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Methodenartikel

Die Erzeugung von iPS-derived Human Brain Organoide auf Modell Frühe Störungen der neurologischen Entwicklung

20.6K Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/55372

⸱

14. April 2017

 , 
1Center for Molecular Medicine Cologne, University of Cologne, 2Institute for Biochemistry I, Medical School of University of Cologne

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Modellierung der menschlichen Gehirnentwicklung wurde aufgrund der beispiellosen Komplexität des neuronalen Epithelgewebes behindert. In dieser Arbeit wird eine Methode zur robusten Generierung von Hirnorganoiden beschrieben, um frühe Ereignisse der menschlichen Gehirnentwicklung abzugrenzen und Mikrozephalie in vitro zu modellieren.

Zusammenfassung

Die eingeschränkte Verfügbarkeit geeigneter In-vitro-Modelle, die die komplexe Entwicklung des menschlichen Gehirns zuverlässig darstellen können, ist ein erheblicher Engpass, der die Umsetzung der Hirngrundlagenforschung in die klinische Anwendung einschränkt. Während induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) die ethisch fragwürdigen humanen embryonalen Stammzellen ersetzt haben, bleiben iPSC-basierte neuronale Differenzierungsstudien auf zellulärer Ebene deskriptiv, liefern aber nicht adäquat die Details, die aus einem komplexen, menschlichen 3D-Hirngewebe abgeleitet werden könnten.

Diese Lücke wird nun durch die Anwendung von iPSC-abgeleiteten 3D-Gehirn-Organoiden gefüllt, "Gehirne in einer Schale", die viele Merkmale der komplexen menschlichen Gehirnentwicklung modellieren. Hier wird eine Methode zur Erzeugung von iPSC-abgeleiteten 3D-Hirn-Organoiden beschrieben. Die Organoide können bei der Modellierung der autosomal-rezessiven primären Mikrozephalie (MCPH) helfen, einer seltenen neurologischen Entwicklungsstörung beim Menschen. Eine weithin akzeptierte Erklärung für die Hirnfehlbildung bei MCPH ist eine Erschöpfung des neuralen Stammzellpools in den frühen Stadien der menschlichen Gehirnentwicklung, ein Entwicklungsdefekt, der in vitro schwer nachzustellen oder zu beweisen ist.

Um MCPH zu untersuchen, haben wir iPSCs aus patienteneigenen Fibroblasten erzeugt, die eine Mutation im zentrosomalen Protein CPAP tragen. Durch die Analyse der ventrikulären Zone von Mikrozephalie-3D-Hirnorganoiden konnten wir die vorzeitige Differenzierung der neuralen Vorläuferzellen zeigen. Diese 3D-Gehirnorganoide sind ein leistungsfähiges In-vitro-System, das bei der Modellierung angeborener Hirnstörungen hilfreich sein wird, die durch neurotoxische Chemikalien, neurotrophe Virusinfektionen oder vererbte genetische Mutationen induziert werden.

Einleitung

Menschliche Entwicklung des Nervenstörungen, wie Mikrozephalie, nur schlecht in Tiermodellen untersucht werden, aufgrund der Tatsache, dass das menschliche Gehirn haben eine erweiterte kortikalen Oberfläche, ein einzigartiges Merkmal der sich von nicht-menschlichen Tieren.

Dieser Aspekt macht die menschliche Entwicklung des Gehirns einen komplexen Prozess, der nicht ausreichend in einem 2D untersucht werden, in vitro Zellkultursystem. Schwellen 3D-Kulturtechniken ermöglichen die Erzeugung von gewebeähnlichen Organoide aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS). Die in - vitro - Differenzierung von pluripotenten Stammzellen in einer 3D - Suspensionskultur ermöglicht die Bildung von verschiedenen Zelltypen in einer angemessenen und regionsspezifische Weise, was zu einem organisierten, geschichteten Gewebe 1, 2, 3. Dank Laboratorien, die 3D-Kulturtechnologien Pionierarbeit geleistet und die Komplexität der Organbildung entmystifiziert, aus Stammzellen beginnen,entwickeln wir eine robuste Methode Gehirn Organoide der Erzeugung frühe Ereignisse der menschlichen Gehirn Entwicklung zu beschreiben und Mikrozephalie in vitro 1, 2, 3 zu modellieren. Es ist bemerkenswert , dass wir die ursprüngliche Methode , entwickelt von Lancaster et al angepasst. zerebrale Organoide 1 zu erzeugen. Diese Methode wurde nach unseren experimentellen Anforderungen modifiziert.

Das Ziel einer Studie von Gabriel et al. war die zellulären und molekularen Mechanismen der neuronalen Stammzell Wartung während der Entwicklung des Gehirns zu untersuchen. Um dies zu tun, wurde eine mechanistische Studie durch die Analyse von neuralen Vorläuferzellen (NSC) in 3D durchgeführt Gehirn Organoide von einem Patienten stammte Mikrocephalie 4. Dieser Patient trug eine Mutation in CPAP, ein konserviertes Protein zentrosomalen für Zentrosom Biogenese 5 erforderlich. Eine weithin akzeptierte hypoThese ist , dass Mikrocephalie das Ergebnis einer Erschöpfung des NPC - Pools ist, und dies könnte entweder zum Zelltod oder zu einem vorzeitigen Differenzierung 1, 6, 7, 8, 9 liegt.

Durch die Analyse der ventrikulären Zonen (VZs) von Mikrocephalie brain Organoiden, wurde gezeigt , dass eine beträchtliche Anzahl von NSC asymmetrischer Zellteilung zu unterziehen, im Gegensatz zu Gehirn Organoide von einem gesunden Spender stamm 4. Umfangreiche mikroskopische und biochemische Analysen von microcephalic Gehirn Organoide ergab eine unerwartete Rolle für CPAP in rechtzeitige Zilien Demontage 4. Insbesondere mutierte CPAP mit retardierten cilium Demontage- und verzögerte Zellzyklus - Wiedereintritt verbunden ist , auf die Differenzierung von vorzeitiger NSC führenden 4. Diese Ergebnisse legen nahe, eine Rolle für Zilien in Mikrozephalie und thEIR Beteiligung während der Neurogenese und Gehirngröße Kontrolle 10.

Der erste Teil dieses Protokolls ist eine Beschreibung eines dreistufigen Verfahrens homogene brain Organoiden zu erzeugen. Wie bereits erwähnt, wurde das ursprüngliche Lancaster Protokoll angepasst und modifiziert unser Ziel 1 zu entsprechen. Erstens sind menschliche iPSCs Kultur in einem definierten feeder freien Zustand auf Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Matrix. Dieser Schritt vermeidet die Variationen von Feeder-abhängigen pluripotenten Stammzellkulturen. In diesem Protokoll zur Induktion neuronaler Differenzierung zu bilden direkt von iPSCs neuralen Epithel beginnt. Durch den Embryoidkörper (EB) Bildungsschritt übersprungen, die neurale Differenzierung erfolgt in einer kontrollierteren und Weise gerichtet. Dieser Ansatz begrenzt die spontane und ungerichteten Bildung anderer Keimzellschichten, wie Mesoderm und Endoderm. Durch dieses Protokoll anwenden, können Neurosphären neuronale Rosetten enthalten am Tag geerntet werden 5 für EHS-Matrix und Einbettung stationäre Suspensionskultur. Das organoiden Medium für den dritten Schritt unseres Protokolls verwendet wird mit Dorsomorphin und SB431542 ergänzt. Dorsomorphin ist ein niedermolekularer Inhibitor von knochenmorphogenes Protein (BMP) und SB431542 hemmt die TGF & bgr; / Activin / Knoten Signalweg. Die Kombination dieser Faktoren könnte neuronale Differenzierung mehr fördert effizienter als Retinsäure allein 11, 12, 13, 14.

Insgesamt ermöglichen diese Modifikationen die reproduzierbare Erzeugung von brain Organoide mit minimalen Variationen in Organoiden. Wichtig ist, dass diese Methode microcephalic Gehirn Organoide von Patienten zu iPSCs robust erzeugt aufgebracht, die Mutationen in Genen tragen, die Zentrosomen und Zellzyklusdynamik beeinflussen.

Der zweite Teil dieses Protokolls gibt Anweisungen br vorzubereitenain Organoide für die Analyse und Interpretation von zellulären Defekte in Mikrozephalie. Dazu gehören Fixierung, Kryoschneiden, Immunofluoreszenzfärbung und konfokale mikroskopische Analyse. Dieses Protokoll wird dem Leser eine detaillierte Beschreibung der erwarteten Ergebnisse liefern und mit Anleitung zur Interpretation.

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Protokoll

1. Erzeugung von Brain Organoide (23 Tage)

  1. Initiierung von Neuroektoderms (5 Tage)
    HINWEIS: Die folgenden Punkte sollten vor dem Beginn der Differenzierung in Betracht gezogen werden. Die Umprogrammierung Methode (lentiviral-, Sendai-Virus-, Episomen oder microRNA-Basis etc.) menschlichen iPSCs erhalten sollte idealerweise die gleiche für alle Patienten und iPSC Leitungen steuern. Verschiedene Umprogrammierung Kits und Anweisungen auf der Grundlage veröffentlichter Protokolle sind 15, 16, 17, 18. Die Qualität der menschlichen iPSC Linien ist der Schlüssel für eine optimale Differenzierung zu erreichen. Überwachen Kolonie und der Zellmorphologie mit einem Mikroskop und validieren Pluripotenz durch Testen der Expression von Markern wie Oct3 / 4, Nanog oder TRA-1-60.
    1. Kultur menschlicher iPSCs unter feeder freien Bedingungen in Medium A auf einem Teller beschichtet mit Engelbreth-Holm-Swarm(EHS) Matrix.
      HINWEIS: Wachsen menschliche iPSCs feeder freie und serumfreien Kultur mit einem definierten Zustand zu erhalten und einen zusätzlichen Schritt zur Entfernung von embryonalen Maus-Feeder-Zellen (MEFs) vor Beginn der Differenzierung zu vermeiden. Die optimale Durchgangszahl für die menschlichen iPSCs zur Differenzierung im Bereich von Kanal 15 bei Neuprogrammierung zu Durchgang 70 insgesamt zu starten. Wenn Passagierung lösen hiPSC Kolonien als Zellen, die mit geringer mechanischer Belastung eine geeignete Zellentfernungslösung aggregate verwendet und eine 2-ml serologische Pipette Aggregate auf eine neue Schale zu übertragen. Vermeiden Sie Dissoziation auf einzelne Zellen, wie diese Differenzierung induzieren könnte und Apoptose in den meisten iPSC Linien. Es wurde berichtet , dass eine langfristige, Single-Cell - Passagierung genomische Veränderungen in der menschlichen 19 iPSCs erhöhen könnte, 20. Vermeiden Zellablösung Verfahren, die einen Zentrifugationsschritt erforderlich Entfernungslösung zu entfernen, da dies die Gesamtfähigkeit der iPSCs reduziert. Testalle Kulturen für mikrobielle Kontaminationen, insbesondere Mykoplasmen, auf einer regelmäßigen Basis, denn dies könnte die Qualität der iPS-Zellen und deren Differenzierungsfähigkeit verändern.
      1. Mantel eine 60 mm-Gewebekulturschale mit EHS-Matrix gemäß den Anweisungen des Herstellers.
      2. Auftauen eines Aliquots von 1 × 10 6 menschlichen iPSCs. Same ist das iPSCs in einer 60-mm - Gewebekulturschale in beschichtet EHS - Matrix und die 5 ml Medium A (siehe Materialien Tabelle). Ändern Sie das Medium täglich und Durchgang nach 5 bis 7 Tagen, wenn die Zellen erreichen ~ 80% Konfluenz.
        HINWEIS: Die Passage die aufgetaute iPSCs bei 80% Konfluenz unter Verwendung von Standardverfahren, wie beispielsweise die enzymfreie Ablösung von Kolonien 21, mindestens einmal , bevor die Differenzierung beginnt. Kurz gesagt, entfernen Sie das iPSC Medium, waschen Sie die einmal Zellen mit vorgewärmten 37 ° C Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium: Nährsalzgemisch F12 (DMEM / F12) und inkubieren Sie die iPS-Zellen nach Angaben des HerstellersReagenz A Anweisungen (siehe die Material Tabelle). Überschreiten Sie die empfohlene Inkubationszeit nicht um Dissoziation zu einzelnen Zellen zu vermeiden. Menschliche iPS sollte abgelöst und variabel als Aggregate werden, nicht als einzelne Zellen. Sie können dann auf neue EHS-Matrix-beschichteten Schalen übertragen werden; iPSC beispielsweise Aggregate, die aus einer 60-mm-Schale zu 4 neuen Schalen mit 60 mm verteilt werden kann.
      3. Überprüfen Sie für Mykoplasmen mit einem Mycoplasma Detection Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie nur Mycoplasma frei iPSCs, wie Mykoplasmen die Differenzierungsfähigkeit von iPS-Zellen verändern können.
    2. Dissoziieren iPSCs (80% konfluent) und bereite Reagenz B. eine Einzelzellsuspension unter Verwendung von
      1. Waschen Sie die iPSCs einmal mit vorgewärmten (37 ° C) DMEM / F12.
      2. Fügen vorgewärmten Reagens B ( zum Beispiel 1 ml in einer 60 mm - Schale) und inkubiere die iPSCs für 5 min bei 37 ° C und 5% CO 2.
      3. Flick 20 mal mit einer Fingerspitze auf den Seiten und am Boden vondie Schale, die die iPSCs abzulösen. Überprüfen Sie für die Ablösung von Zellen unter dem Mikroskop.
      4. Pipette, um die Zellsuspension nach oben und unten in der Schüssel 5 mal mit einer 1-ml-Mikropipette.
      5. 3 ml Medium A 1 ml Reagens B zu verdünnen und die Zellsuspension in eine 15-ml-Zentrifugenröhrchen zu sammeln.
      6. Spin-down vorsichtig die iPS-Zellen (500 × g) für 4 min bei Raumtemperatur.
      7. Resuspendieren des Zellpellets in 1 ml Medium B, und die Zellzahl mit einem Hämozytometer zählen.
        Hinweis: Beachten Sie nur Medium B für Aufwirbelung mit. Vermeiden Medium A verwendet wird, da sie eine zu hohe Konzentration an bFGF enthält, die die Differenzierung inhibieren könnten.
    3. Verdünne die Zellsuspension auf 4,5 x 10 5 Zellen pro ml in Medium B , ergänzt mit 10 & mgr; M rho-assoziiertes Protein - Kinase - Inhibitor (Y-27632).
    4. Je 100 & mgr; l pro Vertiefung in einer nicht-haftenden, V-Boden, 96-Well-Platte.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Zellen gleichmäßig im sus verteiltpension von der Röhre ausgeschüttelt, bevor 100 ul-Portionen Entnahme. Es ist wichtig, dass jede Vertiefung eine äquivalente Anzahl von Zellen, um Neurosphären enthalten sollte homogen in der Größe und Form (rund, definierten Oberflächen) zu erhalten.
    5. Spin sanft die Platte mit den Zellen nach unten bei 500 xg und Raumtemperatur für 3 min und Inkubation bei 37 ° C und 5% CO 2.
    6. Ändern Sie das Medium täglich um 50 & mgr; l Entfernen und Hinzufügen von 50 & mgr; l frischem Medium B in jede Vertiefung für die nächsten 5 Tage.

2. Embedding Neurosphären in EHS-Matrix (4 Tage)

  1. Bereiten Neurosphäre Medium durch Vermischen der folgenden Bestandteile: 1: 1-Mischung aus DMEM / F12 und Medium C (v / v), 1: 200 (v / v) Supplement 1, 1: 100 (v / v) Ergänzung 2 ohne (w / o) Vitamin A, 1: 100, L-Glutamin, 0,05 mM nicht-essentielle Aminosäuren (MEM), 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 1,6 g / L insulin, und 0,05 mM β-Mercaptoethanol.
  2. Sammeln Sie die Neurosphären witha 200 & mgr; l Mikropipette eine ~ 2 mm Spitze zuvor geschnitten mit einer sterilen Schere verwenden.
  3. Platzieren Sie die Neurosphären etwa 5 mm voneinander entfernt auf Paraffinfilm (3 x 3 cm 2) in einer leeren 100 - mm - Schale und vorsichtig entfernen , so viel des verbleibenden Mediums wie möglich.
  4. Einen Tropfen (7 & mgr; l) von EHS Matrix auf jeden einzelnen Neurosphäre.
  5. Inkubieren der Matrix mit den EHS Neurosphären für 15 min in einem Inkubator abfällt.
  6. Waschen Sie die Neurosphären vorsichtig aus dem Paraffinfilm, indem sie mit Neurosphere Spülmedium. Zu spülen, verwenden, um eine 1 ml-Mikropipette und 100 mm-Petrischale, die 10 ml Medium Neurosphäre.
  7. Inkubiere die Neurosphären für die nächsten 4 Tage und mit 2 ml frischem Neurosphere Medium am Tag 2.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Regale in dem Inkubator flach sind, so dass die EHS-Matrix eingebettete Neurosphären nicht zusammen auf einer Seite des Tellers verklumpen werden.

3. Organoide in einem Rotations SuspensionKultur (14 Tage)

  1. Bereiten brain organoiden Medium durch Vermischen der folgenden Bestandteile: 1: 1-Mischung aus DMEM / F12 und Medium C (v / v), 1: 200 (v / v) Supplement 1, 1: 100 (v / v) Ergänzung 2 w / o Vitamin A, 1: 100, L-Glutamin, 0,05 mM MEM, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 1,6 g / l Insulin, 0,5 uM Dorsomorphin, 5 & mgr; M SB431542 und 0,05 mM β-Mercaptoethanol.
  2. 100 ml Gehirn organoiden Medium zu jedem Zentrifugenkolben durch seine Seitenarme und sie in einem Inkubator für die Vorwärmung für mindestens 20 min.
  3. Stellen Sie ein mitreißendes Programm bei 25 Umdrehungen pro Minute auf, nach dem Anweisungen des Herstellers.
    HINWEIS: Bevor Sie die EHS-Matrix eingebettete Neurosphären in Rotationskolben übertragen, stellen Sie sicher, dass sie alle voneinander getrennt sind. Wenn zwei oder mehr durch EHS-Matrix verbunden sind, trennen sie von der Verbindungsmatrix mit einem Skalpell geschnitten wird.
  4. übertragen sorgfältig die EHS-Matrix eingebettet Neurosphären in Rotationskolben, enthaltend 100 ml Medium organoiden using eine 2 ml serologische Pipette. Verwenden, um die Seitenarme des Spinner-Flasche, die Neurosphären in den Kolben zu übertragen.
  5. Platzieren Sie die spinner flasks auf einem Magnetrührstab Plattform in einem Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2; dies ist Tag 0 der organoiden Kultur.
  6. Ändern Sie das Medium einmal pro Woche (oder öfter, wenn es eine Farbänderung) um die Hälfte des Mediums entfernt und Zugabe der gleichen Menge an frischem Medium.
    HINWEIS: aus dem Inkubator Wenn die Spinnerflaschen nehmen, warten 3-5 min die Organoide sinken bis auf den Boden des Kolbens zu lassen. Entfernen des Mediums durch die Glaspipettenspitze Platzierung (mit einer Pumpe) auf der Oberfläche der Flüssigkeit; anzusaugen, das Medium vorsichtig durch eine Seitenöffnung / Arm des Kolbens. Diese Manipulationen müssen unter der laminaren Haube erfolgen.

4. Analyse von Brain Organoide

  1. Fixierung von Organoiden
    1. Sammeln Sie die Organoide am Tag 14 der Rührflasche Kultur with einen Schnitt 1 mL Mikropipette (cut ~ 5 mm). Legen Sie alle von ihnen in einer 60-mm-Schale und waschen Sie sie einmal mit 5 ml warmem DMEM / F12 für 3 min.
    2. Vorbereiten ein 1,5-ml-Röhrchen mit 500 & mgr; l warm 4% Paraformaldehyd (PFA).
      Achtung: Tragen Sie Haut- und Augenschutz und das Arbeiten unter der Schutzhaube bei PFA Fixativ Handhabung.
    3. Platzieren jeder organoiden separat in jedem Röhrchen und fixieren sie für mindestens 30 min bei Raumtemperatur. Sie nicht die Organoide länger als 60 min beheben. Um die Organoide zu bewegen, eine Impföse oder andere devise verwenden, die bequem ist.
    4. Entfernen Sie die PFA und wäscht die Fest Organoide zweimal für jeweils 10 min mit 1 ml PBS.
    5. Lagern Sie die Organoide in 1 ml PBS bei 4 ° C für bis zu 7 Tage, bis zur weiteren Verwendung.
  2. Das Einbetten der Organoide für Kryoschneiden
    1. Entfernen Sie die PBS und füge 1 ml 30% Saccharose in destilliertem Wasser Lösung pro Röhrchen der Organoiden zu entwässern, bevor sie cryofreezing; nach der Zugabe von Sucrose Lösung sollte die Organoide an der Oberfläche schwimmen. Lagern Sie die Organoide über Nacht in Saccharose-Lösung bei 4 ° C; am nächsten Tag haben die Organoide sollten den Boden des Röhrchens herabgesunken.
      HINWEIS: Organoide kann für bis zu 3-5 Tage bei 4 ° C in einer Zuckerlösung bei Bedarf gespeichert werden.
    2. Füllen eine Vinylprobenform mit 400 ul optimaler Schnitttemperatur (OAT) -Verbindung und die Verwendung eine Impföse eine organoiden in der Mitte der Form zu platzieren. Beschriften den Rand der Form mit dem Probennamen.
    3. Einfrieren die organoiden haltigen Form bei -80 ° C bis Kryoschneiden.
    4. Coat Glas cryoslides mit 0,1% Poly-L-Lysin-Lösung (PLL) in PBS für 5 min bei Raumtemperatur und ließ die Objektträger trocknen 3 Stunden. Lagern Sie die Folien bei 4 ° C und erwärmen sie vor dem Gebrauch auf Raum gemäßigten bis.
      HINWEIS: Die PLL-Beschichtung ist ein wichtiger Schritt, da er die organoiden Scheiben aus davonzuschweben zu verhindern. Sammeln und Speichern von PLL-Lösung bei 4 ° C für bis zu 3Monate. Vor der Wiederverwendung filtert es mit einer 0,22-um-Spritze und lassen Sie es auf Raumtemperatur warm.
    5. Abschnitt cryofrozen Organoiden in 20-50 um dicke Scheiben auf PLL-beschichtete Glas cryoslides 22. Lassen Sie die Folien mit den Abschnitten 1 h bei Raumtemperatur trocknen. Speichern der Abschnitte bei -80 ° C bis zur Weiterverarbeitung.

5. Immunfluoreszenzanfärbung von organoiden Sections

HINWEIS: Für die allgemeine Charakterisierung von Organoiden, mit nestin Färbung, ein neuralen Vorläufer Marker und TuJ1, ein pan-neuronalen Marker, wird empfohlen. Als weitere Beispiele, Immunofluoreszenzfärbung mit phospho-Vimentin (p-VIM), die mitotische apikalen radialen Gliazellen Etiketten und Arl13b, für Flimmer, werden beschrieben. Um zu testen, die Apoptose, verwenden Sie die Desoxyribonukleotidyltransferase (TdT) dUTP Nick-End Labeling (TUNEL) -Test. Legen Sie die Folien in einer Kunststoff-Box während der Inkubationen sie vor Staub zu schützen, Licht,und auszutrocknen.

  1. Tauen Sie die Folien für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
  2. Waschen des Objektträgers zweimal mit 200 ul PBS-Glycin (0,225 g Glycin in PBS) für 3 min, um die PFA-induzierte Autofluoreszenz zu löschen.
  3. Permeabilisieren die Abschnitte mit 200 ul 0,5% Triton X100 / 0,1% Tween in PBS-Lösung für 10 min bei Raumtemperatur.
  4. Waschen Sie sie zweimal mit 200 ul PBS-Glycin-Lösung für 3 min.
  5. Inkubieren sie mit 200 ul 0,5% Fischgelatine / 0,1% Triton X100 in PBS für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C Bindung unspezifischer Antigen zu blockieren.
    HINWEIS: Wenn ein TUNEL-Test erforderlich ist, führen Sie den Test gemäß dem Protokoll des Herstellers. Beginnen Sie mit dem TUNEL-Test vor der Immunfärbung durchgeführt wird, wie es mit sekundären Antikörpern stören könnten und Fluorophore löschen, wenn danach verwendet.
  6. Verdünne die Antikörper in Blocking-Lösung in den folgenden Konzentrationen: Nestin, 1: 200; p-Vim, 1: 500; TuJ1, 1: 200;Arl13b, 01.20; und sekundärer Antikörper, 1: 1000.
  7. Inkubieren mit 200 & mgr; l der ersten primären Antikörpern (zB Nestin) für 1-2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C.
  8. Waschen 3 x 3 min mit 200 ul Blockierungslösung.
  9. Verdünne die erste (anti-Maus 488) Sekundärer Antikörper: 1: 1000 in Blocking-Lösung und den Objektträgers in 200 & mgr; L für 1-2 h bei Raumtemperatur inkubieren. Von nun an schützt immer die Folien aus Licht.
  10. Waschen 3 x 3 min mit 200 ul Blockierungslösung.
  11. Inkubieren mit 200 & mgr; l des nächsten primären Antikörper (zB TuJ1) für 1-2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C.
  12. Waschen 3 x 3 min mit 200 ul Blockierungslösung.
  13. Füge 200 & mgr; L des nächsten sekundären Antikörpers (Anti-Kaninchen-647) für 1-2 h bei Raumtemperatur.
  14. Waschen 3 x 3 min. mit 200 ul Blockierungslösung.
  15. Füge 200 & mgr; l von 4' , 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) in einer 30 nM concentration in PBS für 15 min bei Raumtemperatur für die Kernfärbung.
  16. Waschen 2 x 3 min mit 200 ul Blockierungslösung.
  17. Wäsche 1 x 1 min mit 200 ul destilliertem Wasser und lassen die Abschnitte für 10-20 min trocknen, bis kein offensichtlicher Wassertropfen mehr sichtbar ist.
  18. Montieren der Schnitte mit Medium einbettet. Lagern Sie sie von Licht bei 4 ° C geschützt bis zu mehreren Wochen.
  19. Fahren Sie mit der mikroskopischen Analyse zu Bild einen Überblick über die organoiden, ventrikulären Zone, primitive Kortikalplatte und andere Bereiche von Interesse.
  20. Verwenden , um ein konfokales Mikroskop mit einem Objektiv und 63X Ölfluoreszenzfilter, ausgewählt gemäß dem Fluoreszenzfarbstoff-markierten Sekundärantikörper 1 verwendet wird , 10.

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Ergebnisse

Die Erzeugung von brain Organoide erfordert mindestens drei Wochen ununterbrochener Kultivierung (1A). Um reproduzierbare Ergebnisse zu erreichen, empfehlen wir, dass die Forscher jeden Schritt dokumentiert und, was wichtig ist, vermeidet jegliche Änderungen in Bezug auf Medienkomponenten, Zeitpunkte und die Handhabung von Zellen. Hier geben wir einen Überblick darüber, wie zu beurteilen, ob kritische Meilensteine ​​erreicht, um sich Organoide von ausreichender Qualität ...

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Diskussion

MCPH ist eine komplexe menschliche Erkrankung des Nervensystems , die nicht in Tiermodellen in vivo oder in einfachen menschlichen Zellkulturansätze in vitro rekapituliert werden kann. Die klinische Manifestation der MCPH beginnt während des ersten Trimesters zu erscheinen, wenn sie früh beginnt die Neurogenese. Somit stellen die 3D Gehirn Organoide ein zuverlässiges experimentelles System MCPH Entwicklung zu modellieren. Darüber hinaus 3D menschliches Gehirn Organoide ist ein idealer Ansatz, da i) sie...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der Fritz-Thyssen-Stiftung (Az.10.14.2.152) unterstützt. Wir sind dankbar, dass die Gewebeeinbettung Anlage und das Mikroskop Core Facility des ZMMK. Wir sind dankbar für die Diskussionen und technische von den Mitgliedern des Labors für Zentrosom und Zytoskelett Biologie unterstützt. Wir danken Li Ming Gooi das Manuskript für das Korrekturlesen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Anti-Maus 488InvitrogenA-11001Ziege Anti-Maus IgG (H+L) Sekundärer Antikörper, Alexa Fluor 488
Anti-Kaninchen 647InvitrogenA-21245Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L) Sekundärer Antikörper, Alexa Fluor 647
Arl13bproteintech17711-1-APARL13B Kaninchen polyklonaler Antikörper
CELLSPIN SystemIBS Integra Bioscience183001
DAPISigma-Aldrich, US326704′,6-Diamidino-2-phenylindol-dihydrochlorid; mehrere Lieferanten
DMEM/F-12Gibco, USA31331093Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nährstoffmischung F-12 
DorsomorphinSigma-Aldrich, USP5499Verbindung C; mehrere Lieferanten
EinbettmediumAppliChemA9011, 0100Mowiol; Einbettungsmedium; mehrere Lieferanten
Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) MatrixCorning354277Matrigel hESC-qualifizierte Matrix; wichtig: hESC-qualifiziert
Fischgelatine Sigma-Aldrich, USG7765-250MLGelatine aus Kaltwasserfischhaut; mehrere Lieferanten; Autoklav nach Zugabe zu PBS zum Auflösen und Sterilisieren, lagern bei 4 & Grad; C
GlycineAppliChemA1067,1000Glycin für die Molekularbiologie; mehrere Anbieter 
Impfschlaufe mit Nadel, Einweg (1 & Mikro; L)Sigma Aldrich, USBR452201-1000EAmehrere Lieferanten 
InsulinSigma-Aldrich, USI3536-100MGmehrere Lieferanten
L-GlutaminGibco, USA25030081L-Glutamin (200 mM)
Medium AStammzelltechnologien#05850mTeSR1 (hiPSC medium)
Medium BStammzelltechnologien#05835Neuronales Induktionsmedium (NIM); neuronales Differenzierungsmedium
Medium CGibco, US21103049Neuronales Basalmedium
MEMGibco, USA11140035MEM-Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren (100x)
MycoAlert Mycoplasma-NachweiskitLonza, Schweiz#LT07-218Mykoplasmen-Nachweiskit; mehrere Lieferanten
NestinNovus BiologikaNBP1-92717Monoklonaler Nestin-Maus-Antikörper (4D11)
Paraformaldehyd (PFA)AppliChemA3813, 05004% in PBS, Lösung bei -20 &° lagern; C; Achtung: Haut- und Augenschutz tragen und unter der Motorhaube arbeiten 
PBS TablettenGibco, US18912014Hersteller anzeigen&akut; s Anweisungen; mehrere Lieferanten
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)Gibco, USA15140122Mehrere Lieferanten
Poly-L-Lysin-Lösung (PLL)Sigma-Aldrich, USP8920-100MLMehrere Lieferanten
pVimMBLD076-3SPhospho-Vimentin (Ser55) mAb
Reagenz A Stammzelltechnologien# 05872Anmerkung zu Protokoll 1.1.1.2; ReLSR (Enzymfreies humanes ES- und iPS-Zellselektions- und Passage-Reagenz); Bitte folgen Sie dem Hersteller&Akut; S-Protokoll; alternative Produkte von mehreren Lieferanten verfügbar
Reagenz B Sigma-Aldrich, USA6964-100MLAccutase-Lösung ist eine enzymatische Lösung für die Einzelzelldissoziation; mehrere Lieferanten; Protokoll 1.1.2 "enzymatische Zelldissoziationslösung"  
Forschung Kryostat Leica CM3050 SLeica biosystemsCM3050 SMehrere Lieferanten
SB431542Selleckchem.comS1067Mehrere Lieferanten
Spinnerkolben 250 mLIBS Integra Bioscience182026
SaccharoseAppliChemA4734, 1000Mehrere Lieferanten
Superfrost ultra plus ObjektträgerThermo scientific, USJ3800AMNZObjektträger sollten mit einem "+" gekennzeichnet und positiv geladen sein
Beilage 1Gibco, US17502048N-2 Ergänzung (100x)
Beilage 2 ohne Vitamin AGibco, US12587010B-27 Ergänzung (50x), abzüglich Vitamin A; mehrere Lieferanten
Tissue-Tek CryomoldSakura, NL4565Mehrere Lieferanten
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakura, NL4583Mehrere Lieferanten
Triton X-100AppliChemA1388,0500Mehrere Lieferanten
TUJ1Sigma-Aldrich, UST2200β-Tubulin III (Kaninchen polyklonal)
TUNEL-AssayPromega, USG3250DeadEnd Fluorometrisches TUNEL-System; mehrere Lieferanten
Tween 20 für die MolekularbiologieAppliChemA4974,0500Mehrere Lieferanten
wasserdichte FolieBEMIS Company, Inc.PM996Parafilm " M”; mehrere Anbieter
Y-27632 Selleckchem.comS1049ROCK-Inhibitor (Y-27632 2HCL);
mehrere Lieferantenβ-MercaptoethanolGibco, US313500102-Mercaptoethanol (50 mM); mehrere Lieferanten

Referenzen

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