die Zeitreihen der "Line - Messung" Werkzeug in der Analyse - Software (siehe Abbildung 4A - E).
  10. Sobald die Kernhülle bricht, messen Sie die basale Stellung des Somas, wenn es nach der Diffusion von GFP in der gesamten Zelle identifizierbar ist.
  11. ein Tabellenkalkulations-Software verwenden, zeichnen den Abstand a nuCleus migriert gegen die Zeit vergangen (4F).
    1. Zur Bestimmung der apikal Wanderungsgeschwindigkeit (v a), Graph die Abstände für die Zeit vor der Kernhülle Zusammenbruch gereist auftritt (4G).
    2. Wählen Sie die Datenreihe im Diagramm mit der rechten Maustaste klicken und legen Sie eine lineare Regressionskurve einschließlich der 'y = mx + c' entsprechende Funktion. Die Steigung 'm' in der Funktion steht für die Geschwindigkeit v a (4G).
    3. Wiederholen Sie die Schritte 6.11.1 und 6.11.2 für die erste Phase der schnellen Migration basalen die basale Migrationsgeschwindigkeit, v b (4H) zu bestimmen.

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Ergebnisse

Die Isolierung der Netzhaut nach dem Verfahren in der schematischen Darstellung in Figur 1 skizziert ermöglicht die Kultivierung eines abgeflachten dorsal Retina von lichtgeschädigter adult Tg [GFAP: nGFP] mi2004 Zebrabärbling über einen Zeitraum von mindestens 24 h in einer 5% CO 2 / Luft - Umgebung. Diese flachen montierten retinalen Explantate können Bildbrennebenen bei tiefen Gewebespiegel verwendet werden. Ein Beispiel ist Müller Glia ...

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Diskussion

Studien , die Mechanismen zu untersuchen Leitungs Regeneration des geschädigten erwachsenen Zebrabärbling Retina überwiegend eingesetzten immunzytochemische Methoden 5, 25, 26, 27, 28, 29, 30. Festlegung der Bedingungen, die mit Retina-Explantate Kultur und Live-Cell-Imaging auf Phänomene, ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Wir schätzen die Unterstützung durch William Archer und der Notre Dame Integrated Imaging Facility. Besonderer Dank für ihre kontinuierliche Unterstützung und ihre Pflege und Haltung der Zebrabärbling den Freimann Life Sciences Techniker gerichtet. Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Eye Institute of NIH DRH (R01-EY018417, R01-EY024519) und dem Zentrum für Zebrabärblinge Forschung, University of Notre Dame, Notre Dame, IN unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Dumont Pinzette #5World precision instruments14098
Dumont Pinzette #5, 45° WinkelWorld precision instruments14101
McPherson-Vannas SchereWorld precision instruments501233
FluordishesWorld precisioninstruments FD35-100
StereomikroskopNikon SMZ-1Bähnlicher Typ des Dissektions-Stereomikroskops funktioniert
Biologische Sicherheitswerkbank Klasse Typ A2Labconcoäquivalenter Typ funktioniert
Gewebekultur-InkubatorThermowissenschaftlicherHEPA-Klasse 100gleichwertiger Typ funktioniert
Sylvania Leuchtstofflampen OSFP5835HOECOBulbtronics31850
0,2 µ m Porengröße Acrodisc SpritzenfilterVWR4192
10 mL Luer-Lok SpritzeVWRBD309604
60 mL Luer-Lok SpritzeVWRBD309653
NaHCO3FischerScientificS233-500
CaCl2ThermoScientificC79-500
MgCl2EMD Millipore5980
HBSS ohne Ca2+/Mg2+, ohne Phenolrot, GibcoThermoScientific14175-095
MEM ohne Phenolrot, GibcoThermoScientific5100-038
Pferdeserum, hitzeinaktiviertThermoScientific26050-070
Penicillin/StreptomycinVWR16777-164
Ultrareine Agarose mit niedrigem SchmelzpunktThermoScientific16520-100
Ethanol, absolutThermoScientificBP2818-4
2-PhenoxyethanolSigma77699
Corning Cell-Tak Zell- und GewebeklebstoffVWR354240
Brechungsindex Flüssigkeit Cargille Lab1803Y
Nikon A1 Multiphotonenmikroskop ausgestattet mit einem MaiTai InfrarotlaserNikon-äquivalentesSystem funktioniert
40X Apo Langstrecken-Wasserimmersionsobjektiv (N.A. 1.15)
Klimakammer mit Einsatz für 35-mm-PetrischalenOkolab-äquivalentesSystem funktioniert NIS-Analysesoftware
Nikon

Referenzen

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