Methodenartikel

Isolierung von zirkulierenden Tumorzellen in einem orthotopischen Mausmodell des Darmkrebses

DOI:

10.3791/55357

⸱

18. Juli 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Gastrointestinal, Thoracic and Vascular Surgery, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, Technische Universität Dresden, 2German Cancer Consortium (DKTK), 3German Cancer Research Center (DKFZ)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir beschreiben die Etablierung von orthotopen kolorektalen Tumoren durch Injektion von Tumorzellen oder Organoiden in den Cecum von Mäusen und die anschließende Isolierung von zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) aus diesem Modell.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trotz der Vorteile der einfachen Anwendbarkeit und der Kostenwirksamkeit haben subkutane Mausmodelle schwere Einschränkungen und simulieren die Tumorbiologie und die Verbreitung von Tumorzellen nicht genau. Orthotopische Mausmodelle wurden eingeführt, um diese Einschränkungen zu überwinden; Allerdings sind solche Modelle technisch anspruchsvoll, vor allem in Hohlorganen wie dem Dickdarm. Um einheitliche Tumore zu erzeugen, die zuverlässig wachsen und metastasieren, sind standardisierte Techniken der Tumorzellpräparation und Injektion kritisch.

Wir haben ein orthotopisches Mausmodell von Darmkrebs (CRC) entwickelt, das hochgradig einheitliche Tumore entwickelt und für Tumorbiologie-Studien sowie therapeutische Studien eingesetzt werden kann. Tumorzellen aus Primärtumoren, 2-dimensionalen (2D) Zelllinien oder dreidimensionalen (3D) Organoiden werden in den Cecum injiziert und bilden je nach metastatischem Potential der injizierten Tumorzellen hochmetastatische Tumore. In Ergänzung,CTCs können regelmäßig gefunden werden. Wir beschreiben hier die Technik der Tumorzellpräparation sowohl aus 2D-Zelllinien als auch aus 3D-Organoiden sowie primärem Tumorgewebe, chirurgischen und Injektionstechniken sowie der Isolierung von CTCs aus den tumortragenden Mäusen und präsentieren Tipps zur Fehlersuche.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Darmkrebs (CRC) ist eine der häufigsten Ursachen für Krebs Tod in den westlichen Ländern. 1 Während der Primärtumor oft reseziert werden kann, verschlechtert das Auftreten von entfernten Metastasen die Prognose drastisch und führt oft zum Tod. 2 , 3 Das biologische Korrelat der Metastase ist zirkulierende Tumorzellen (CTCs), die sich vom Tumor lösen, im Kreislauf überleben, an das Epithel im Zielorgan anschließen, in das Organ eindringen und schließlich zu neuen Läsionen übergehen. 4 Obwohl CTCs bekanntermaßen von prognostischer Relevanz sind, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 wird ihre Biologie nur teilweise durch ihre extreme Seltenheit im CRC verstanden. 10

Mausmodelle sind ein leistungsfähiges tOol, um verschiedene Aspekte der Krebsbiologie zu studieren. Klassische, subkutane Tumormodelle werden durch subkutane Injektion von Tumorzellen in Empfängermäuse produziert, die entweder immunkompetent sein können (wenn syngene murine Tumorzellen verwendet werden) oder immundefizient sind. Subkutane Tumormodelle sind preiswert und produzieren schnell Daten; Ihr Endpunkt-Tumorwachstum kann leicht und nicht-invasiv gemessen werden. Allerdings scheitern 88% der neuen Verbindungen, die Antitumor-Aktivität in solchen Modellen gezeigt haben, in klinischen Studien. 11 Dies ist zum Teil auf interspezifische Unterschiede zwischen Menschen und Mäusen zurückzuführen; Allerdings ist ein großer Teil dieses Versagens auf den niedrigen prädiktiven Wert von subkutanen Mausmodellen zurückzuführen.

Orthotopische Mausmodelle, bei denen die Tumorzellen in das Herkunftsorgan injiziert und damit in ihrer ursprünglichen Mikroumgebung wachsen, werden daher zunehmend in der Krebsforschung eingesetzt. 11 , 12 , 13 , 14 Orthotopische Modelle simulieren nicht nur lokale Tumorwachstumsbedingungen; Als Ergebnis der anatomisch korrekten Ort des Tumorwachstums erlauben orthotopische Mausmodelle auch eine realistische Simulation der Metastasierung und werden daher zur Untersuchung der CTC-Biologie 8 , 15 , 16 oder ihrer Reaktion auf verschiedene Behandlungen im CRC verwendet. 13 , 17

Ein wesentlicher Nachteil von orthotopischen Mausmodellen ist ihre technische Komplexität. Je nach dem Organ, in dem die Zellen injiziert werden sollen, ist die Lernkurve, bis der Experimentator in der Lage ist, reproduzierbare Tumore zu induzieren, ziemlich lang. Dies gilt insbesondere für Darmkrebsmodelle, da die Tumorzellen in die Darmwand injiziert werden müssen, was oft zu Perforationen, Tumorzellleckagen oder endoluminalen Tumorzellverlusten führt. Dies einRtikel soll das Verfahren der Zellpräparation aus primären Gewebeproben, 2D-Zelllinien und 3D-Organoidkultur und deren Injektion in den Cecum von Mäusen beschreiben. Die hier beschriebene Technik führt zu hochgradig einheitlichen Tumoren und in Abhängigkeit von der Tumorbiologie der für die Injektion verwendeten Zelllinie eine reproduzierbare Bildung von entfernten Metastasen und CTCs in den Empfängermäusen. 15

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die hier vorgestellten Tierversuche wurden unabhängig von einem institutionellen und einem staatlichen Tierpflege- und -nutzungsausschuss unabhängig überprüft und zugelassen und wurden nach den Richtlinien der Föderation der Laboratoriums-Tierwissenschaften (FELASA) durchgeführt. Alle möglichen Maßnahmen wurden ergriffen, um Leiden einschließlich Anästhesie und Analgesie oder, wenn nötig, vorzeitige Sterbehilfe zu minimieren.

1. Vorbereitung von Zellen und Organoiden

HINWEIS: Verwenden Sie für jede Injektion ein Volumen von 20 μl mit 100.000 Zellen. Verwenden Sie die Basismembranmatrix (BMM), um Leckagen zu vermeiden und eine standardisierte Injektion zu gewährleisten. Um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen, führen Sie in regelmäßigen Abständen Zelllinien-Authentifizierungsassays ( zB über STR-Profilierung) durch.

  1. Vorbereitung von primären Zellsuspensionen aus frischem Gewebe
    HINWEIS: Immer unter sterilen Bedingungen arbeiten. Sofortige Übertragung der frischReseziertes Gewebe vom Operationssaal zum Labor auf Eis ist erforderlich, um eine hohe Lebensfähigkeit der Zellen zu gewährleisten.
    Das Wohlbefinden und die optimale Behandlung des Patienten müssen immer die erste Priorität sein. Daher müssen Gewebeproben für die Forschung in einer Weise erhalten werden, die die nachfolgende pathologische Aufarbeitung und Inszenierung des resezierten Tumors nicht beeinträchtigt. In den meisten Fällen ist es daher sinnvoll, die Untersuchungsmuster von einem ausgebildeten Pathologen zu erhalten, um eine Nicht-Interferenz mit der pathologischen Diagnose zu gewährleisten.
    1. Unmittelbar nach steriler Entfernung aus dem resezierten Exemplar (idealerweise ~ 1 cm 3 ) die Gewebeprobe in ein 50 ml Röhrchen geben, das mit 20-30 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vorgefüllt ist. Die Röhre auf Eis aufbewahren und sofort ins Labor bringen.
    2. Setzen Sie das Gewebe in eine Petrischale und waschen Sie es zweimal mit viel PBS, um das übrige Blut zu entfernen.
    3. Schneiden Sie das Gewebe in kleine Stücke (~ 2-4 mm) mit einem scaLpel ( zB mit einem # 20 oder # 36 Klinge).
    4. Benutzen Sie den Dissoziator gemäß den Anweisungen des Herstellers, um das Tumorgewebe weiter zu einer einzelligen Suspension zu dissoziieren. Alternativ verwenden Sie andere Protokolle der enzymatischen Tumorverdauung.
    5. Zählen Sie die Zellen der resultierenden Einzelzell-Suspension ( z. B. in einem Coulter-Counter oder einem Hämocytometer).
    6. Zentrifuge (5 min bei 1.500 xg) und die Zellsuspension zweimal mit PBS waschen.
    7. Die Zellen in BMM in einer Konzentration von 5 x 10 6 Zellen / ml resuspendieren und auf Eis aufbewahren.
  2. Vorbereitung der Zelllinien zur Injektion
    1. Wachsen Sie alle kolorektalen Krebszelllinien unter Standardkultivierungsbedingungen (37 ° C, 5% CO 2 ) und bereiten sie am Tag der Operation vor.
    2. Ernte die Zellen nach Standardzellkulturprotokollen, zähle die Zellen ( z. B. in einem Coulter Counter oder einem Hämocytometer) und berechne die ReqBenötigte Menge für alle Injektionen abhängig von der Anzahl der zu injizierenden Tiere
    3. Bereiten Sie 3-5x des tatsächlich benötigten Volumens vor, um Pipettierungsverluste und das Totvolumen der Injektionsspritze zu berücksichtigen.
    4. Zentrifuge (5 min bei 1.500 g) und die Zellsuspension zweimal mit PBS waschen.
    5. Die Zellen in BMM in einer Konzentration von 5 x 10 6 Zellen / ml resuspendieren und auf Eis aufbewahren.
  3. Organoidvorbereitung
    HINWEIS: Alle 3D-Organoidkulturen werden unter Standardkultivierungsbedingungen (37 ° C, 5% CO 2 ) angebaut. Detaillierte Protokolle für die Organoidkultur wurden bereits veröffentlicht. 18 , 19 , 20 Ähnlich wie bei herkömmlichen Zelllinien empfehlen wir ein Volumen von 20 μl BMM mit 100.000 Zellen pro Injektion. Die Organoide werden am Tag der Operation wie folgt vorbereitet:
    1. Bereiten Sie das folgende Medium vor (im Folgenden:Als DMEM / F12 +++): Fortgeschrittenes Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) / F12 + 1% HEPES (1M) + 1% Glutamin (200 mM) + 1% Penicillin / Streptomycin.
    2. 15 ml Röhrchen mit 1 mL DMEM / F12 +++ vorfüllen.
    3. Die Organoide sorgfältig von der Oberfläche der Kulturplatte abspülen und den Inhalt von 3 bis 5 Vertiefungen in ein 15-ml-Röhrchen überführen.
    4. Die Organoide vorsichtig in kleinere Stücke zerlegen, indem sie mit einer ausgedehnten Glaspipette auf- und abziehen.
    5. Füge 5 ml DMEM / F12 +++ zum Röhrchen hinzu, gefolgt von einer Zentrifugation bei 1000 xg für 5 min.
    6. Nach der Zentrifugation den Überstand entfernen, das Pellet in 600 μl enzymatischen Dissoziationspuffer resuspendieren und die Suspension auf eine Vertiefung einer 6-Well-Platte überführen.
    7. Inkubieren bei 37 ° C für 1-5 min und dann sorgfältig pipettieren die Suspension auf und ab, um die Organoide aufzulösen.
      HINWEIS: Überprüfen Sie die Verdauung über Mikroskop; Es ist komplett, wenn alle Zellcluster dissoziiert sindD zu einzelnen Zellen.
    8. Nach erfolgreicher Verdauung werden 1,4 ml DMEM / F12 +++ zugegeben, um die Verdauung zu stoppen. Dann alle Vertiefungen von verdauten Organoiden in ein 50-ml-Röhrchen überführen.
    9. Zähle die Zellen und berechne die benötigte Menge für alle Injektionen.
    10. Bereiten Sie 3 - 5x des tatsächlich benötigten Volumens vor, um Pipettierungsverluste und das Totvolumen der Injektionsspritze zu berücksichtigen
    11. Zentrifuge (5 min bei 1.500 xg) und die Zellsuspension zweimal mit PBS waschen.
    12. Resuspended die Zellen in BMM auf eine Konzentration von 5 x 10 6 Zellen / ml und halten sie auf Eis.

2. Orthotopisches Mausmodell

  1. Vorbereitung der Empfänger Tiere für die Chirurgie
    HINWEIS: Verwenden Sie 6-8 Wochen alte NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl / SzJ (NOD scid gamma, NSG) Mäuse als Empfänger. 21 NSG gehören zu den am meisten immunsupprimierten Mäusen, ohne reife B-, T- und NK-Zellen zusammen mit mehreren anderen ImmunenFects 21 Sie wachsen auch bei niedrigen Zellzahlen tödlich und sind anfällig für entfernte Metastasen. NSG-Mäuse sind hervorragende Züchter und können in konventionellen spezifischen pathogenfreien (SPF) Einheiten gehalten werden.
    1. Vor dem ersten Einschnitt injizieren Sie 0,05 mg / kg Buprenorphin subkutan.
    2. Sevofluran bei 3-3,5 Vol .-% zur Vollnarkose verwenden. Ein Verlust des Zehenkolbenreflexes zeigt genügend Anästhesie an.
    3. Bedecken Sie die Augen der anästhesierten Mäuse mit ophthalmischer Salbe, um die Austrocknung der Hornhaut zu vermeiden.
    4. Beschränke die Mäuse in einer Rückenlage auf einem kleinen Tisch.
    5. Rasieren Sie den Bauch mit einem elektrischen Rasierer (Enthaarungscreme kann alternativ verwendet werden) und desinfizieren mit mindestens 3 mal Clorhexidin / Jod und 70% Alkohol alternativ.
    6. Decken Sie das chirurgische Feld mit sterilen Vorhängen ab.
      HINWEIS: Die Verwendung von perioperativen Antibiotika ist optional und unterliegt institutionellen Richtlinien.
  2. Mittellinie Laparotomie und Exposition des Zökums
    1. Verwenden Sie eine Schere (Skalpelle können alternativ verwendet werden), um eine kleine Mittellinie (3 - 5 mm) der Haut auf dem Unterbauch zu machen. Die Bauchwandmuskulatur mit Pinzette aufnehmen und mit einer Schere sorgfältig einarbeiten und damit die Bauchhöhle öffnen.
    2. Das Zökum mit atraumatischer Pinzette identifizieren und sorgfältig ausbauen. Positionieren Sie die blinde Endbeutel des Zökums auf dem Bauch, der kranial zeigt.
    3. Sobald es aussen ist, halten Sie den Cecum feucht mit warmen Kochsalzlösung Tupfer zu allen Zeiten.
  3. Orthotopische Injektion, Verschluss des Bauches und postoperative Erholung
    1. Für die intracecale Injektion verwenden Sie eine Standard 1 ml Spritze mit einer 30 G Kanüle. Montieren Sie diese Spritze auf eine Mikroinjektionspumpe, die wiederum auf einem Mikromanipulator montiert ist.
    2. Füllen Sie die Spitze des Zökels sorgfältig mit atraumatischer Pinzette und glätten Sie sie sanft, indem Sie sie nach hinten streichenD mit einem zweiten Satz von Pinzette angefeuchtet mit warmer Kochsalzlösung.
    3. Positionieren Sie die Kanüle direkt über dem Zökum.
    4. Führen Sie die folgenden Schritte unter visueller Kontrolle mit einem binokularen chirurgischen Mikroskop durch.
    5. Vorsichtig das Zökchen mit zwei atraumatischen Pinzetten an beiden Enden des außen liegenden Teils des Zökels ergreifen, leicht ausdehnen und dann langsam über die Kanüle ziehen, die parallel und direkt oben positioniert ist. Es ist entscheidend, die gesamte Darmwand nicht zu perforieren (also die Zellen in das Lumen einzuspritzen) und die Serosa nicht über den Anfangspunkt der Penetration hinaus zu perforieren, da dies zu einer Leckage und einer peritonealen Verbreitung führen würde.
      1. Bewegen Sie den Darm in Richtung der Kanüle, nicht die Kanüle zum Darm. Halten und strecken den Darm zwischen zwei Pinzetten. Die Hände des Chirurgen müssen auf einer Oberfläche ruhen, um das Zittern zu reduzieren.
    6. Injizieren Sie die Zellen zwischen der Serosa (als sehr dünne, lichtdurchlässige Futter über thE intramurale Blutgefäße) und die Muscularis. Die Kanüle muss also visuell oberhalb der Blutgefäße und unterhalb der dünnen lichtdurchlässigen Membran platziert werden.
    7. Verwenden Sie einen Fußschalter, um die Injektion zu starten, um Tremor zu reduzieren, während sich die Kanüle in der Darmwand befindet.
    8. Sobald die Kanüle in Position ist, starten Sie die Injektion. Verwenden Sie eine Dauer von 20 s, was zu 1 μL / s Einstellung am Steuergerät der Pumpe führt.
      HINWEIS: Die Injektion in oder in der Nähe eines beschädigten Blutgefäßes führt zu einer direkten intravaskulären Verbreitung und einer entfernten Metastase und sollte daher vermieden werden.
    9. Nach Beendigung der Injektion die Kanüle vorsichtig entfernen, indem man sie nach hinten zieht.
    10. Setzen Sie einen trockenen Tupfer unter den Zökum und gründlich spülen Sie den Zökum mit destilliertem Wasser, um Leckzellen zu lysieren und damit künstliche peritoneale Verbreitung zu verhindern.
  4. Verschluss des Bauches und postoperative Erholung
    1. Nach rInsert, sanft das Zökum in die Bauchhöhle zurückgeben.
    2. Schließen Sie die Bauchwand mit 6-0 schnell resorbierbaren Laufnähten.
    3. Schließen Sie die Haut mit chirurgischen Wundclips.
    4. Legen Sie die Maus auf eine Heizkarte auf 38 ° C, bis sie sich vollständig von der Anästhesie erholt hat.
    5. Beobachten Sie den postoperativen Zustand der Mäuse für die folgenden 48 h. Im Falle von Not, mit 0,05 mg / kg Buprenorphin alle 12 h behandeln.
    6. Überwachen Sie die Mäuse mindestens einmal täglich auf Anzeichen von Not durch Tumorwachstum.

3. Isolierung von zirkulierenden Tumorzellen aus Vollblutproben

HINWEIS: Erhalten Sie Blut durch transkutane Herzpunktion auf anästhesierte Mäuse, gefolgt von Euthanasie. Idealerweise werden 1000 μl Blut in eine mit 100 μl eines Antikoagulans (Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) oder Heparin) vorgefüllte Spritze gezogen. Verwenden Sie eine Anti-Human-EpCAM (Epithelzell-AdhäsionMolekül) Antikörper zur Identifizierung der CTCs. Dies funktioniert sehr gut, wenn menschliche epitheliale Zelllinien im Mausmodell verwendet werden. Für andere Geräte können unterschiedliche Antikörper erforderlich sein.

  1. CTC Anreicherung:
    1. 15 ml Röhrchen mit 5 mL Dichtegradientenmedium vorfüllen und das Blut vorsichtig in das 15 mL Röhrchen überführen.
    2. Zentrifuge (30 min bei 300 xg ohne Bremse) und vorsichtig den oberen Überstand entfernen.
    3. Gießen Sie den Rest in eine neue 15-ml-Röhre und zentrifugieren Sie (15 min, 300 xg mit Bremse).
    4. Gewinnen Sie die Zwischenphase, die die mononuklearen Zellen enthält (verwerfen den Rest) und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS.
    5. Das Pellet wird in 200 & mgr; l PBS / 1% EDTA resuspendiert und mit 4 & mgr; l EpCAM-Antikörper versetzt. Inkubieren Sie 20 min auf Eis im Dunkeln.
  2. Screening und Kommissionierung
    1. Den folgenden Puffer vorbereiten (im Folgenden als Pufferpuffer bezeichnet): PBS + 10% fötales Kälberserum (FCS) + 1% Penicillin / STreptomycin (1%) + 0,8% EDTA.
    2. Verwenden Sie einen PAP-Stift, um einen ~ 1 cm-Kreis in einer 6 cm sterilen Petrischale zu ziehen (verhindert das Dispergieren der Flüssigkeit in der Schale) und pipettieren Sie 700 μl Pufferpuffer in diesen Kreis.
    3. Füge 50 μl Zellsuspension dem 700 μl Picking Puffer innerhalb des Kreises hinzu. Überprüfen Sie die Dichte der Zellen mit dem Mikroskop. Die Probe in verschiedene Gerichte aufteilen, wenn sie zu dicht ist.
    4. Warten Sie, bis sich die Zellen absetzen (~ 5 min).
    5. Schieben Sie den Tropfen der Zellsuspension auf gefärbte (= EpCAM-positive) Zellen.
    6. Sobald eine Zelle gefunden ist, wählen Sie die Zelle mit dem Mikromanipulator und legen Sie sie in 50 μl Puffer in Abhängigkeit von der beabsichtigten nachgeschalteten Analyse ( zB RNA Extraktionspuffer oder Kultivierungsmedium).
    7. Abhängig von den beabsichtigten Downstream-Analysen, isolieren EpCAM-negative Zellen und / oder Medium als Negativkontrollen.
    8. Gehen Sie mit nachgeschalteten Analysen ( zB Zellkultur, PCR) vor.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die erfolgreiche und reproduzierbare Erzeugung von kolorektalen Tumoren in diesem Modell hängt entscheidend von der genauen Injektion der Zellen ohne Verschütten oder Lecken ab. Wenn dies erreicht wird, ist dieses Modell äußerst zuverlässig und führt selten zu einer künstlichen peritonealen Verbreitung. Die Wachstumskinetik der Tumore sowie deren Verbreitungsmuster hängen von der Biologie der verwendeten Organoide und Zellen ab. 15 Während HCT116-Zellen in diesem ...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trotz ihrer präklinisch bewährten Aktivität bei subkutanen Mausmodellen scheitert die große Mehrheit der neuartigen Verbindungen in klinischen Studien und erreicht niemals die Klinik. 11 Diese offensichtliche Insuffizienz von subkutanen Mausmodellen zur genauen Simulation der Biologie und Wachstumsmuster von Tumoren hat zur Entwicklung von orthotopischen Mausmodellen geführt, die auf der Injektion von Tumorzellen direkt in das ursprüngliche Organ basieren.

Orthotopisc...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde von der deutschen Forschungsstiftung (WE 3548 / 4-1) und der Roland-Ernst-Stiftung für Gesundheitswesen (1/14) unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Zellkulturmedien und -komponenten
Advanced DMEM F12Invitrogen12634010DMEM/ F12 +++ medium
HEPES (1 M)Life Technologies GmbH15630056DMEM/ F12 +++ medium
Glutamax-I Supplement (200 mM)Life Technologies GmbH35050038DMEM/ F12 +++ medium
Penicillin/ Streptomycin (PenStrep)Life Technologies GmbH15140122DMEM/ F12 +++ Medium
DMEMLife Technologies GmbH61965026Basismedium von 2D-Zelllinien (DMEM/10% FCS)
Fötales Kälberserum (FCS)BIOCHROM AGS 0115Basismedium von 2D-Zelllinien (DMEM/10% FCS)
TrypLE Express enzymatischer DissoziationspufferLife Technologies GmbH12604021
Matrigel Basalmembran-Matrix (BMM, phenolrotfrei)CORNING B.V. Life Sciences356231
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineLife Technologies GmbH14190169
Trypsin-EDTA (0,25%, phenol-rot)Life Technologies GmbH25200072
6-/48-Well-Platten mit DeckelCORNING3516/3548
Zellkulturkolben 75 cm², 250 mLVWR International GmbH734-2066
Zellkulturflasche 150 cm², 600 mLCorning B.V. Life Sciences355001
Eppendorf Röhrchen 1,5 mL / 2 mLSarstedt AG & Co. KG72.706.400/ 72.695.400
15 mL, 50 mL ZentrifugenröhrchenGreiner-Bio-One GmbH188271/227270
TC10 Zählobjektträger (für TC20 Zählmaschine)Bio-Rad Laboratories GmbH1450016
Pasteurpipetten (Glas, 150 mm)Fisher Scientific GmbH11546963/ FB50251gezogen mit einem Bunsenbrenner
schonender MACS DissoziatorMiltenyi Biotec130-093-235für die Aufbereitung von Primärtumorgewebe
MACSmix Tube RotatorMiltenyi Biotec130-090-753für die Aufbereitung von Primärtumorgewebe
gentleMACS C TubesMiltenyi Biotec130-093-237für die Präparation von Primärtumorgewebe
Dissoziationskit für humane TumoreMiltenyi Biotec130-095-929für die Präparation
von PrimärtumorgewebeFalcon 70 & Mikro; m CellStrainer Corning B.V. Life Sciences352350für die Präparation von Primärtumorgewebe
Name<>Company<strong>Katalognummer><>Kommentare
Chirurgische Ausrüstung
SevofluranAbbVie Germany GmbH & Co.KG-Medical
oxygenAir Liquide Medical
Temgesic-Bepanthen
- AugensalbeBayer Vital GmbH10047757
Normale Kochsalzlösung 0,9% (E154)Serumwerk Bernburg AG10013
Aqua ad injectabiliaBraun235144
1 mL Spritze (ohne Totvolumen) - Injekt-F SOLOBraun/neoLab194291661
30G InjektionsnadelBECTON DICKINSON304000
ZellulosetupferLohmann & Rauscher Deutschland13356
Micro-Adson PinzetteFST - Fine Science Tools11018-12
Irisschere - ToughCutFST - Fine Science Tools14058-11
Olsen-Hegar NadelhalterFST - Fine Science Tools12002-12
AutoClip KitFST - Fine Science Tools12020-00
PDS Z1012H 6/0 C1 (chirurgisch) Naht)Johnson & Johnson Medical GmbHZ1012H
Table Top Research Anästhesiegerät mit O2-Spülung und einem Sevofluran-VerdampferParkland ScientificV3000PS/PK
UltraMicro Pumpe mit Micro4 ControllerWorld Precision InstrumentsUMP3-4Ausrüstung für hochgradig kontrollierte orthotope
Injektion Fußschalter für SYS-Micro4 ControllerWorld Precision Instruments15867Ausrüstung für hochgradig kontrollierte orthotope
Injektion Dreiachsiger manueller MikromanipulatorWorld Precision InstrumentsM325Ausrüstung für hochgradig kontrollierte orthotope
Injektion Magnetständer für MikromanipulatorenWorld Precision InstrumentsM10Ausrüstung für hochgradig kontrollierte orthotope Injektion
Stahlgrundplatte für M10 MagnetständerWorld Precision Instruments5479Ausrüstung für hochgradig kontrollierte orthotope
Injektion Hot Plate 062Labotect13854
Isis - HaarrasiererAESCULAP -Braun-Binokulares
OperationsmikroskopParkland ScientificVS-2Z
NameCompanyKatalognummerKommentare
CTC isolation
EDTARoth8040.1
Dichtegradient mittel – FicollStemCell - Lymphoprep7801
Alexa Fluor 488 Anti-Human-CD326 (EpCAM) Antikörper-Klon 9C4BioLegend324210
Alexa Fluor 488 Anti-Maus CD326 (EpCAM) Antikörper-Klon G8.8BioLegend118210
Petrischale, ø 60 x 15 mm, 21 cm², VentGreiner bio-one628102
Fluoreszenz-ZellkulturmikroskopLeica
Transferman 4r MikromanipulatorEppendorf
CellTram AirEppendorfAspirationspumpe verbunden mit dem Mikromanipulator
Dmz Universal Microelectrode PullerDagan Corporationbenötigt für die Herstellung von Mikrokapillaren für die Einzelzellaspiration
Prism GlaskapillarenDagan Corporation
PAP penAbcamab2601
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineLife Technologies GmbH14190169Picking-Puffer
Fetales Kälberserum (FCS)BIOCHROM AGS 0115Picking-Puffer
Penicillin/Streptomycin (PenStrep)Life Technologies GmbH15140122Picking-Puffer
EDTARoth8040.1picking buffer
NameCompanyKatalognummerKommentare
>Immunhistochemie
Aufgereinigter anti-humaner CD326 (EpCAM) Antikörper-Klon 9C4BioLegend324201EpCAM Immunhistochemie (vgl. Abb. 2C)
HRP Kaninchen Anti-Maus IgGAbcamab97046EpCAM Immunhistochemie (cf, Abb. 2C)
dünn GmbH-Buprenorphin

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2016. CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).
  2. Weitz, J., Koch, M., Debus, J., Höhler, T., Galle, P. R., Büchler, M. W. Colorectal cancer. Lancet. 365 (9454), 153-165 (2005).
  3. Schölch, S., et al. Circulating tumor cells of colorectal cancer. Cancer Cell Microenviron. 1 (5), (2014).
  4. Steinert, G., Schölch, S., Koch, M., Weitz, J. Biology and significance of circulating and disseminated tumour cells in colorectal cancer. Langenbecks Arch Surg. 397 (4), 535-542 (2012).
  5. Bork, U., et al. Prognostic relevance of minimal residual disease in colorectal cancer. World J Gastroenterol. 20 (30), 10296-10304 (2014).
  6. Bork, U., et al. Circulating tumour cells and outcome in non-metastatic colorectal cancer: a prospective study. Br J Cancer. 112 (8), 1306-1313 (2015).
  7. Rahbari, N. N., et al. Compartmental differences of circulating tumor cells in colorectal cancer. Ann Surg Oncol. 19 (7), 2195-2202 (2012).
  8. Rahbari, N. N., et al. Metastatic Spread Emerging From Liver Metastases of Colorectal Cancer: Does the Seed Leave the Soil Again? Ann Surg. 263 (2), 345-352 (2016).
  9. Rahbari, N. N., et al. Meta-analysis shows that detection of circulating tumor cells indicates poor prognosis in patients with colorectal cancer. Gastroenterology. 138 (5), 1714-1726 (2010).
  10. Steinert, G., et al. Immune Escape and Survival Mechanisms in Circulating Tumor Cells of Colorectal Cancer. Cancer Res. 74 (6), 1694-1704 (2014).
  11. Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
  12. Roper, J., Hung, K. E. Priceless GEMMs: genetically engineered mouse models for colorectal cancer drug development. Trends Pharmacol Sci. 33 (8), 449-455 (2012).
  13. Schölch, S., et al. Radiotherapy combined with TLR7/8 activation induces strong immune responses against gastrointestinal tumors. Oncotarget. 6 (7), 4663-4676 (2015).
  14. Schölch, S., Rauber, C., Weitz, J., Koch, M., Huber, P. E. TLR activation and ionizing radiation induce strong immune responses against multiple tumor entities. Oncoimmunology. 4 (11), e1042201(2015).
  15. Schölch, S., et al. Circulating tumor cells exhibit stem cell characteristics in an orthotopic mouse model of colorectal cancer. Oncotarget. 7 (19), 27232-27242 (2016).
  16. Nanduri, L. K., García, S., Weitz, J., Schölch, S. Mouse Models of Colorectal Cancer-Derived Circulating Tumor Cells. Med Chem (Los Angeles). 6 (7), 497-499 (2016).
  17. van Noort, V., et al. Novel Drug Candidates for the Treatment of Metastatic Colorectal Cancer through Global Inverse Gene-Expression Profiling. Cancer Res. 74 (20), 5690-5699 (2014).
  18. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  19. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  20. Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
  21. Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  22. Simon, M. M., et al. A comparative phenotypic and genomic analysis of C57BL/6J and C57BL/6N mouse strains. Genome Biol. 14 (7), R82(2013).
  23. Kalish, S., et al. C57BL/6N Mice Are More Resistant to Ehrlich Ascites Tumors Than C57BL/6J Mice: The Role of Macrophage Nitric Oxide. Med Sci Monit Basic Res. 21, 235-240 (2015).
  24. Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. Orthotopic mouse model of colorectal cancer. J Vis Exp. (10), e484(2007).
  25. Roper, J., et al. Combination PI3K/MEK inhibition promotes tumor apoptosis and regression in PIK3CA wild-type, KRAS mutant colorectal cancer. Cancer Lett. 347 (2), 204-211 (2014).
  26. Coffee, E. M., et al. Concomitant BRAF and PI3K/mTOR blockade is required for effective treatment of BRAF(V600E) colorectal cancer. Clin Cancer Res. 19 (10), 2688-2698 (2013).
  27. Belmont, P. J., et al. Resistance to dual blockade of the kinases PI3K and mTOR in KRAS-mutant colorectal cancer models results in combined sensitivity to inhibition of the receptor tyrosine kinase EGFR. Sci Signal. 7 (351), ra107(2014).
  28. Hung, K. E., et al. Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (4), 1565-1570 (2010).
  29. Wang, F., Johnson, R. L., Snyder, P. W., DeSmet, M. L., Fleet, J. C. An Inducible, Large-Intestine-Specific Transgenic Mouse Model for Colitis and Colitis-Induced Colon Cancer Research. Dig Dis Sci. 61 (4), 1069-1079 (2016).
  30. Xue, Y., Johnson, R., Desmet, M., Snyder, P. W., Fleet, J. C. Generation of a transgenic mouse for colorectal cancer research with intestinal cre expression limited to the large intestine. Mol Cancer Res. 8 (8), 1095-1104 (2010).
  31. Tetteh, P. W., et al. Generation of an inducible colon-specific Cre enzyme mouse line for colon cancer research. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (42), 11859-11864 (2016).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Injektion von TumorzellenZ kuminjektionDichtegradientenzentrifugationCTC Isolierungchirurgische TechnikTumormetastase

Verwandte Artikel