Wir beschreiben die Etablierung von orthotopen kolorektalen Tumoren durch Injektion von Tumorzellen oder Organoiden in den Cecum von Mäusen und die anschließende Isolierung von zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) aus diesem Modell.
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Methodenartikel
Isolierung von zirkulierenden Tumorzellen in einem orthotopischen Mausmodell des Darmkrebses
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Trotz der Vorteile der einfachen Anwendbarkeit und der Kostenwirksamkeit haben subkutane Mausmodelle schwere Einschränkungen und simulieren die Tumorbiologie und die Verbreitung von Tumorzellen nicht genau. Orthotopische Mausmodelle wurden eingeführt, um diese Einschränkungen zu überwinden; Allerdings sind solche Modelle technisch anspruchsvoll, vor allem in Hohlorganen wie dem Dickdarm. Um einheitliche Tumore zu erzeugen, die zuverlässig wachsen und metastasieren, sind standardisierte Techniken der Tumorzellpräparation und Injektion kritisch.
Wir haben ein orthotopisches Mausmodell von Darmkrebs (CRC) entwickelt, das hochgradig einheitliche Tumore entwickelt und für Tumorbiologie-Studien sowie therapeutische Studien eingesetzt werden kann. Tumorzellen aus Primärtumoren, 2-dimensionalen (2D) Zelllinien oder dreidimensionalen (3D) Organoiden werden in den Cecum injiziert und bilden je nach metastatischem Potential der injizierten Tumorzellen hochmetastatische Tumore. In Ergänzung,CTCs können regelmäßig gefunden werden. Wir beschreiben hier die Technik der Tumorzellpräparation sowohl aus 2D-Zelllinien als auch aus 3D-Organoiden sowie primärem Tumorgewebe, chirurgischen und Injektionstechniken sowie der Isolierung von CTCs aus den tumortragenden Mäusen und präsentieren Tipps zur Fehlersuche.
Einleitung
Darmkrebs (CRC) ist eine der häufigsten Ursachen für Krebs Tod in den westlichen Ländern. 1 Während der Primärtumor oft reseziert werden kann, verschlechtert das Auftreten von entfernten Metastasen die Prognose drastisch und führt oft zum Tod. 2 , 3 Das biologische Korrelat der Metastase ist zirkulierende Tumorzellen (CTCs), die sich vom Tumor lösen, im Kreislauf überleben, an das Epithel im Zielorgan anschließen, in das Organ eindringen und schließlich zu neuen Läsionen übergehen. 4 Obwohl CTCs bekanntermaßen von prognostischer Relevanz sind, ....
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Protokoll
Die hier vorgestellten Tierversuche wurden unabhängig von einem institutionellen und einem staatlichen Tierpflege- und -nutzungsausschuss unabhängig überprüft und zugelassen und wurden nach den Richtlinien der Föderation der Laboratoriums-Tierwissenschaften (FELASA) durchgeführt. Alle möglichen Maßnahmen wurden ergriffen, um Leiden einschließlich Anästhesie und Analgesie oder, wenn nötig, vorzeitige Sterbehilfe zu minimieren.
1. Vorbereitung von Zellen und Organoiden
HINWEIS: Verwenden Sie für jede Injektion ein Volumen von 20 μl mit 100.000 Zellen. Verwenden Sie die Basismembranmatrix (BMM), um Leckage....
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Ergebnisse
Die erfolgreiche und reproduzierbare Erzeugung von kolorektalen Tumoren in diesem Modell hängt entscheidend von der genauen Injektion der Zellen ohne Verschütten oder Lecken ab. Wenn dies erreicht wird, ist dieses Modell äußerst zuverlässig und führt selten zu einer künstlichen peritonealen Verbreitung. Die Wachstumskinetik der Tumore sowie deren Verbreitungsmuster hängen von der Biologie der verwendeten Organoide und Zellen ab. 15 Während HCT116-Zellen in diesem .......
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Diskussion
Trotz ihrer präklinisch bewährten Aktivität bei subkutanen Mausmodellen scheitert die große Mehrheit der neuartigen Verbindungen in klinischen Studien und erreicht niemals die Klinik. 11 Diese offensichtliche Insuffizienz von subkutanen Mausmodellen zur genauen Simulation der Biologie und Wachstumsmuster von Tumoren hat zur Entwicklung von orthotopischen Mausmodellen geführt, die auf der Injektion von Tumorzellen direkt in das ursprüngliche Organ basieren.
Orthotopisc.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von der deutschen Forschungsstiftung (WE 3548 / 4-1) und der Roland-Ernst-Stiftung für Gesundheitswesen (1/14) unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Zellkulturmedien und -komponenten | |||
| Advanced DMEM F12 | Invitrogen | 12634010 | DMEM/ F12 +++ medium |
| HEPES (1 M) | Life Technologies GmbH | 15630056 | DMEM/ F12 +++ medium |
| Glutamax-I Supplement (200 mM) | Life Technologies GmbH | 35050038 | DMEM/ F12 +++ medium |
| Penicillin/ Streptomycin (PenStrep) | Life Technologies GmbH | 15140122 | DMEM/ F12 +++ Medium |
| DMEM | Life Technologies GmbH | 61965026 | Basismedium von 2D-Zelllinien (DMEM/10% FCS) |
| Fötales Kälberserum (FCS) | BIOCHROM AG | S 0115 | Basismedium von 2D-Zelllinien (DMEM/10% FCS) |
| TrypLE Express enzymatischer Dissoziationspuffer | Life Technologies GmbH | 12604021 | |
| Matrigel Basalmembran-Matrix (BMM, phenolrotfrei) | CORNING B.V. Life Sciences | 356231 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
| Trypsin-EDTA (0,25%, phenol-rot) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
| 6-/48-Well-Platten mit Deckel | CORNING | 3516/3548 | |
| Zellkulturkolben 75 cm², 250 mL | VWR International GmbH | 734-2066 | |
| Zellkulturflasche 150 cm², 600 mL | Corning B.V. Life Sciences | 355001 | |
| Eppendorf Röhrchen 1,5 mL / 2 mL | Sarstedt AG & Co. KG | 72.706.400/ 72.695.400 | |
| 15 mL, 50 mL Zentrifugenröhrchen | Greiner-Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
| TC10 Zählobjektträger (für TC20 Zählmaschine) | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1450016 | |
| Pasteurpipetten (Glas, 150 mm) | Fisher Scientific GmbH | 11546963/ FB50251 | gezogen mit einem Bunsenbrenner |
| schonender MACS Dissoziator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | für die Aufbereitung von Primärtumorgewebe |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | für die Aufbereitung von Primärtumorgewebe |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | für die Präparation von Primärtumorgewebe |
| Dissoziationskit für humane Tumore | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | für die Präparation |
| von PrimärtumorgewebeFalcon 70 & Mikro; m Cell | Strainer Corning B.V. Life Sciences | 352350 | für die Präparation von Primärtumorgewebe |
| Name | <>Company< | strong>Katalognummer | ><>Kommentare |
| Chirurgische Ausrüstung | |||
| Sevofluran | AbbVie Germany GmbH & Co. | KG-Medical | |
| oxygen | Air Liquide Medical | ||
| Temgesic-Bepanthen | |||
| - Augensalbe | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
| Normale Kochsalzlösung 0,9% (E154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
| Aqua ad injectabilia | Braun | 235144 | |
| 1 mL Spritze (ohne Totvolumen) - Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
| 30G Injektionsnadel | BECTON DICKINSON | 304000 | |
| Zellulosetupfer | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
| Micro-Adson Pinzette | FST - Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Irisschere - ToughCut | FST - Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Olsen-Hegar Nadelhalter | FST - Fine Science Tools | 12002-12 | |
| AutoClip Kit | FST - Fine Science Tools | 12020-00 | |
| PDS Z1012H 6/0 C1 (chirurgisch) Naht) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
| Table Top Research Anästhesiegerät mit O2-Spülung und einem Sevofluran-Verdampfer | Parkland Scientific | V3000PS/PK | |
| UltraMicro Pumpe mit Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-4 | Ausrüstung für hochgradig kontrollierte orthotope |
| Injektion Fußschalter für SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | 15867 | Ausrüstung für hochgradig kontrollierte orthotope |
| Injektion Dreiachsiger manueller Mikromanipulator | World Precision Instruments | M325 | Ausrüstung für hochgradig kontrollierte orthotope |
| Injektion Magnetständer für Mikromanipulatoren | World Precision Instruments | M10 | Ausrüstung für hochgradig kontrollierte orthotope Injektion |
| Stahlgrundplatte für M10 Magnetständer | World Precision Instruments | 5479 | Ausrüstung für hochgradig kontrollierte orthotope |
| Injektion Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
| Isis - Haarrasierer | AESCULAP - | Braun-Binokulares | |
| Operationsmikroskop | Parkland Scientific | VS-2Z | |
| Name | Company | Katalognummer | Kommentare |
| CTC isolation | |||
| EDTA | Roth | 8040.1 | |
| Dichtegradient mittel – Ficoll | StemCell - Lymphoprep | 7801 | |
| Alexa Fluor 488 Anti-Human-CD326 (EpCAM) Antikörper-Klon 9C4 | BioLegend | 324210 | |
| Alexa Fluor 488 Anti-Maus CD326 (EpCAM) Antikörper-Klon G8.8 | BioLegend | 118210 | |
| Petrischale, ø 60 x 15 mm, 21 cm², Vent | Greiner bio-one | 628102 | |
| Fluoreszenz-Zellkulturmikroskop | Leica | ||
| Transferman 4r Mikromanipulator | Eppendorf | ||
| CellTram Air | Eppendorf | Aspirationspumpe verbunden mit dem Mikromanipulator | |
| Dmz Universal Microelectrode Puller | Dagan Corporation | benötigt für die Herstellung von Mikrokapillaren für die Einzelzellaspiration | |
| Prism Glaskapillaren | Dagan Corporation | ||
| PAP pen | Abcam | ab2601 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | Picking-Puffer |
| Fetales Kälberserum (FCS) | BIOCHROM AG | S 0115 | Picking-Puffer |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Life Technologies GmbH | 15140122 | Picking-Puffer |
| EDTA | Roth | 8040.1 | picking buffer |
| Name | Company | Katalognummer | Kommentare |
| >Immunhistochemie | |||
| Aufgereinigter anti-humaner CD326 (EpCAM) Antikörper-Klon 9C4 | BioLegend | 324201 | EpCAM Immunhistochemie (vgl. Abb. 2C) |
| HRP Kaninchen Anti-Maus IgG | Abcam | ab97046 | EpCAM Immunhistochemie (cf, Abb. 2C) |
Referenzen
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2016. CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).
- Weitz, J., Koch, M., Debus, J., Höhler, T., Galle, P. R., Büchler, M. W. Colorectal cancer. Lancet. 365 (9454), 153-165 (2005).
- Schölch, S., et al. Circulating tumor cells of colorectal cancer. Cancer Cell Microenviron. 1 (5), (2014).
- ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
