Modellierung Ovarian Cancer Vielzellige Sphäroid-Verhalten in einer dynamischen 3D-Peritoneal Microdevice

Zusammenfassung

ovarian Tumorprogression in einem physiologisch relevanten Modell, mehrzelligen Sphäroiden wurden in einem Mikroeinrichtung unter simulierten Fluidstrom zu studieren. Diese dynamische 3D-Modell emuliert die intraperitoneale Umgebung mit den zellulären und mechanischen Komponenten, bei denen Ovarialkarzinom Metastasen auftreten.

Zusammenfassung

Eierstockkrebs ist durch umfangreiche Peritonealdialyse Metastasen, mit Tumor Kugeln häufig zu finden in den malignen Aszites gekennzeichnet. Dies ist mit einer schlechten klinischen Ergebnissen assoziiert und hat derzeit keine wirksame Behandlung. Sowohl die dreidimensionale (3D) Umgebung und die dynamischen mechanischen Kräfte sind sehr wichtige Faktoren in diesem metastatic cascade. Allerdings scheitern traditionelle Zellkulturen diese natürliche Tumor-Mikroumgebung zu rekapitulieren. So wird in vivo -ähnlichen Modelle, die die intraperitoneale Umgebung emulieren können , sind selbstverständlich wichtig. In dieser Studie wurde eine neue mikrofluidische Plattform des Peritoneum eingerichtet, um die Situation des Ovarialkarzinoms Sphäroiden in der Bauchhöhle während der Metastasierung zu imitieren. Ovarialkarzinom Sphäroide unter einem nicht haftenden Zustand erzeugt wurden kultiviert in mikrofluidischen Kanälen mit peritonealen Mesothelzellen zu physiologisch relevanten Scherbeanspruchung unterworfen beschichtet. Zusammenfassend diese dynamischen 3D-Ovarialkarzinom-Mesothelium microfluidic Plattform können neue Erkenntnisse über die Biologie Grund Krebs liefern und dienen als Plattform für potenzielle Arzneimittel-Screening und Entwicklung.

Einleitung

Eierstockkrebs ist die tödlichste und gynäkologische Krebs ist durch weit verbreitete Peritonealdialyse Verbreitung und die Bildung von malignem Aszites ¹ gekennzeichnet. Diese umfangreiche Peritonealdialyse Metastasierung stellt eine große klinische Herausforderung und ist mit einer schlechten klinischen Ergebnissen in Verbindung gebracht. Anders als die meisten soliden Karzinomen, die über das Blut metastasieren, verbreitet Ovarialkarzinom in erster Linie innerhalb der Bauchhöhle. Tumorzellen existieren als mehrzellige Aggregate / Sphäroide während des Prozesses der Metastasierung ^2. Die Tatsache , dass Suspensionskultur Ovarialkarzinom Stamm / Tumor-initiierenden Zellen bereichern schlägt ferner vor, dass diese Sphäroiden können sowohl mit Tumoraggressivität und verbesserte Chemoresistenz ^{3, 4} zugeordnet werden. Es gibt Unterschiede in der Arzneimittelreaktion zwischen 2D- und 3D - Kulturen, die vermutlich unterschiedliche molekulare Mechanismen ⁵ haben.

_content "> Die wesentliche Wechselwirkung mit dem Mesothel konstruiert die primäre Mikroumgebung für Eierstocktumorprogression. Diese Mesothelzellen auf einer extrazellulären Matrix liegen (ECM), wobei Fibronektin ein allgegenwärtiges Bestandteil ist. Eine Verbindung zwischen der erhöhten Expression von Mesothelzellen abgeleitetes Fibronektin und Tumorprogression gezeigt wurde. Fibronektin in malignem Aszites reichlich vorhanden ist ^{6, 7.} Eierstockkrebszellen sind auch in der Lage , die Sekretion von Fibronektin aus Mesothelzellen zu induzieren , um frühen Ovarialkarzinom Metastasen ⁸ zu fördern.

Beweise Schwellen zeigt , dass mechanische Reize, einschließlich Scherspannung, kann die Zellmorphologie, Genexpression und somit die Phänotypen von Tumorzellen ^{9, 10, 11} zu modulieren. Als malignem Aszites entwickeln und sammeln sich während tumor Progression werden Ovarialtumor Zellen für den Fluidstrom ausgesetzt und die resultierende Schubspannung. Eine Reihe von Gruppen, unseres enthalten, haben die Auswirkungen der Scherspannung auf Eierstockkrebsprogression gezeigt, einschließlich Modifikationen Zytoskeletts, epithelial-mesenchymalen to-Übergänge und Krebs stemness ^{12, 13, 14, 15.} Somit ist eine physiologisch relevante Mikroumgebung wichtig für die Untersuchung von Tumor peritonealen Metastasierung. Jedoch Strom in vitro - Kultursysteme haben hydrodynamischen Beschränkungen nachahmt und Steuern eines konstanten, niedrigen, physiologisch relevanten Scherspannung ^{16, 17, 18, 19.} Herkömmliche in vitro - Ansätze entweder auf der zellulären oder mechanischen Umgebung konzentriert sind noch begrenzt indie Komplexität der intraperitoneale Mikro mit der richtigen physiologischen Relevanz nachahmt.

Hier wird, um ein neues Modell des Peritoneums zu konstruieren, die Grenzen der konventionellen Strategien zu überwinden und das Studium der intraperitonealen Kompartiment in Krebsmetastasen, eine 3D-Mikrofluidik-basierten Plattform mit gesteuerten Fluidfluß vorzurücken wurde entwickelt. In diesem Modell Ovarialkarzinom Sphäroiden wurden co-kultiviert mit primären humanen Peritonealdialyse Mesothelzellen in mikrofluidischen Chips unter kontinuierlicher Fluidstrom (1A). Die Mesothelzellen wurden auf Fibronectin ausplattiert. Nicht anhaftende Ovarialkarzinom Sphäroiden wurden durch eine Spritzenpumpe perfundiert mit kontinuierlicher Strömungsmedium in mikrofluidischen Kanälen ausgesät. Sowohl der 3D-Umgebung und die dynamischen mechanischen Kräfte sind sehr wichtige Faktoren der metastatic cascade. Diese Plattform kann zur Untersuchung der intraperitoneale Mikroumgebung in Bezug auf komplexe cel verwendet werdenzelluläre und Cokultur Wechselwirkungen sowie im Hinblick auf die dynamischen mechanischen cues.

Protokoll

1. Mikrofluidikvorrichtung Konstruktion und Herstellung

1. Mikrofluidik-Master-Design
   1. Entwurf und ziehen das mikrofluidische Kanalmuster mit jedem Computer-Aided Design (CAD) Software.
      HINWEIS: Normalerweise kann die CAD-Zeichnung auf eine Photomaske Unternehmen geschickt werden, um die Photomaske herzustellen. Die mikrofluidischen Design besteht aus drei identischen parallelen Kanälen, die jeweils mit den Abmessungen: 4 mm × 25 mm × 250 & mgr; m (Breite x Länge x Höhe) und Abstand 2 mm eingestellt. Beide Kanalenden wurden mit 127 ° Winkel für flüssigen Ein- und Ausgang (1B) zu erleichtern. Der Kanal in diesem Protokoll verwendet wurde in einer früheren Veröffentlichung ¹³ gemeldet.
   2. Waschen des Silizium-Wafers mit Ultraschallbehandlung (500 W / 42 kHz) in Aceton, Isopropanol und deionisiertem Wasser für 15 min jeweils. Trocknen Sie die Scheibe mit Stickstoffgas unter Druck. Erwärmen, um die Siliziumwafer auf einer heißen Platte bei 250 ° C für 15 min vollständig getrocknet, umes.
   3. Spin-Beschichtung einer Schicht aus SU-8 2075 Photoresist (125 & mgr; m dick) auf den Siliziumwafer mit einer Spinngeschwindigkeit von 1.800 Umdrehungen pro Minute. Backen des Photoresist-beschichteten Wafer direkt auf einer Heizplatte bei 65 ° C und dann bei 95 ° C, um überschüssiges Lösungsmittel, für 5 und 25 min zu entfernen, bzw. (nach der SU-8 Produkthandbuch).
   4. Wiederholen Sie Schritt 3 und spin-coat eine weitere Schicht aus SU-8 2075 Photoresist mit einer Enddicke von 250 um zu erhalten. Bake den Photoresist-beschichtete Wafer direkt auf einer Heizplatte bei 65 ° C für 7 min und dann bei 95 ° C für 30 min. langsam abkühlen, den Wafer auf Raumtemperatur. Nicht mit Druckluft zu kühlen.
   5. Richten Sie und legen Sie die Photomaske direkt auf der Oberseite des Wafers. Expose es mit UV-Licht für 20 s, das Muster zu vernetzen.
   6. Backen Sie die Wafer mit Photoresist bei 65 ° C und 95 ° C auf einer Heizplatte 5 und 12 min, um das Lösungsmittel für die Polymerisation (nach der SU-8 Produkthandbuch) zu entfernen. Danach kühlt den WaferZimmertemperatur.
   7. Entfernen Sie die nicht-vernetzte Photoresist durch den Wafer in SU-8-Entwickler eingetaucht wird für 25 min. Spülen Sie den Wafer mit Isopropanol und trocknen Sie es mit Druckluft.
      HINWEIS: Wenn eine milchige Lösung wurde beobachtet, wenn mit Isopropanol, was auf unvollständige Entwicklung Spülen, tauchen den Wafer zurück in SU-8-Entwickler für eine längere Entwicklungszeit.
   8. Platzieren des Wafers auf einer Heizplatte bei 180 ° C für 10 min, das Muster von möglichen Rissen zu heilen. Schalten Sie die Kochplatte aus und langsam abkühlen, den Wafer auf Raumtemperatur, indem es auf der heißen Platte zu verlassen.
   9. Fügen Sie ein paar Tropfen Trichlor (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) Silan in einer Phiole Kappe. Setzen Sie die Verschlusskappe im Vakuumexsikkator. Platzieren Sie den Wafer neben dem Fläschchen Kappe den Wafer für 10 min bis silanisieren.
2. PDMS Chipherstellung
   1. Wickeln Sie den Wafer mit einer Aluminiumfolie auf einen Halter erstellen.
   2. Mischen Sie das Polydimethylsiloxan (PDMS) Base und Härter bei einer 10: 1-Masse-Verhältnismit einem Kreiselmischer unter dem Mischen und Entgasen Funktion. Gießen Sie die PDMS-Gemisch langsam auf den Wafer bis zu einer Höhe von etwa 5 mm. Entgasen Sie den PDMS unter Vakuum für 40 min. Heilen die PDMS in einem Ofen bei 65 ° C für 2 h.
   3. schälen Sie vorsichtig die PDMS-Platte aus dem Master und schneiden Sie die PDMS entlang der Kanäle, bis sie die Größe eines Objektträger aus Glas ist. Stempel das PDMS mit einem 1-mm-Biopsie punch die Einlässe und Auslässe der Vorrichtung zu schaffen.
   4. Reinigen der PDMS-Oberfläche mit Druckluft und Klebebands Staub und PDMS Schmutz zu entfernen.
   5. Legen Sie die PDMS-Platte, mit der Kanalseite nach oben, in ein Plasma-Reiniger. Legen Sie einen sauberen Glasobjektträger in das Plasma Reiniger neben der PDMS-Platte.
   6. Behandeln Sie die PDMS und Glasobjektträger unter Luftplasma bei hohen HF-Pegel für 1 min. Binden Sie die PDMS auf dem Glasobjektträger eine irreversible kovalente Bindung zu schaffen.
   7. Legen Sie die PDMS-Chip auf einer heißen Platte bei 150 ° C für 1 h, um die Bindungsstärke zu erhöhen und die Hydrop zurückzukehrenhobicity der PDMS vor dem Gebrauch.

2. Seeding der Mikrofluidik-Chip mit Primary Peritoneal Mesothelzellen (HPMCs)

1. Fibronectinbeschichtung von mikrofluidischen Kanälen
   1. Sterilisieren des mikrofluidischen Kanal mit 30 & mgr; l 75% Ethanol. Entfernen des Ethanols und gründlich zweimal mit 30 & mgr; l sterilisierte Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) mit einer Pipettenspitze. Gründlich absaugen PBS in den Kanälen.
      HINWEIS: Um eine Kontamination, die mikrofluidischen Zellkultur minimieren sollte sorgfältig unter vollständig aseptischen Bedingungen durch den Einsatz eines Laminarströmungsabzug durchgeführt werden.
   2. Bereiten Sie eine 10 ug / ml Fibronektin-Lösung in Serum-freien M199: MCDB105 (1: 1) Medium. Pipette, um die Lösung auf und ab, mit besonderer Sorgfalt die Blasenbildung zu vermeiden. Nicht mit dem Vortex.
   3. Füllen Sie langsam jeden Kanal mit 30 & mgr; l von Fibronektin-Lösung auf. Verschließen Sie die Kanäle mit Klebeband und Inkubation des Chips über Nacht bei 4 ° C.
3. Kultur HPMCs in 10% fötalem Rinderserum (FBS) Kulturmedium (M199: MCDB105 mit 10% FBS ergänzt und 100 U / ml Penicillin / Streptomycin) unter 5% CO ₂ bei 37 ° C , bis 80% Konfluenz.
4. Spülen Sie die HPMCs mit 3 ml PBS und trypsinize mit 2 ml 0,05% Trypsin / 0,01% EDTA (TE) -Lösung für 30 s. Neutralisieren mit 4 ml 10% FBS Kulturmedium und Spin der Zellen bei 1000 × g für 5 min nach unten.
5. Resuspendieren der HPMCs in 2 ml 10% FBS Kulturmedium. Zählen Sie die Zellzahl mit einem Hämozytometer und stellen Sie die Zellkonzentration auf 3,5 × 10 ⁶ / ml.
6. Erwärmen Sie den Fibronektin-beschichteten Mikrofluidik-Chip in einem 37 ° C Inkubator für 5 Minuten vor dem Gebrauch. aspirieren vollständig den Fibronektin-Lösung.
7. Pipette langsam 30 ul HPMC Suspension in jedem Kanal. Verschließen Sie die Kanäle mit Klebeband und legen Sie die Geräte in der CO ₂ Inkubator über Nacht.

1. Ovarialkarzinom Sphäroidformation
   1. Pflegen Sie die humanen epithelialen Eierstockkrebs - Zelllinie SKOV-3 in 5% FBS Kulturmedium (M199: MCDB105 mit 5% FBS und 100 U / ml Penicillin / Streptomycin) unter 5% CO ₂ bei 37 ° C vor den Experimenten.
   2. Man löst 0,5% Agarose in sterilisiertem Wasser durch Kochen. Geben Sie 50 & mgr; l Agarose-Lösung in jede Vertiefung von Platten mit 96 Vertiefungen. Lassen Sie die Platten in der Haube für 20 Minuten die Agarose zu ermöglichen, sich zu verfestigen; verfestigte Agarose Beschichtung die Vertiefungen Zelladhäsion verhindern kann und zeigt an, dass die Platten für den Einsatz bereit sind.
   3. Spülen Sie die SKOV-3-Zellen mit 3 ml PBS. Trypsinize mit 2 ml TE-Lösung für 3 min. Neutralisieren mit 4 ml 5% FBS Kulturmedium und Spin der Zellen bei 1000 × g für 5 min nach unten.
   4. Zähle die SKOV-3-Zellzahl mit einem Hämozytometer und Resuspendieren der Zellen in 5% FBS Kulturmedium bei einer Dichte von 5.000 Zellen / ml. Transfer 200 & mgr; l der Zellsuspension in jede Agarose-beschichtete Vertiefung und der Kultur unter 5% CO ₂ bei 37 ° C für 48 h.
2. Krebs Sphäroid Laden
   1. Übertragen Krebs Sphäroide zu einer 50-ml-Zentrifugenröhrchen vorbenetzt mit 1 ml serumfreiem Medium und Spin-down bei 750 xg für 5 min.
      HINWEIS: vorbenetztes Pipettenspitzen und Zentrifugenröhrchen können auf die Zentrifugenröhrchen unerwünschte Sphäroid Befestigung verhindern.
   2. Bereiten 2,5 ug / ml 5-Chlormethylfluorescein diacetat (CMFDA) -Lösung in serumfreiem M199: MCDB105 Medium. Resuspendieren Krebs Sphäroide in 1 ml CMFDA Lösung und 30 min bei 37 ° C inkubieren. Zentrifuge bei 750 × g für 5 min.
   3. Spülen Sie die Krebs Sphäroide mit 2 ml serumfreiem Medium und Zentrifugation bei 750 × g für 5 min. Wiederhole diesen Schritt zweimal die verbleibende fluoreszierende Farbstoff aus dem Medium zu entfernen.
      HINWEIS: Das Fluoreszenzsignal kann in Sphäroiden mehr als 96 h beibehalten.
   4. Resuspendieren KrebsSphäroide in serumfreiem M199: MCDB105 Medium und das Sphäroid Zahl mit einem Hämozytometer zählen. Einstellen um die Konzentration auf 2,000 Sphäroide / mL mit serumfreiem Medium.
   5. Stand der Beladung zu Sphäroid injizieren langsam 100 & mgr; l serumfreiem M199: MCDB105 Medium, das die nicht-anhaftenden Mesothelzellen innerhalb der Kanäle abzuwaschen.
      HINWEIS: Eine schnelle Injektion, Aspiration, oder Blasenbildung wird auf die Ablösung der mesothelial einschichtigen führen.
   6. Last 30 ul fluoreszenzmarkierten Sphäroid Suspension in jeden Kanal. Platzieren Sie den Mikrofluidik - Chip in den CO ₂ Inkubator.
3. Perfusions-Plattformanordnung und Cokultur
   1. Bringen Sie eine Spritze gefüllt mit frischem, Serum-freien M199: MCDB105 Medium zu einem 1 m langen Schlauch.
   2. Legen Sie die Spritze auf der Spritzenpumpe und sichern Sie den Kolben und den Körper der Spritze. Installieren Sie die Spritzenpumpe in horizontaler Position auf der gleichen Höhe wie der Mikrofluidik-Chip im Inneren des Inkubators.
      NHINWEIS: Die Anzahl und Größe von Spritzen sind abhängig von der Anzahl der verwendeten Kanäle und die Dauer des Experiments.
   3. Sie rasch das Rohr mit Medium ziehen lassen, indem Sie die Schnellvorlauf-Taste gedrückt halten, bis das Medium den Schlauch überläuft.
   4. Führen Sie die Injektion an der gewünschten Strömungsgeschwindigkeit. Schätzen Sie die Wandschubspannung unter Verwendung der folgenden Gleichung:
      
      wo τ repräsentiert Spannung die Wandscher im Inneren der Kammer, ǫ = Strömungsgeschwindigkeit, μ = Viskosität (0,01 g cm ^-1); h = Flusskammerhöhe und w = Strömungskammerbreite.
   5. Den Schlauch mit dem Einlaß des Kanals. Platzieren des überschüssigen Einlassschlauch in den Inkubator, um sicherzustellen, daß das Medium vor dem in die Kanäle eingespritzt erwärmt. Um die Verbindung zwischen der Rohrleitung zu erleichtern und dem Kanal können entsprechende Anschlüsse gewählt werden. HINWEIS: Passen Sie keine Blase an den syrin einführenge, Schläuche und Verbindungen.
   6. Verbinden Sie den Ausgang des Kanals zu einem 50 ml konischen Röhrchen das Ausströmen Medium mit einem kurzen Ausgangsrohr zu sammeln.
      HINWEIS: Die komplette dynamische Co-Kultursystem ist in 1D gezeigt.

4. Beobachtung von HPMCs und Krebs Sphäroiden nach Perfusions

1. Beachten Sie die HPMCs und Krebs Sphäroiden mit einem Hellfeld oder Fluoreszenzmikroskop und fotografieren nach 1 h Perfusion.

Ergebnisse

Mit diesem Protokoll wurde eine mikrofluidische Plattform eingerichtet, um Ovarialkarzinom Sphäroiden mit Mesothelzellen unter hydrodynamischen Bedingungen modellieren. Primäre menschliche peritoneale Mesothelzellen wurden in der Mikrovorrichtung 16 h kultiviert und unter einem Hellfeld-Mikroskop beobachtet. Wie in 2A gezeigt, wurde die Kanalboden erfolgreich mit einer Monoschicht von HPMCs bedeckt. Es ist wichtig, dass die Blasenbildung während Fibronektin oder HPMC Mus...

Diskussion

Dieser Assay bietet eine flexible und physiologisch relevanten Modell, das mit verschiedenen biochemischen und zellbasierte Assays eingebaut werden können, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Adhäsionsassays, Mesothelzellen Clearance-Assays und Wirkstoff-Screening. Es kann zur Auswertung der Wirkung der intraperitonealen Mikroumgebung auf Krebsprogression angewendet werden. Jedoch mehrere Versuchsbedingungen müssen möglicherweise optimiert werden, abhängig von den Zielen des Projekts (beispielsweise die ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Silizium Wafer	University Wafer	#1196	100 mm
SU-8 2075 Fotolack	Microchem
SU-8 Entwickler	Microchem	108-65-6
Trichlor (1H, 1H, 2H, 2H-Perfluoroctyl)	Silan Sigma	448931
Sylgard 184	Dow Corning	1673921	Polydimethylsiloxan (PDMS) + Härter Kit
Biopsie-Stanze	Miltex	33-31AA	mit 1 mm Durchmesser
	Harrick Plasma	PDC-002
Polyethylenschlauch	SCI	BB31695-PE/5	0,86 mm (Innendurchmesser)
Spritze	Terumo
Spritzenpumpe	Längere Präzisionspumpe	LSP01-2A
Medium 199	Invitrogen	31100-035	Add 2.2 g/L Natriumbicarbonat
MCDB 105 Medium	Sigma	M6395
Fetales Rinderserum (FBS)	Hyklon	SH30068.02
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15070-063
Trypsin EDTA-Lösung	Gibco	25300-054	0,05 % Trypsin - 0,01 % EDTA, phenolrotes
Fibronektin humanes		BD 354008
Agarose	Invitrogen	15510-027
5-Chlormethylfluoresceindiacetat	Life Technologies	C7025	Green CMFDA
CO2 Inkubator	SANYO	MCO-18AIC
Zentrifuge	Hitachi	CT15RE
Fluoreszenzmikroskop	Nikon		Modell: 80i oder ECLIPSE Ti; Software: SPOT
SKOV-3& nbsp;			Geschenk von Dr. N Auersperg (University of British Columbia)