Hier präsentieren wir ein Protokoll Mikroglia aus postnataler Maus Welpen (Tag 1) für in - vitro - Experimente zu isolieren. Diese improvisierte Isolierungsmethode erzeugt sowohl hohe Ausbeute und Reinheit, einen bedeutenden Vorteil gegenüber alternativen Methoden, die für die Zwecke der Erläuterung Mikroglia biology breites Spektrum Experimente ermöglicht.
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Methodenartikel
Schnelle und Refined CD11b Magnetic Isolierung von primären Mikroglia mit erhöhter Reinheit und Vielseitigkeit
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Mikroglia sind die primären Responder auf Zentralnervensystem Beschimpfungen; bleibt jedoch viel Unbekanntes über ihre Rolle bei der Regulierung der neuroinflammation. Mikroglia sind mesodermalen Zellen, die in der Vermessung entzündliche Stress ähnlich wie Makrophagen funktionieren. Der klassische (M1-Typ) und alternativer (M2-Typ) Aktivierungen von Makrophagen haben auch Mikroglia in dem Bemühen, erweitern das darunter liegende Zusammenspiel dieser Phänotypen haben in neuroinflammatorische Bedingungen wie Parkinson, Alzheimer und Huntington-Erkrankungen besser zu verstehen. In - vitro - Experimente unter Verwendung von primären Mikroglia bieten schnelle und zuverlässige Ergebnisse , die auf die in - vivo - Umgebung erweitert werden können. Obwohl dies ein klarer Vorteil gegenüber in vivo Experimenten Mikroglia zu isolieren , während eine adäquate Ausbeuten optimale Reinheit zu erreichen eine Herausforderung gewesen. Gängige Methoden zur Zeit in Gebrauch entweder leiden unter niedriger Erholung, geringe Reinheit, oder beides. Wir berichten hier über DMonstrate eine Verfeinerung der säulenfreien CD11b magnetischen Trennverfahren, die eine hohe Zellgewinnung und eine verbesserte Reinheit in der Hälfte der Menge an Zeit erreicht. Wir schlagen vor, diese optimierte Methode als sehr nützliches Modell der primären Mikroglia-Isolierung für die Zwecke der neuroinflammation und Neurodegeneration zu studieren.
Einleitung
Mikroglia sind Myb unabhängige Makrophagen mesodermalen Ursprungs, die von c-kit + / CD45- unterscheiden erythromyeloid Vorläufern in den Blutinseln des Dottersacks 1, 2. Sobald embryologischen Mikroglia das zentrale Nervensystem (ZNS) kolonisiert haben, Übergangs- sie von einer zu einer verästelten amoeboid Form 3. Diese Erwachsenen Mikroglia als surveillant klassifiziert , da ihre dynamische Verzweigungen das gesunde Hirnparenchyms für mögliche Beleidigungen Sonde 4. Obwohl nur Mikroglia auf etwa 10% der Bevölkerung CNS Zelle beitragen, ihre Fähigkeit , untere....
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Protokoll
Die Verwendung der Tiere und Protokollverfahren genehmigt und überwacht von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der Iowa State University (Ames, IA, USA)
1. Anbau von Mixed Gliakulturen
- Köpfen 1- 2 Tage alten Welpen schnell mit 5,5-Zoll-Betriebs Schere, und legen die Köpfe sofort in ein 50 ml Röhrchen auf Eis. Beachten Sie, dass diese Enthauptung der Modus der Euthanasie ist.
- In einer laminaren Luftstrom Haube, macht einen kleinen Schnitt in dem Schädel und Hirnhaut mit 4,5 Zoll gerade Mikro-Dissektionsscheren. Beginnen vom Schwanzende zum rostralen Ende Schneiden (Nase). Holen ....
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Ergebnisse
Mikroglia isoliert CD11b Positive Selection Kit II hohe Reinheit
Primäre Maus Mikroglia wurden unter Verwendung des oben genannten Protokolls isoliert und ausplattiert auf Poly-D-Lysin-beschichtete Deckgläser, die Reinheit der Isolation zu prüfen. Zehntausend Zellen wurden pro Napf und immunzytochemische Analyse ausplattiert wurde mit ionisiertem Calcium bindende Adaptormolekül 1 durchgeführt (Iba1) als Marker für Mikroglia und g.......
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Diskussion
Ältere Mikroglia-Isolationsmethoden haben begrenzte Wiederherstellungen, die nicht geeignet sind für verschiedenes Protein durch Western-Blot-Analysen und RNA-Analysen durch qRT-PCR. Die differentielle Adhärenz und milde Trypsinisierung Methoden sind zwei gemeinsame Ansätze mit niedrigeren Ausbeuten Mikroglia 13, 14, 15. Die Säule basierte CD11b Ansatz hat auch eine geringe Erholung, aber erreicht eine höhere Reinheit als diffe.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
NS088206 und ES026892: Diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health (NIH) Grants unterstützt. Die W. Eugene und Linda Lloyd Stiftungslehrstuhl an AGK und Deans Professur AK werden hiermit anerkannt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| EasySep CD11b Separation Kit II | StemCell Technologies | 18970 | |
| EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1x) | Life Technologies | 11330057 | |
| Natriumpyruvat | Life Technologies | 11360070 | |
| MEM Nicht-essentielle Aminosäuren (100x) | Life Technologies | 11140050 | |
| L-Glutamin (100x) | Life Technologies | 25030081 | |
| EDTA | Fisher Scientific | AM9260G | |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Sigma | 13H469 | |
| 0,25% Trypsin-EDTA | Gibco von Life Technologies | 25200 | |
| Dulbecco's PBS (DPBS) | Gibco von Life Technologies | 14190250 |
Referenzen
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Prinz, M., Priller, J. Microglia and brain macrophages in the molecular age: from origin to neuropsychiatric d....
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Nachdrucke und Genehmigungen
