Sequentielle Salz Extraktionen für die Analyse von Bulk-Chromatin bindenden Eigenschaften von Chromatin komplexe ändern

Summary

Sequentielle Salzgewinnung gebunden Chromatin Proteine ist ein nützliches Werkzeug für die Bestimmung der Bindungseigenschaften von großen Proteinkomplexen. Diese Methode kann verwendet werden, um die Rolle der einzelnen Untereinheiten oder Domänen in die allgemeine Affinität von einem Proteinkomplex, bulk-Chromatin zu bewerten.

Abstract

Aufklärung der Bindungseigenschaften von Chromatin-targeting Proteinen kann aufgrund der komplexen Natur des Chromatins und der heterogenen Natur der meisten Säugetiere Chromatin-modifizierende komplexe sehr anspruchsvoll sein. Um diese Hürden zu überwinden, haben wir einen sequenzielle Salzgewinnung (SSE) Assay für die Bewertung der relativen verbindliche Affinitäten der Chromatin-gebundene komplexe angepasst. Dieser Assay einfach und unkompliziert einsetzbar von nicht-Experten bewerten die relative Differenz verbindliche Affinität von zwei verwandte komplexe, die Veränderungen in Affinität eines Komplexes als eine Untereinheit verloren ist oder eine einzelnen Domäne wird inaktiviert und die Veränderung der Bindungsaffinität nach Veränderungen der Chromatin-Landschaft. Durch das nacheinander wieder aufhängen Bulk Chromatin in steigenden Mengen von Salz, können wir die Elution eines bestimmten Proteins aus Chromatin Profil. Diese Profile können wir bestimmen, wie Änderungen in einem Chromatin-modifizierende komplex oder Änderungen an der Chromatin-Umwelt bindender Wechselwirkungen auswirken. Kupplung SSE mit anderen Tests in Vitro und in Vivo , bestimmen wir die Rollen der einzelnen Domänen und Proteinen auf die Funktionalität eines Komplexes in einer Vielzahl von Chromatin-Umgebungen.

Introduction

DNA-Verordnung in eukaryotischen Zellen ist eine komplizierte und anspruchsvolle System, die durch ein Sortiment von Proteinen hochstrukturiert ist, die Antworten auf die intrazelluläre und extrazelluläre Stimuli zu koordinieren. DNA ist Histon Octamers zur Form Nukleosomen, gewickelt, lose verteilt entlang DNA oder in engen Spulen¹verdichtet werden können. Diese strukturelle Anordnung der DNA und Histonen bekannt als Chromatin, die durch ein Netz von Proteinen, die lesen, schreiben und löschen Post translationale Modifikationen (PTM) auf Histone²geregelt ist. Einige Histon PTMs, wie Acetylierung, ändern die Ladung der Aminosäure, die sie auf, abgelagert werden Wechselwirkungen zwischen Histonen und DNA-²zu verändern. Histon-PTMs dienen auch zur transkriptionellen Regulierungsbehörden, Chromatin Remodelers, DNA-Schäden reparieren Maschinen und DNA-Replikation Maschinen auf bestimmte Regionen des Genoms³zu rekrutieren.

Die meisten Methoden zur Untersuchung Chromatin Wechselwirkungen Sonde kleinen Interaktionen oder große genomweite Analysen beinhalten. In Vitro Bindung Studien nutzen oft einzelne rekombinante Domains mit Histon-Peptide oder DNA in Tests wie Elektrophorese Mobilität Verschiebung Assays (EMSA), Isotherm Titration Kalorimetrie, Fluoreszenz-Polarisation und Peptid Pulldowns. Da diese Tests in der Regel auf eine einzelne Protein-Domäne konzentrieren, sie erleichtern das Verständnis von einem kleinen Stück des Puzzles, aber lassen Sie sich nicht uns zu verstehen, die kooperative Art der multidomain Proteine, geschweige denn ihre Rolle in Multi-protein -komplexe. Eine weitere Schicht der Komplexität wird durch die heterogene Zusammensetzung der meisten Säugetiere Chromatin-modifizierende komplexe hinzugefügt. Diese Heterogenität Protein macht in Kombination mit der dynamischen Natur der Chromatin-Landschaft, eine Herausforderung, um die in Vivo an Chromatin in VitroInteraktionen der Chromatin Proteine binden zu rekapitulieren.

In-Vivo -Methoden haben bedeutende Fortschritte gemacht; Allerdings sind sie oft teuer, zeitaufwendig und technisch anspruchsvoll. Chromatin Immunopräzipitation gefolgt durch Sequenzierung (ChIP-Seq) ist sehr nützlich für die Bestimmung der Lokalisierung von Proteinen und Histon-Modifikationen in das Genom, aber es erhebliche Optimierung^{4 erfordert}. Proteine sind oft vernetzt, Chromatin, Interaktionen zu bewahren; Allerdings können künstliche Interaktionen produzieren und kann dazu führen, dass Epitop Maskierung⁵. Darüber hinaus erfordern die Immunperoxidase (IP) hochspezifische Antikörper und umfassende Optimierung von DNA zu scheren und IP-Bedingungen von ChIP-qPCR mit einer bekannten Bindungsstelle, die oft nicht verfügbar- a-prioriist. Nach der Optimierung von ChIP Bedingungen Verarbeitung der Proben ist aufwändig und erfordert mehrere Wochen bis Monate, zu sequenzieren und analysieren. Obwohl dieses Verfahren von unschätzbarem Wert für die Ermittlung der Lokalisierung von Chromatin Proteine gebunden über das Genom, die Kosten und Zeitaufwand machen es unerschwinglich zur Verwendung dieser Methode zum Generieren von Hypothesen darüber, wie kleine Veränderungen globalen Bindungseigenschaften beeinflussen kann .

In diesem Artikel beschreiben wir wie ein sequentielle Salzgewinnung (SSE) Assay verwendet werden kann, global verbindliche Profile von Chromatin-gebundene Proteine untersuchen und unterscheiden, wie Änderungen in einem Protein, komplexe oder globale PTM Profil Interaktionen verändern können. Obwohl Salz Extraktionen allgemein und allgemein verwendete Technik sind, zeigen wir, wie diese sequenziellen Methode äußerst reproduzierbare und vielseitig ist. SSE erlaubt uns zu charakterisieren, wie eine einzelne Untereinheit eines Komplexes oder sogar einer einzelnen Domäne, die Anlage insgesamt Affinität für Schüttgut Chromatin beiträgt. SSE kann auch verwendet werden, um festzustellen, ob die Bindung eines Proteins ist beeinflusst durch Änderungen im Chromatin Landschaft, bietet interessante Hypothesen für Histon Mark targeting, die mittels ChIP-Seq und andere Genom breite Studien bestätigt werden können.

Wir ursprünglich diese Methode von Wu Et Al., prüfen der Funktion des Polybromo1 angepasst (PBRM1) in der Bindung der PBAF Chromatin Fertighausbau^6,7. Mit dieser Technik, wir die Rolle des PBRM1 für Chromatin Bindung innerhalb der PBAF Chromatin Umbau komplexer und dann bestimmt den relative Beitrag der sechs einzelnen Bromodomänen zu dieser Funktion⁷.

Hier beschreiben wir wie Sie diese Methode, um Chromatin Bindung in verschiedene Zelltypen zu beurteilen, die relative Bindungsaffinität von ähnlichen Chromatin bearbeiten komplexe, untersuchen die Verschiebung eines Proteins aus Chromatin durch einen chemischen Inhibitors erkunden zu optimieren und Ermittlung die Auswirkungen von Chromatin Bindung nach Veränderungen der Chromatin-Landschaft.

Protocol

1. Vorbereitungen

1. vorbereiten 100 mL Hypotonische Lösung Puffer A: 0,3 M Saccharose, 60 mM KCl, 60 mM Tris pH 8.0, 2 mM EDTA, und 0,5 % NP-40. Bei 4 º c.
   Hinweis: Einige Zelllinien, wie HEK293T, erfordern weniger strenge Lysiereinrichtung Auflagen. Wenn Kerne leicht lösen, benutzen Sie geändert Puffer A: 25 mM HEPES pH 7.6, 25 mM KCl, 5 mM MgCl ₂, 0,05 mM EDTA 0,1 % NP-40 und 10 % Glycerin.
2. Bereiten eine 250 mL Stammlösung 2 X mRIPA Lösung: 100 mM Tris pH 8.0, 2 % NP-40 und 0,5 % Natrium-Deoxycholate.
3. Bereiten eine 100 mL Stammlösung 5 M NaCl.
4. Mit 2 X mRIPA und 5 M NaCl-Lösungen, 50 mL 1 X mRIPA-Lösung für jede der sechs Salzkonzentrationen vorbereiten: 0 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM und 500 mM NaCl. Vor Beginn des Experiments, alle Lösungen auf Ice cool
5. Grow Zellinien gewünschten Bedingungen.
   Hinweis: Wenn Sie die Auswirkungen der umzuwerfen eines Proteins zu bestimmen, muss SSE für die Knockdown Linie mit Wildtyp-Zellen verglichen werden. Diese SSE muss nebeneinander durchgeführt werden. Für Beispiele für die Verwendung von chemischen Inhibitoren oder Reize, siehe Abschnitte 3-5.

2. Grundlegenden sequenzielle Salzgewinnung

1. Ernte 8 Millionen Zellen der einzelnen Zustand und zweimal mit 5 mL Eis kaltem PBS waschen.
   Hinweis: Es ist entscheidend für die gleiche Anzahl von Zellen zu entsprechenden Proteinkonzentrationen haben. Die genaue Anzahl der Zellen müssen für die einzelnen Zell-Linien oder bestimmte Proteine optimiert werden. Es ist wichtig, nicht zu viele, da der Anstieg der Proteinkonzentrationen Beobachtung der Elution Kurve, verhindert das Gleichgewicht Bindung abhängt. Jedoch mit zu wenig Zellen möglicherweise nicht genügend Protein um die Kurve zu erkennen und das Chromatin-Pellet ist schwieriger zu isolieren und verloren zwischen Brüchen.
2. Wieder aussetzen Zellen in 1 mL Puffer A + Protease-Inhibitoren, transfer in 1,5 mL Mikro-Zentrifuge Röhren und drehen oben über Boden bei 4 ° c für 10 min.
3. Isolieren die Kerne durch Zentrifugation bei 6000 X g für 5 min bei 4 ° c.
   Hinweis: Nach diesem Schritt sollte die Kernhülle noch intakt sein. Wenn die Kernhülle intakt ist, wird das Pellet vollständig neu aussetzen; jedoch wird wenn der Umschlag lysiert und das Chromatin wird freigegeben, das Pellet nicht erneut aussetzen. Wenn die Kernhülle nach Puffer A Inkubation nicht intakt ist, verwenden Sie modifiziert Puffer A.
4. Fügen Sie 200 µL mRIPA 0 mM NaCl + Protease-Inhibitoren, jedes Kerne Pellet vor Aussetzung neu Pellet. 15-Mal mit einer 1-mL-Pipette pipettieren, um jede Probe zu homogenisieren. Das Pellet sollten leicht wieder auszusetzen, jedoch wird die Kerne lösen, wie es Pipettieren ist und die Probe wird dick und klebrig und schwer zu pipette.
   1. Um das Pellet in der Spitze aufzustellen, tippen am Ende die Pipettenspitze gegen die Unterseite des die Zentrifugenröhrchen. Das Pellet wird nicht vollständig auflösen, sobald die DNA wird aus den Kernen entlassen, aber Pipettieren bricht es auf
5. Wenn alle Proben homogenisiert worden sind, brüten die Proben auf Eis für 3 min.
   Hinweis: Die Inkubationszeit kann je nach Protein des Interesses optimiert werden müssen.
6. Isolieren Chromatin Pellet durch Zentrifugieren die Proben für 3 min bei 6500 X g bei 4 º c.
7. Transfer überstand zu einer Zentrifuge sauber 1,5 mL Tube. Dies wird die Fraktion 0 mM sein. Diese 0 mM mRIPA Lösung kann fungieren als ein Waschschritt zur Lyse der Kerne und entfernen Sie alle losen Proteine nicht im Zusammenhang mit Chromatin.
8. Fügen Sie 200 µL mRIPA 100 mM NaCl + Protease-Inhibitoren, jedes Chromatin Pellet vor Aussetzung neu Pellet. Unterteilen Sie das Chromatin Pellet durch pipettieren die Kugel nach oben und unten 15 Mal.
   Hinweis: Es ist entscheidend für die Anzahl der Wiederholungen entsprechen die Pellet in pipettiert.
9. Inkubation für 3 min auf Eis. Diese Inkubationsschritt kann alle Proben einen Gleichgewichtszustand zu erreichen, was besonders wichtig ist, gibt es mehrere Proben.
10. Zentrifuge bei 6500 X g für 3 min bei 4 ° c und Übertragung Überstand auf eine saubere 1,5 mL-Tube.
11. Wiederholen Sie 2,6-2.10 für die verbleibenden Salzkonzentrationen.
    Hinweis: Nach 400 mM NaCl, mRIPA das Pellet sollte klar und glitschige und bleibe nicht am Boden des Röhrchens. Das Pellet in den Deckel des Zentrifugenröhrchen während des Überstands isoliert platziert werden kann.
12. Hinzufügen 70 µL 4 x Protein laden färben, jede Fraktion und laden Sie 30 µL der einzelnen Fraktionen auf ein SDS-Acrylamid-Gel für die western-Blot Analyse.
    Hinweis: Um das verbindliche Profil des Proteins zu bestimmen, ist es wichtig, entsprechende Mengen an lysate, anstatt be-gleich Proteinkonzentrationen laden.
13. Führen Sie eine standard-western-Blot durch die Übertragung auf eine Membran und primären Antikörper für interessierender Proteine.
14. , Das Protein aus dem Chromatin eluiert quantitate inkubieren der Blot in Infrarot-Fluoreszenz IRDye Sekundärantikörper und Bild Blot mit einem Imager. Während andere Methoden der Entwicklung verwendet werden können, empfehlen wir Fluoreszenz oder Infrarot-Bildgebung, wie es in der Natur mehr quantitative.
15. Einsatz ImageJ oder ähnliche Software zu berechnen, die Intensität für das Protein an jede Salzkonzentration eluiert. Durch die grafische Darstellung der Band Intensität gegen die Salzkonzentration, die Elution Muster von Ihr Protein des Interesses bestimmt werden kann.

3. Sequentielle Salzgewinnung in Anwesenheit von ein " Leser " Inhibitor

1. zwei Gruppen von Zellen (4 Millionen) zu ernten und isolieren die Kerne wie in einem standard SSE.
2. Wieder auszusetzen, beide in 200 µL mRIPA 0 mM NaCl und 3 min inkubieren. Dadurch wird für die Entfernung von jedem kostenlos Protein in den Kernen.
3. Fügen Sie 200 µL mRIPA 0 mM NaCl, jedes Pellet. Hinzufügen der Steuerelementsatz Inhibitor (2 µL 1 mm (+) JQ1) zu einer Probe oder DMSO.
4. Rühren die Pellets durch Pipettieren 15mal und inkubieren Sie für 5 min auf Eis
5. Zentrifuge bei 6500 X g für 3 min bei 4 ° c und Übertragung Überstand auf eine saubere 1,5 mL-Tube.
6. 3.3-4 für die Salzkonzentrationen wiederholen und führen Sie eine standard-western-Blot.

4. Sequentielle Salzgewinnung in Anwesenheit von ein " Schriftsteller " Inhibitor

1. Zellen mit dem Inhibitor (10 µM SAHA) zu behandeln oder DMSO für 3 h
2. Ernte 4 Millionen Zellen für jede Behandlung.
3. Führen ein standard SSE für die Proben mit dem Inhibitor hinzugefügt, um die Puffer.

5. Sequentielle Extraktion folgende DNA Salzschäden

1. Behandlung von Zellen mit 1 µM Doxorubicin für 1 h.
2. Wechseln Sie das Medium auf die Zellen und lassen sie wieder für 3 h.
3. 8 Millionen Zellen zu ernten, und führen Sie die grundlegenden SSE.

6. Nicht-sequenziellen Salzgewinnung

1. 12 Millionen Zellen ernten und waschen mit PBS.
2. Kluft Zellen, so dass es 2 Millionen Zellen pro Mikro Zentrifugenröhrchen.
3. Neu in 500 µL Puffer A und 10 min. inkubieren
4. Isolieren Sie die Kerne durch Zentrifugation bei 6000 X g.
5. In 200 µL der einzelnen mRIPA Puffer + NaCl pellets wieder auszusetzen.
6. Homogenisieren jede Probe durch Pipettieren 15-Mal mit einer Pipettenspitze 1 mL.
7. Inkubation auf Eis für 3 min.
8. Isolieren das Chromatin durch Zentrifugation bei 6500 X g und übertragen den Überstand um Rohre zu reinigen. Hinzufügen von 70 µL Farbstoff zu laden und ausführen 30 µL auf einem SDS-Page-Gel für die western-Blot Analyse.

Results

In diesem Beitrag zeigen wir die Vorteile und Anwendungsmöglichkeiten der häufig verwendeten sequentielle Salzgewinnung (SSE) Methode, die wir aus der Literatur⁶angepasst haben. In Abbildung 1vergleichen wir die Reproduzierbarkeit der SSE, Proteine nicht sequenziell zu kassieren, indem die Elution Muster von ARID1a und PBRM1 zu erkennen. Wir beobachten immer wieder, dass ARID1a, BAF-Untereinheit elutes in erster Linie bei 200 mM NaCl u...

Discussion

Charakterisierung von Protein und Chromatin-Interaktionen durch Salz Extraktionen ist eine gängige Methode, die beschäftigt war für Jahrzehnte^14,15; jedoch wurde es nicht systematisch vor optimiert, um den vollen Nutzen zu offenbaren. Wir zeigen, wie diese sequenziellen Methode bietet eine schnelle und kostengünstige Möglichkeit, Veränderungen im Chromatin Bindung zu unterscheiden, wenn das Protein oder die Umwelt geändert wird. SSE ist sehr anpassungsfähig und o...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Natriumchlorid, Kristall 2,5 kg AR (ACS)	Avantor/Macron	7581-06
Saccharose, Kristall 500 g AR¨ (ACS)	Avantor/Macron	8360-04
Kaliumchlorid, granuliert 500 g AR¨ (ACS)	Avantor/Macron	6858-04
Trizma(R)-Base, Primärstandard und Puffer, >=99,9% (Titration), kristallines	Sigma-Aldrich	T1503-1kg
EDTA (Ethylendinitro) Tetraessigsäure, Dinatriumsalz, Dihydrat 125 G AR (ACS)Avantor	/Macron	4931-02
NONIDET P-40 SUBSTRAT, 100mL UN3082	Amresco	E109-100ML
HEPES Puffer Lösung (1M)	Gibco	15630-080
Magnesiumchlorid, 6-Hydrat, Kristall 500 g AR¨ (ACS)	Avantor/Macron	5958-04
GLYCEROL, 1L	Amresco	0854-1L
DEOXYCHOLSÄURE NATRIUMSALZ, 100g	Amresco	0613-100G
Eppendorf Research plus Pipette	Fisher Scientific	13-690-032
Eppendorf 5424 R gekühlte Mikrozentrifuge	Eppendorf	5424 R
Sekundärmaus IgG HRP-linked	Cell Signaling	7076
Sekundäres Kaninchen-IgG HRP-linked	Cell Signaling	7074
BMI-1 Antikörper	Millipore
PBRM1 Antikörper	Bethyl	A301-591A
ARID1a Antikörper	Santa Cruz	sc-32761
BRD4 Antikörper	Bethyl	A301-9852a
(+) JQ1	Cayman Chemical Company	11187
SAHA	Cayman Chemical Company	10009929
Doxorubicin	AK Scientific	25316-40-9
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Macron	4948-02
Mini Trans-Blot Cell	BioRad	1703930
Mini Gel Tank	ThermoFisher	A25977
Albumin, rind (BSA)	Amresco	0332-100g	Wird als 5%ige Lösung in PBS-T als Blockierungslösung für Western Blots
Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x)	Life Technologies	B0001
Bolt LDS Probenpuffer (4x)	Life Technologies	B0007
PageRuler Plus vorgefärbte Proteinleiter, 10 bis 250 kDa	ThermoFisher	26619
Methyl Alkohol, wasserfreies	Macron	3041-10
Trypsin kEDTA, 1X	Cellgro	25-053-CI
, 250g UN1687	Amresco	0639-250G
NATRIUMDODECYLSULFAT (SDS)500g UN1325	Amresco	0227-500G
Glycin, für die Elektrophorese, >=99%	Sigma-Aldrich	G8898-1kg
BigTop Mikrozentrifugenröhrchen, Polypropylen	VWR	20170-333
1000 µ L Pipettenspitzen	VWR	83007-382
NuPAGE Bis-Tris Fertiggele 4-12%	Invitrogen	NW04125BOX
Leupeptin-Hemisulfat, 5 MG	RPI Forschungsprodukte	22035-0.005	Wird für Proteasehemmer-Lösungen verwendet.
APROTININ, 10 MG	RPI Forschungsprodukte	20550-0.01	Wird für Proteasehemmerlösung verwendet.
PEPSTATIN A, 5 MG	RPI Forschungsprodukte	30100-0,005	Zur Herstellung einer Proteasehemmerlösung.
OVCA429 Zellen	Geschenk von Karen Cowden Dahl, Ph.D.
HEK293T	ATCC	CRL-3216
HeLa-Zellen	ATCC	CCL-2
McCoy's 5A Medien	Corning Mediatech	10-050-CV
DMEM	Corning Mediatech	10-013-CV
Minimum Essential Medium (MEM), Pulver	Corning Mediatech	50-011-PC
MEM NEAA (100X) nicht-essentielle Aminosäure	Gibco	11140-050
FB-11: Fötales Rinderserum, USA Quelle	Omega Scientific	FB-11
Penicillin-Streptomycin-Lösung	Life Technologies	15140-122
Glutamax	Life Technologies	35050-061
Natriumpyruvat	Life Technologies	11360070
VWR Power Quelle	VWR	13-690-032