Methodenartikel

Peptid-Scanning-gestützte Identifizierung eines monoklonalen Antikörpers anerkannte Linear B-Zell-Epitop

9.1K Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/55417

⸱

24. März 2017

 , 
1Institute of Cellular and Organismic Biology, Academia Sinica

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren die Autoren ein einfaches und effizientes Protokoll zur Definition eines linearen antigenen Epitops unter Verwendung eines gereinigten monoklonalen Antikörpers und Peptid-Scans durch Dot-Blot-Hybridisierung. Das identifizierte Epitop kann dann in therapeutischen und diagnostischen Anwendungen eingesetzt werden.

Zusammenfassung

Die Identifizierung eines antigenes Epitop von dem Immunsystem ermöglicht das Verständnis des Schutzmechanismus von neutralisierenden Antikörpern, die die Entwicklung von Impfstoffen und Peptid-Medikamente können erleichtern. Peptid-Scanning ist eine einfache und effiziente Methode, die ohne weiteres das lineare Epitop durch einen monoklonalen Antikörper (mAb) erkannt abbildet. Hier präsentieren die Autoren ein Epitop Bestimmung Methodik seriell verkürzten rekombinanten Proteinen, synthetischen Peptid-Design und Dot-Blot-Hybridisierung für die Antigen-Erkennung von Nerven Nekrose-Virus-Hüllprotein mit einem neutralisierenden mAb beteiligt sind. Diese Technik beruht auf dem Dot-Blot-Hybridisierung von synthetischen Peptiden und mAbs auf einem Polyvinylidenfluorid (PVDF) -Membran. Die minimale antigen Bereich eines viralen Hüllprotein vom RG-M56 mAb erkannt durch die Schritt-für-Schritt-getrimmten Peptidkartierung auf ein 6-mer-Peptid-Epitops eingegrenzt werden. Zusätzlich Alanin-Scanning-Mutagenese und Rückstands substitution kann die Bindungs ​​Bedeutung jeder Aminosäurerest, aus denen das Epitop charakterisieren, durchgeführt werden. Die Reste, die die Epitop-Website flankieren, wurden gefunden kritische Rollen in Peptidkonformation Regulation zu spielen. Das identifizierte Epitop-Peptid kann verwendet werden, um Kristalle von Epitop-Peptid-Antikörper-Komplexe für eine Röntgenbeugungsuntersuchung zu bilden und funktionellen Wettbewerb oder für Therapeutika.

Einleitung

Im Immunsystem, die Rekombination von V-, D- und J - Segmente können für Antikörper für die Bindung an verschiedene Antigene enorme Variationen von komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs) zu erzeugen , die Host von pathogenen Infektion zu schützen. Die neutralisierende Abwehr von Antikörpern gegen Antigene hängt von der räumlichen Komplementarität zwischen den CDRs der Antikörper und die Epitope der Antigene. Daher wird ein Verständnis dieser molekularen Wechselwirkung prophylaktischen Impfstoff-Design und therapeutischen Peptid Arzneimittelentwicklung unterstützen. Jedoch kann diese Neutralisation Wechselwirkung sowohl aus einem einzigen Antigen und durch mehrere CDRs von Antikörpern durch multiple antigene Domänen beeinflußt werden, die somit das Epitop Bestimmungsprozess komplexer machen. Glücklicherweise ist die Entwicklung der Hybridom-Technologie, die einzelnen Antikörper-produzierenden Zellen mit Myelomzellen verschmilzt, ermöglicht eine ständig Dividieren Charge von Zellen secrete einem spezifischen Antikörper, bekannt als ein monoklonaler Antikörper (mAb) 1. Hybridomzellen produzieren diese reine, hochaffine mAb an einem einzigen Antigen-Domäne eines spezifischen Antigens zu binden. Mit der Beziehung des Antigen-Antikörper festgestellt, mehrere Ansätze, einschließlich Peptid-Scanning, verwendet werden, um das Epitop eines Antigens zu bestimmen seinen entsprechenden mAb verwendet. Die jüngsten Entwicklungen in der synthetischen Peptid-Technologie haben die Peptid-Scanning-Technik zugänglicher und bequemer gemacht auszuführen. Kurz gesagt, werden gemäß einer Zielantigensequenz einen Satz von überlappenden synthetischen Peptiden hergestellt und zu einem Feststoff-Trägermembran für mAb Hybridisierung verbunden. Peptid-Scanning bietet nicht nur eine einfache Möglichkeit, die Antikörper-Bindungsregion auf der Karte, sondern erleichtert auch Aminosäure (aa) Mutagenese durch Rückstands Scannen oder Substitution die Bindungswechselwirkung zwischen jedem aa-Rest des Epitop-Peptid und die CDRs des Antikörpers zu bewerten.

Hier beschreibt die vorliegende Studie ein Protokoll für die effiziente Identifikation des linearen Epitop des gelben Grouper nervös Nekrose - Virus (YGNNV) Hüllprotein mit einem neutralisierenden mAb 2, 3, 4. Das Protokoll enthält mAb Vorbereitung, Konstruktion und Expression von seriell verkürzten rekombinanten Proteine, synthetische überlappende Peptid Design, Dot-Blot-Hybridisierung, Alanin-Scanning und Substitutionsmutagenese. die hohen Kosten für die Peptidsynthese unter Berücksichtigung, wurde der Schritt des seriell die rekombinanten Proteine ​​eines gewünschten Zielproteins Verkürzen modifiziert und die antigene Region wurde auf etwa 100 bis 200 aa Reste, bevor der synthetische Peptidarray Dot-Blot-Analyse durchgeführt wurde eingeengt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

1. Herstellung des monoklonalen Antikörpers

  1. Kultur die RG-M56 monoklonalen Maus - Hybridomzellen 2 in Serum-freiem Medium in 175T - Kolben bei 37 ° C mit 5% CO 2 zu ergänzen. Die überstehende Flüssigkeit, wenn die Farbe des Mediums nach fünf Tagen Inkubation gelb wird.
    HINWEIS: Hybridoma-Zellen wurden in serumfreiem Medium Antikörper Kontamination aus fötalem Rinderserum zu vermeiden.
  2. Zentrifugieren Sie den Überstand bei 4.500 × g für 30 min bei 4 ° C und entsorgen die Zelltrümmer Pellet.
  3. In 2 ml Protein G-Agarose (geliefert als eine 50% ige Aufschlämmung) auf eine 5-ml-Säule und ins Gleichgewicht mit 10 Harzvolumina (10 ml) eiskaltem PBS.
  4. Legen Sie 200 ml des Antikörpers Überstand (Schritt 1.2) auf die Säule und entsorgen Sie die Pass-Through.
  5. 10 ml eiskaltem PBS auf die Säule zu waschen. Zweimal wiederholen.
  6. 10 ml 50 mM Glycin, pH 2,7 auf die Säule, die das Protein G-assoziierten Antikörper zu eluieren. ColLect 900 ul-Fraktionen in einem Mikrozentrifugenröhrchen, das 100 ul 10fach Neutralisationspuffer (1 M Tris, 1,5 M NaCl und 1 mM EDTA, pH 8,0).
  7. Lagern Sie das gereinigte Antikörper in 50% Glycerin mit 0,03% NaN 3 bei -20 ºC.

2. Konstruktion und Expression von Abwechselnd Verkürzte rekombinanten Proteine

  1. Bereiten Sie eine PCR - Reaktionsgemisch: 5 ul 10x Pfu - Puffer, 0,2 mM von jedem dNTP, 0,2 & mgr; M Vorwärtsprimer 3, 0,2 uM Reverse - Primer 3, 2 mM MgSO 4, 1 ng pET20b-1A59 3 Plasmid - DNA und 2,5 U ( Einheit) von Pfu DNA - Polymerase; ddH 2 O auf ein Endvolumen von 50 & mgr; l hinzuzufügen.
    1. Führen Proben in einem automatischen Thermocycler mit folgenden Parametern: Zyklus 1 (94 ° C für 5 min); 2-36 Zyklen (94 ° C für 30 s, 63 ºC für 30 s und 72 ° C für 60 s); und Zyklus 37 (72 ºC für 7 min).
  2. Extrahieren der Polymerasekettenreaktion (PCR) Produkte durch eine PCR - Reinigungskits 5 unter Verwendung der folgenden Restriktionsenzym - Verdau zu ermöglichen.
  3. Digest die PCR-amplifizierten DNA - Fragmente mit Nde I und Xho I - Restriktionsenzymen und Ligation jedes dieser DNA - Fragmente in Nde I und Xho I gespalten enzym pET-20b (+) Vektor. Verwandeln Sie die Konstrukte in Escherichia coli DH-5α kompetenten Zellen 6.
    1. Bereiten Sie die Aufschlussmischung in Verdauungspuffer (20 mM Tris-Acetat, 10 mM Mg (CH 3 COO) 2, 50 mM KCH 3 COO und 1 mM DTT, pH 7,9) mit 1 ug PCR-amplifizierte DNA oder pET-20b (+) Vektor - DNA und 2 U von Nde I und Xho I - Restriktionsenzymen in einem Endvolumen von 20 & mgr; l.
    2. Mischen Sie die Verdauung Mischung sanft und schnell drehen nach unten. bei 37 ºC inkubieren für 2 h in einem trockenen Bad die komplette Schneiden der Einschränkung, um sicherzustellen, sitzenes.
    3. Extrahieren Sie die Restriktionsenzym-verdauten DNA - Fragmente unter Verwendung eines PCR - Reinigungs - Kit 5 , um die folgenden Plasmidkonstruktion erleichtern.
    4. Bereiten Sie die Ligierungsmischung in Ligationspuffer (66 mM Tris, 5 mM MgCl 2, 1 mM ATP und 5 mM DTT, pH 7,5) mit 100 ng predigested, PCR-amplifizierte DNA, 10 ng vorverdaut pET-20b (+) Vektor-DNA und 5 U des T4 DNA-Ligase in einem Endvolumen von 10 & mgr; l.
    5. Mischen Sie das Ligierungsgemisch schonend und schnell Spin-Down. bei 16 ºC inkubieren für 18 Stunden in einem Wasserbad.
    6. Setzen Sie 10 ul der Ligationsproben in 100 & mgr; l der DH-5α kompetenten Zellen und vorsichtig mischen, bevor das Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis für 30 min platzieren. Setzen Sie den Mikrozentrifugenröhrchen in einem trockenen Bad bei 42 ° C für 90 s Hitzeschock 7 zu induzieren. Unmittelbar übertragen das Rohr auf Eis für 2 min.
    7. Hinzufügen 900 uL Luria-Bertani (LB) Medium (1% Bacto Trypton, 0,5% Bacto Hefe extract, und 0,5% NaCl, pH 7,0) in das Röhrchen. bei 37 ºC inkubieren mit 150 Umdrehungen pro Minute für 45 Minuten schütteln. Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 4000 x g für 10 Minuten und den Überstand verwerfen.
    8. Resuspendieren des Pellets mit 50 & mgr; l LB-Brühe und verteilt jede Transformation auf vorgewärmte LB-Platten, enthaltend 100 ug / ml Ampicillin. Die Inkubation bei 37 ° C für 16 Stunden.
    9. Pick-up eine einzelne Kolonie mit einer 200 ul Spitze und legen Sie sie in 3 ml LB-Brühe, die 100 ug / ml Ampicillin in einem lose verschlossen 15 ml-Röhrchen. bei 37 ºC inkubieren mit 150 Umdrehungen pro Minute für 12 h unter Schütteln.
    10. Extrahieren Sie die Plasmid - DNA 8 aus jeder Kultur und sequenzieren es T7 - Promotor und T7 - Terminator - Primer unter Verwendung der Sequenz 9 zu bestätigen.
  4. Nach Sequenzbestätigung, 10 ng DNA aus diesen mit verschiedenen Längen von YGNNV Hüllprotein - Gen in den BL-21 (DE3) -Stamm von E. coli durch uns pET-20b (+) Plasmide transformierening die Hitzeschock - Methode 7. Führen Sie die Schritte 2.3.6-2.3.8 die Transformation durchzuführen.
  5. Übertragen einer einzelnen Kolonie aus jeder transformierten E. coli BL-21 - Zellen in 3 ml LB - Brühe , die 100 ug / ml Ampicillin in einem lose capped 15 ml - Röhrchen. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 ° C mit 150 Umdrehungen pro Minute schütteln.
  6. Man kühlt die Kultur auf 25 ºC , wenn die OD 600 der Kultur etwa 0,6 ist und fügen IPTG bis zu einer Endkonzentration von 0,4 mM , die Expression des rekombinanten Proteins zu induzieren. Inkubieren Sie die Kultur für eine zusätzliche 4 h bei 25 ° C mit 200 Umdrehungen pro Minute schütteln.
  7. 1 ml der Kultur in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 12.000 × g für 1 min und den Überstand verwerfen.
  8. Zellpellet in 100 ul Denaturierungspuffer (8 M Harnstoff, 20 mM Natriumphosphat und 0,5 M NaCl, pH 7,4) durch Auf- und Abpipettieren mit einer Mikropipette. Mischen durch kräftiges Vortexen.
    HINWEIS: Die Probe solutions sollte nun semi-transparent, ein wenig klebrig, und bereit für die Dot-Blot-Hybridisierungstest ist.

3. Entwurf und Synthese von überlappenden Peptiden

  1. Design und Synthese von 3 serielle 20-mer Peptide , die jeder mit seinem Nachfolger überlappen um 10 AS - Reste aus dem 195-338 aa Bereich des YGNNV Hüllprotein des Epitopbereichs von RG-M56 mAb durch Dot - Blot zu verengen.
  2. Design und Synthese von 3 drei 8-mer - Peptide (195 VNVSVLCR 202, 197 VSVLCRWS 204 und 199 VLCRWSVR 206) mit einer Überlappung von 6 AS - Reste auf die nächste synthetisches Peptid , das das Epitop Region von 195-206 aa durch Dot - Blot zu verengen.
  3. Design und Synthese von 3 7-mer (196 NVSVLCR 202 und 195 VNVSVLC 201), 6-mer (195 VNVSVL 200, 196 NVSVLC 201 und 197 VSVLCR 202) und 5-mer - Peptide (195 VNVSV 199, 196 NVSVL 200, 197 VSVLC 201 und 198 SVLCR 202) mit einer Überlappung von 6, 5 und 4 aa - Reste jeweils an ihren benachbarten Peptide die zur Minimierung Epitopbereichs durch dot-Blot.

4. Dot-Blot-Hybridisierung

  1. Auflösen jedes synthetisierte Peptid in Dimethylsulfoxid (DMSO) auf eine Endkonzentration von 10 mg / mL.
    HINWEIS: Um die vielfältigen Löslichkeit von synthetischen Peptiden zu überwinden, alle synthetischen Peptide sollten in DMSO gelöst werden. DMSO ist ein gutes Lösungsmittel vollständig hydrophob oder hydrophile Peptide lösen.
  2. Genießen Sie die Polyvinylidenfluorid (PVDF) Membran mit Methanol für 2 min.
    HINWEIS: PVDF-Membran ist bis zu 100% beständig DMSO; andere können nicht so sein.
  3. Äquilibrieren die PVDF-Membran mit modifizierten Towbin-Puffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin und 0,1% SDS, pH 8,3) für2 Minuten.
    HINWEIS: 10-20% (v / v) Methanol kann modifiziert Towbin Puffer hinzugefügt werden die Übertragungsergebnisse zu verbessern.
  4. Spülen Sie ein Stück Papier Chromatographie mit dem modifizierten Towbin-Puffer. Legen Sie die PVDF-Membran auf die Chromatographie-Papier. Warten, bis der modifizierte Towbin Puffer aus der PVDF Membranoberfläche verschwunden ist, bevor mit dem nächsten Schritt fort.
  5. Fügen Sie 2 ul jeder Peptidprobe an die Membran mit einer 10 & mgr; l Spitze. Der Luft trocknen die PVDF-Membran auf der Chromatographie-Papier für 10 min. Fügen Sie jede Peptidprobe langsam und allmählich auf die Membran zu viel Diffusion zu vermeiden.
  6. Blockieren die Membran in TBST-Puffer (0,05% (v / v) Tween-20, 20 mM Tris und 150 mM NaCl, pH 7,4) mit 5% Magermilch 30 min bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubiert.
  7. Hinzufügen RG-M56 mAb bei einer Endverdünnung von 1: 1000 in TBST-Puffer mit 5% fettfreier Milch in die Membran. Inkubieren Sie die Membran bei 37 ºC für 1 h unter leichtem Schütteln.
  8. Entfernen Sie die Antikörper solution. Waschen Sie die Membran in TBST-Puffer für 5 Minuten unter leichtem Schütteln. Zweimal wiederholen.
  9. Fügen der sekundäre Antikörper (Ziege-anti-Maus IgG, Fc, konjugiert mit alkalischer Phosphatase) in einer Endverdünnung von 1: 5000 in TBST-Puffer mit 5% fettfreier Milch in die Membran. Inkubieren Sie die Membran bei 37 ºC für 1 h unter leichtem Schütteln.
  10. Entsorgen Sie die Antikörperlösung. Waschen Sie die Membran in TBST-Puffer für 5 Minuten unter leichtem Schütteln. Wiederholen Sie den Waschschritt zweimal.
  11. Entwickeln der Membran mit BCIP / NBT-Substratlösung während 15 min im Dunkeln bei Raumtemperatur. Stoppen Sie die Entwicklung durch die Membran mit ddH 2 O gewaschen , wenn das Signal erscheint.
  12. Der Luft trocknen die Membran und erfassen die Dot-Blot-Bild ein Bild System.
  13. Messen der Intensität jedes Dot - Blot unter Verwendung von Bildanalysesoftware 3.

5. Alaninscanning und Substitution

  1. Entwerfen und zu synthetisieren 3 Alanin und methionine Substitutionspeptide. Ersetzen Sie jede aa Rückstand mit Alanin für die 8-mer Peptid 195 VNVSVLCR 202 und synthetisieren Peptide 195 ANVSVLCR 202, 195 VAVSVLCR 202, 195 VNASVLCR 202, 195 VNVAVLCR 202, 195 VNVSALCR 202, 195 VNVSVACR 202, 195 VNVSVLAR 202 und 195 VNVSVLCA 202 . Ersetzen aa Rest Leucin 200 zu Methionin das SJNNV Genotyp - Epitop - Peptid 195 VNVSVMCR 202 zu schaffen.
  2. Folgen Sie Abschnitt 4 zu Alanin-Scanning und Substitutionsmutagenese durchführen Dotblotting.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Das Ziel dieses Experimentes war es ein Epitop durch Dot-Blotting unter Verwendung von mAb zu identifizieren. Um schnell und effizient verengen die antigene Region anerkannt durch mAb, die in voller Länge und seriell abgeschnitten YGNNV rekombinanten Hüllproteine mit einem 6xHis Fusions - Tag am C-Terminus wurden aus einem E. coli - PET - Expressionssystem 10 (1A) ausgedrückt. Die resultierenden rekombinanten Proteine ​​wurden auf die PVD...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Dieses Protokoll bietet eine schnelle und einfache Technik, um ein mAb anerkannte lineares Epitop zu identifizieren. Unter Berücksichtigung der Kosten für die Peptidsynthese und die Produktionseffizienz der Synthese von Peptiden wurde die antigene Region des Virus-Hüllproteins reduziert durch serielles trunkierten rekombinanten Proteinen vor Peptid-Scanning-Analyse exprimieren. Als solche wurde die zuverlässig und effizient E. coli pET Expressionssystem diese seriell trunkierten rekombinanten Proteine als rekom...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit diesem Bericht.

Danksagungen

Die Autoren danken Miss Ching-Chun Lin und Miss Diana Lin von der Core Facility des Institute of Cellular and Organismic Biology (ICOB) der Academia Sinica für ihre Expertise zur Peptidsynthese bzw. DNA-Sequenzierung. Diese Studie wurde von der Academia Sinica unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Hybrid-SFM-MediumGibco12045-076
Dulbeccos-Phophat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)Gibco21600-069
Pfu-DNA-Polymerase Thermo Scientific EP0502 Einschließlich Puffer
T4 DNA LigaseRoche10799009001einschließlich Puffer
NdeI New England BiolabsR0111SEinschließlich Puffer
XhoI New England BiolabsR0146SEinschließlich Puffer
pET-20b(+) VektorNovagen, Merck Millipore69739
E. coli DH-5α kompetente ZelleRBC BioscienceRH617
E. coli BL-21(DE3) kompetente ZelleRBC BioscienceRH217
AmpicillinAmresco0339-25G
LB Brühe Invitrongen12780-052
Isopropylthio-β-D-Thiogalactosid (IPTG)MDBio, Inc.101-367-93-1
MethanolMerck Millipore106009
Polyoxyethylen 20 Sorbitan Monolaurat (Tween-20)J.T.BakerX251-07
Dimethylsulfoxid (DMSO)SigmaD2650
GlycinAmresco0167-5KG
TrisAffymetrix, USB75825
NaClAmresco0241-1KG
EDTAAmresco0105-1KG
GlycerinAmresco0854-1L
NaN3SigmaS2002-500G
BCIP/NBTPerkinElmerNEL937001PK
Ziege Anti-Maus IgG, Fc-FragmentAntikörper Jackson ImmunoResearch115-055-008
Immobilon-P (Polyvinylidenfluorid, PVDF)Merck MilliporeIPVH00010
Protein G Agarose FastFlow Merck Millipore16-266
QIAquick PCR AufreinigungskitQiagen28106
UVP BioSpectrum 600 Image SystemUVPn/a
VisionWorks LS Analysis Software Ver 6.8UVPn/a
MyCycler ThermocyclerBioRad1709713

Referenzen

  1. Milstein, C., Kohler, G. Clonal variations of myelomatous cells (proceedings). Minerva Med. 68 (50), 3453(1977).
  2. Lai, Y. S., et al. In vitro neutralization by monoclonal antibodies against yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) and immunolocalization of virus infection in yellow grouper Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel). J Fish Dis. 24 (4), 237-244 (2001).
  3. Chen, C. W., Wu, M. S., Huang, Y. J., Cheng, C. A., Chang, C. Y. Recognition of Linear B-Cell Epitope of Betanodavirus Coat Protein by RG-M18 Neutralizing mAB Inhibits Giant Grouper Nervous Necrosis Virus (GGNNV) Infection. PLoS One. 10 (5), 0126121(2015).
  4. Lai, Y. -S., et al. Propagation of yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) in a new nodavirus-susceptible cell line from yellow grouper, Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel), brain tissue. J Fish Dis. 24 (5), 299-309 (2001).
  5. Lougee, E., Morjaria, S., Shaw, O., Collins, R., Vaughan, R. A new approach to HLA typing designed for solid organ transplantation: epityping and its application to the HLA-A locus. Int J Immunogenet. 40 (6), 445-452 (2013).
  6. Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression. BMC Biotechnol. 11, 24(2011).
  7. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253(2007).
  8. Pronobis, M. I., Deuitch, N., Peifer, M. The Miraprep: A Protocol that Uses a Miniprep Kit and Provides Maxiprep Yields. PLoS One. 11 (8), e0160509(2016).
  9. Metzker, M. L. Emerging technologies in DNA sequencing. Genome Res. 15 (12), 1767-1776 (2005).
  10. Chiu, C. C., John, J. A., Hseu, T. H., Chang, C. Y. Expression of ayu (Plecoglossus altivelis) Pit-1 in Escherichia coli: its purification and immunohistochemical detection using monoclonal antibody. Protein Expr Purif. 24 (2), 292-301 (2002).
  11. Atassi, M. Z. Antigenic structures of proteins. Their determination has revealed important aspects of immune recognition and generated strategies for synthetic mimicking of protein binding sites. Eur J Biochem. 145 (1), 1-20 (1984).
  12. Opuni, K. F., et al. Mass spectrometric epitope mapping. Mass Spectrom Rev. , (2016).
  13. Chang, C. Y., Chiu, C. C., Christopher John, J. A. The Aquaculture of Groupers. Liao, I. C., Leaño, E. M. , Taiwan Asian Fisheries Society, World Aquaculture Society, The Fisheries Society of Taiwan, National Taiwan Ocean University, Taiwan Press. 207-224 (2008).
  14. Conti-Tronconi, B. M., et al. Alpha-bungarotoxin and the competing antibody WF6 interact with different amino acids within the same cholinergic subsite. Biochemistry. 30 (10), 2575-2584 (1991).
  15. Briggs, S., Price, M. R., Tendler, S. J. Fine specificity of antibody recognition of carcinoma-associated epithelial mucins: antibody binding to synthetic peptide epitopes. Eur J Cancer. 29 (2), 230-237 (1993).
  16. Chen, N. C., et al. Crystal Structures of a Piscine Betanodavirus: Mechanisms of Capsid Assembly and Viral Infection. PLoS Pathog. 11 (10), e1005203(2015).
  17. Badani, H., Garry, R. F., Wimley, W. C. Peptide entry inhibitors of enveloped viruses: The importance of interfacial hydrophobicity. Biochim Biophys Acta. , (2014).
  18. Qureshi, N. M., Coy, D. H., Garry, R. F., Henderson, L. A. Characterization of a putative cellular receptor for HIV-1 transmembrane glycoprotein using synthetic peptides. AIDS. 4 (6), 553-558 (1990).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Dot Blot Hybridisierungseriell trunkierte ProteineAlanin ScanningNervous Necrosis Virusrekombinante ProteinexpressionPVDF MembranEpitop Mapping

Verwandte Artikel