Methodenartikel

Isolierung, Charakterisierung und Reinigung der Makrophagen aus den Geweben von Fettleibigkeit bedingte Entzündung betroffen

DOI:

10.3791/55445

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3. April 2017

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1Department of Veterinary and Biomedical Sciences, The Pennsylvania State University, 2Microscopy and Cytometry Facility, The Huck Institutes of Life Sciences, Pennsylvania State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll ermöglicht ein Forscher zu isolieren und zu charakterisieren, Gewebe-Bewohner Makrophagen in verschiedenen hallmark entzündetem Gewebe extrahiert aus Diät-induzierten Modelle der Stoffwechselstörungen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Übergewicht fördert einen chronische entzündlichen Zustand, der weitgehend durch Gewebe-Bewohner Makrophagen sowie Monocyte abgeleiteten Makrophagen vermittelt wird. Diät-induzierten Adipositas (DIO) ist ein wertvolles Modell bei der Untersuchung der Rolle der Makrophagen Heterogenität; angemessene Makrophagen Isolationen sind jedoch schwierig, von entzündetem Gewebe zu erwerben. In diesem Protokoll beschreiben wir die Isolierung Schritte und notwendigen Lösungsanleitungen stammen aus unseren Studien eine geeignete Bevölkerung von Gewebe-Bewohner Makrophagen von Mäusen nach 18 Wochen der fettreichen (HFD) oder High-Fat/High-Cholesterin (einzuholen HFHCD) Diät Intervention. Dieses Protokoll konzentriert sich auf drei Markenzeichen Gewebe untersucht Adipositas und Arteriosklerose einschließlich der Leber, weißen Fettgewebe (WAT) und der Aorta. Wir markieren wie dualistische Nutzung des Flow Cytometry erreichen eine neue Dimension der Isolierung und Charakterisierung von Gewebe-Bewohner Makrophagen. Ein grundlegenden Abschnitt dieses Protokolls befasst sich mit die Feinheiten gewebespezifischen enzymatischen Verdauung und Makrophagen Isolierung und anschließende Zelloberfläche Antikörper Färbung für durchflusszytometrischen Analyse zugrunde liegen. Dieses Protokoll befasst sich mit vorhandenen Komplexität zugrunde liegende fluoreszierende aktiviert Zelle sortieren (FACS) und enthält Erläuterungen zu diesen komplexen Problemen um breite Palette Charakterisierung von angemessen sortierte Zellpopulationen zu erhalten. Dazu gehören Alternative Anreicherungsverfahren für das Sortieren von Zellen, wie die dichten Leber, ermöglichen Flexibilität und Zeit bei der Arbeit mit FACS. Kurz gesagt, dieses Protokoll aids-Forscher, Makrophagen Heterogenität aus einer Vielzahl von entzündetem Gewebe in einer bestimmten Studie zu bewerten und liefert aufschlussreiche Tipps zur Problembehandlung, die erfolgreich für günstige zellulären Isolierung und Charakterisierung von Immunzellen in DIO-vermittelte Entzündung.

Einleitung

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Maus-Modellen sind weitgehend benutzt worden, um die Dynamik der menschlichen Krankheiten zu studieren. Richtige Isolierung der ansässigen Gewebezellen von Mäusen in einem kranken Zustand kann eine Plattform bieten, für das Verständnis der molekularen und zellulären Beiträge zur Pathogenese einer Krankheit1. Eine Störung, die von entscheidender Bedeutung ist Übergewicht. Die Inzidenz der Adipositas weiter steigen weltweit parallel mit Insulinresistenz und Typ-2 Diabetes Mellitus, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Fettleber2,3. Übermäßiger Konsum Nährstoff ist weiter verzerrt durch verminderte körperliche Aktivität auslösen veränderten Signale aus Fettgewebe, die das zelluläre Milieu von anderen peripheren Geweben wie der Aorta und Leber4verändern können. Solche Störungen der metabolischen Homöostase führt eine chronische niedriggradigen systemischen Entzündung5.

Klassische Aktivierung von Makrophagen wohnhaft sind, um die Aorta und Leber sowie ihre Einstellung zu weißen Fettgewebe (WAT) nachweislich nicht nur Dysregulation von metabolischen Signalen zu initiieren, sondern auch nachhaltig Entzündung6,7. Die phänotypische und funktionelle Heterogenität von Makrophagen ist stark verbunden mit der Entstehung von Übergewicht im Zusammenhang mit Komorbiditäten7. Die dynamische Plastizität in Makrophagen Polarisierung ermöglicht diese Zellen eine Reihe von aktivierten Phänotypen, die das Fortschreiten zu koordinieren und Auflösung der Entzündung8auszustellen. Während klassisch aktivierte Makrophagen (M1) in der Ausbreitung der Entzündung beteiligt sind, wurden Alternativ aktivierte Makrophagen (M2) mit Auflösung und Gewebe Reparatur9,10verbunden.

Wie der Körper metabolische Belastung erfährt, sammelt sich ungewöhnlich weißen Fettgewebe. Das erweiterte Fettgewebe anzieht und behält sich Entzündungszellen, die normalen Adipocyte Funktion zur Förderung der Insulinresistenz, Hyperglykämie und letztlich Typ-2 Diabetes Mellitus, Insulin-Resistenz oder Hyperglykämie11tiefgreifend verändern, 12. Parallel infiltriert weißen Fettgewebe umbaut in Reaktion auf inflammatorische Signale veröffentlicht von klassisch aktivierte (M1) Fettgewebe Makrophagen (ATMs)13,14. Diese mehrzellige Organ übt eine Kaskade von Signalen, die die normale Funktion der anderen Organe des Körpers wie die Aorta und Leber4entgleist.

Die Leber ist eine metabolische Kraftwerk, das als Reaktion auf Reize aus nahe gelegenen Dysregulated WAT15passt. Hepatische Makrophagen oder Kupffer Zellen als Reaktion auf metabolische Veränderungen, sezernieren inflammatorischen Zytokinen, die beide parenchymatösen verwandeln und nicht parenchymatösen Zelle Phänotyp und fördern Gewebe umgestaltet. Hepatische Lipid Akkumulation, Entzündung, übermäßige extrazelluläre Matrix Einlagen, Nekrose und eventuelle Funktion Verlust folgt die entzündlichen Beleidigungen beitragen, das breite Spektrum der Leberschäden im Zusammenhang mit nicht-alkoholische Fettleber 16,17,18.

Parallel zu kompromittierten WAT und Leberfunktion akkumulieren große Arterien Lipiden in der Arterienwand, wie der Körper chronischer metabolischer Stress19 erfährt. Arterielle Lipid Ansammlung löst die Sekretion von Chemokinen durch aktivierten Endothelzellen und spätere Rekrutierung von Monozyten20. Einmal eingestellt, vermehren Monozyten, differenzieren, Lipoproteine aufnehmen und zu Schaumzellen. Atherogenese initiiert und getragen von der Pro-inflammatorischen Aktivität von rekrutiert und Gewebe resident Lipid-beladene Makrophagen. Die extrazellulären und intrazellulären Stress-Signale weitergeleitet in diesem atherogenic Mikroumgebung erliegen, diese Makrophagen dann in eine Signalkaskade Apoptotic engagieren. Wenn diese Schaumzellen sterben, tragen sie ihre Lipid gefüllt Inhalte zum nekrotischen Kern der Läsion, die dann zu Plaque Ruptur, Herzinfarkt und Schlaganfall führt.

Die Heterogenität der Makrophagen Phänotypen orchestriert Kollektiv, teilweise die Adipositas induziert durch entzündliche Veränderungen in Dysregulated Gewebe wie WAT, Leber und Aorta8,21. Charakterisierung von rekrutiert und resident Gewebe Makrophagen konnte Einblick in mögliche molekulare Targets, die Makrophagen Phänotyp1bearbeiten. Um Makrophagen von Adipositas-induzierte entzündetem Gewebe effektiv zu charakterisieren, erhalten Sie eine einzellige Suspension durch enzymatische Verdauung. Solche Protokolle Dissoziation müssen ausreichend erniedrigende Bindegewebe bei gleichzeitiger Minimierung immun Zelltod und bietet optimale Zellausbeute wirksam. Die Enzym-Mischung ist abhängig von der Art des Gewebes und seiner strukturellen Make-up. Elastische Gewebe wie der Aorta erfordert stärkere enzymatische Aktivität im Vergleich zu der Leber und WAT Gewebe Dissoziation zu erreichen. Aus der Einzelzelle Suspension können Gewebe resident Makrophagen eindeutig gekennzeichnet oder isoliert für weitere nachgelagerte Analysen wie transkriptionelle Profilierung.

Hier ist eine gewebespezifische Protokoll beschrieben, die Kollagenase-abhängige Gewebe Verdauung und polychromatische Durchflusszytometrie verwendet, um effektiv zu isolieren und zu charakterisieren Gewebe-Bewohner Makrophagen aus traditionellen Ernährung induzierten Adipositas gewonnen, Arteriosklerose, einfache Steatose und Steatohepatitis Mausmodellen. Gleichzeitige Färbung der Zelle Oberflächenmarker mit Antikörpern gegen Leukozyten-(CD45 und/oder CD11b) und Makrophagen - spezifische Antigene (F4/80) wird häufig verwendet um Makrophagen Populationen22zu identifizieren. Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) ist eine wirkungsvolle Strategie verwendet, um diese identifizierten Populationen in hoher Reinheit zu sortieren. Die sortierte Bevölkerung kann dann für Phänotyp spezifischen Gen-Profile mit nachgeschalteten molekulare Analyse (z. B. quantitative Real-Time Polymerase-Kettenreaktion)23ausgewertet werden. Obwohl standard Durchflusszytometrie und Flow Cytometry-basierte Zellsortierung mächtige Werkzeuge in Makrophagen in einem stark heterogenen Zellsuspension zu unterscheiden sind, müssen der ehemaligen Protokolle optimiert werden, um erfolgreichen Ausgang zu gewährleisten. In dieser Studie sind Protokolle, die effektiv zu isolieren und zu charakterisieren bestimmte tragfähige Gewebe Makrophagen beschrieben; noch wichtiger ist, bietet diese Studie entscheidende Einblicke in technische Probleme, die häufig sowie proaktive und Fehlersuche Strategien zu verhindern bzw. zu lösen auftreten.

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Protokoll

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Alle experimentelle Protokolle (Abschnitte 1, 1.2 und 1.3) stimmten mit den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) an der Pennsylvania State University.

GewebeDissoziation-Puffer-VorbereitungEndvolumenLagerung
Weißen Fettgewebe (WAT) Dissoziation Puffer: 2,5 % HEPES, 10 mg/mL Rinderserumalbumin (BSA), 3 mg/mL (0,3 %) Kollagenase Typ II in Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) mit 4,5 g/L Glucose ohne L-Glutamin und Natrium Pyruvat500 mLminus 80° C (10 mL Aliquote)
Leber 25 x Perfusion Puffer Konzentrat (PBC): 3,55 M NaCl, 168 mM KCl, destilliert 240 mM HEPES, 150 mM NaOH in entionisiertem H2O500 mLminus 20° C (40 mL Aliquote)
Erhaltung-Puffer (PRB): 1 % BSA in 1 x Perfusion Puffer1 L4 ° C
Dissoziation Puffer: 1 x Perfusion Puffer ergänzt mit 4,76 mM CaCl2 und 72 U/mL Kollagenase Typ IV50 mL (per Mausklick)Bereiten Sie unmittelbar vor der Verwendung
Aorta Dissoziation: 125 U/mL Collagenase Puffertyp XI, 60 U/mL Hyaluronidase Typ I, 60 U/mL DNase I, 450 U/mL Kollagenase Typ I, 20 mM HEPES 1 x Phosphat Buffered Saline (PBS)500 mLminus 80° C (10 mL Aliquote)

Tabelle 1: Gewebe spezifische Perfusion Puffer Rezepte.

(1) Gewebe isoliert und Dissoziation

  1. WAT Isolation und Dissoziation
    1. Bereiten Sie die gewebespezifischen Puffer gemäß Tabelle 1, und speichern sie wie beschrieben.
    2. Die folgenden Reagenzien vorzubereiten.
      1. Bereiten Sie die Verdauung Puffer durch Auftauen das entsprechende Volumen der WAT Dissoziation Puffer und Speicher bei 4 ° C bis zur Verwendung. Unmittelbar vor dem Gebrauch warm Puffer auf 37 ° C. Vorbereiten des FACS-Puffers durch die Vorbereitung 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), enthält 2 % fetalen bovine Serum (FBS).
    3. WAT-Isolation
      1. Eine Maus in einem Kohlendioxid (CO2) gefüllt-Kammer einschläfern. Suchen Sie nach Wirksamkeit vor der Dissektion Bühne weiter.
      2. Tauchen Sie die euthanasierten Maus kurz in einen Becher mit 70 % igem Ethanol bis gründlich eingeweicht und mit Ethanol beschichtet. Legen Sie die Maus ventralen Oberfläche nach oben auf der Bühne der Dissektion und befestigen Sie Maus Vorder und Hinterpfoten die Dissektion gegenüber mit 21 G Nadeln.
      3. Verwenden Sie mittlerer Punkt Spitze Pinzette, um die Bauchhaut anterior der Harnröhrenöffnung zu erfassen, dann verwenden Sie scharfen sezierenden Schere um einen Nick in der erfassten Bauchhaut.
      4. Der kleine Schnitt zwischen Haut und Bauchfell Untermesser der Schere einfügen und einen seitlichen Schnitt aus Bauch, den Brustkorb zu machen.
      5. Ziehen Sie vorsichtig wieder die Haut um die intakte Bauchhöhle aufzudecken und machen einen seitlichen Schnitt durch das Peritoneum und entweder Klappen Sie die transparente Membran oder Verbrauchsteuern das Gewebe um den Bauch WAT verfügbar zu machen.
      6. Die Perigonadal Fettpölsterchen zu sammeln, wie in Mann Et Al. beschrieben 24
        1. Die Perigonadal Fettpölsterchen bei männlichen Mäusen sind locker an den Nebenhoden und Hoden gebunden. Zuerst suchen Sie die Hoden mit mittlerer Punkt Zange, erfassen von den Nebenhoden Kopf halten und ziehen.
        2. Mit scharfen sezierenden Schere, Verbrauchsteuern Sie jedes epididymal Fettpolster durch Schneiden entlang der Oberfläche des Nebenhodens (Kopf, Körper und Heck) und den Hoden.
        3. Ziehen Sie mit der Zange vorsichtig auf die Fettpolster, während schneiden durch das Bindegewebe direkt an die Nebenhoden Struktur gebunden.
        4. Mit der Pinzette, greifen Sie fest zum Jahresende Fettlappen proximal zu den Nebenhoden und schälen Sie vorsichtig Fettpolster Weg von den Keimdrüsen
        5. Bei weiblichen Mäusen sind die Fettpölsterchen Perigonadal lose Bindung an den Körper der Gebärmutter und uterine Horn.
        6. Mit mittlerer Punkt Pinzette, greifen Sie das Perigonadal Fettgewebe und ziehen Sie vorsichtig das Gewebe vom Körper der Gebärmutter und uterine Horn.
        7. Verbrauchssteuern Sie jedes Fettpolster durch Schneiden entlang der Gebärmutter Körper und uterine Horn mit scharfen sezierenden Schere.
      7. Legen Sie das Fett Pads in einer Petrischale gefüllt mit PBS und halten Sie auf dem Eis, Gewebe feucht zu halten.
    4. Dissoziation von WAT in einzelnen Zellsuspensionen
      1. Entfernen Sie überschüssige PBS aus der Petrischale und verwenden Sie eine einzelne Kante Rasierklinge um den Bauch WAT in kleine Stücke hacken.
      2. Kratzen Sie mit der scharfen Kante der Rasierklinge sanft die Hackfleisch / Bauch WAT in eine beschriftete 15 mL Polypropylen Sammelröhrchen mit 2 mL WAT Dissoziation Puffer.
      3. Inkubieren Sie diese Gewebe-Verdauung Puffer Mischung unter langsame kontinuierliche Rotation bei 37 ° C für 45 min.
      4. Filtern der verdauten Gewebes durch ein Sieb 70 µm Zelle in ein 50 mL Sammelröhrchen während der Bewegung des Kautschuk-Kolbens von einem Spritzenkolben in einer kreisförmigen Bewegung und weiterhin die Zellsuspension durch den Filter Sieb.
      5. Pipettieren 2 mL Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM) an eine 15 mL Sammelröhrchen sanft Pipettieren rauf und runter und waschen Sie den Filter mit der Single-Zellsuspension.
      6. Waschen Sie den Filter zwei weitere Male mit kalten DMEM und die einzelnen Zellsuspension auf Eis.
      7. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 X g bei 4 ° C für 8 min.
      8. Verwenden einer Vakuum-Sauger vorsichtig schwimmende Adipozyten (zunächst) entfernen und verbleibende Überstand. Achten Sie darauf, nicht die gebeizte Stromazellen vaskulären Bruch (SVF) stören.
      9. Aussetzen Sie mit einer 1.000 µL Pipette sanft wieder, das Pellet in Ammoniumchlorid-Kalium (ACK) Puffer zur lyse der Erythrozyten nach den Anweisungen des Herstellers.
      10. Verdünnen Sie die oben genannten Zellsuspension mit DMEM und Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 g bei 4 ° C für 8 min.
      11. Wieder aussetzen Zellen in kaltem PBS mit 2 % FBS (FACS-Puffer) und zählen Sie die Zellen in einem Burker Kammer/Hemocytometer.
      12. Übertragen Sie entweder 1 x 106 Zellen (für grundlegende Durchflusszytometrie) oder die gesamte Zellsuspension (für FACS) 5 mL Rundboden Polystyrol Rohre zu kennzeichnen. Weiter zu Abschnitt 2 für Durchflusszytometrie Färbeprotokoll.
  2. Lebergewebe isoliert und Dissoziation
    Hinweis: Dieses Protokoll wurde von Smedsrød25.
    1. Bereiten Sie die gewebespezifischen Puffer gemäß Tabelle 1 und aufbewahren Sie, wie beschrieben.
    2. Die folgenden Reagenzien vorzubereiten.
      1. Bereiten Sie 1 X Perfusion Puffer (PB), durch Verdünnung 40 mL der PBC in 960 mL Reinstwasser H2O. Pre Warm pro Spritze mit 50 mL PB bei 37 ° C gefüllt kurz vor Perfusion. Vermeiden Sie Luftblasen vorhanden.
        1. Um Luftblasen zu beseitigen, invertieren Sie die Spritze, wo die Leur Sperre Spitze nach oben zeigt. Tippen Sie oder streichen Sie die Spritze bis Luftblasen auf der obersten Pf die Spritze. Schieben Sie den Kolben in die Luft zu vertreiben
      2. Vorbereitung den Verdauung Puffer durch Verdünnung 0,5 mL 476 mm CaCl2 -Lösungbis 49,5 mL 1 x Perfusion Puffer. Die 4,76 mM CaCl2 -Lösung PB 3600U Kollagenase Typ IV hinzufügen. Wärmen Sie eine Spritze gefüllt mit 50 mL des Puffers Verdauung bei 37 ° C kurz vor Perfusion vor. Beseitigen Sie Luftblasen vorhanden, wie in Schritt 1.2.2.1.1 beschrieben.
      3. Bereiten Sie die Erhaltung Puffer (PRB) durch Auflösen von 2,5 g Rinderserumalbumin (BSA) in 250 mL 1 X Perfusion Puffer. Bei 4 ° C lagern Sie oder halten Sie auf dem Eis bis zur Verwendung.
      4. FACS-Puffer mit 1 X PBS und 2 % FBS vorzubereiten.
    3. Lebergewebe isoliert
      1. Einschläfern Sie eine Maus durch CO2 ersticken, sättigen Sie Maus mit 70 % Ethanol, Kontamination von intraabdominellen Organe mit Fell zu verhindern.
      2. Position der Maus Bauchseite bis auf Polystyrol Schaum sezieren Board und sichern die Maus Vorder- und Hinterbeine Pfoten die Dissektion gegenüber mit 21 G Nadeln.
      3. Um die Thoraxwand und Bauchhöhle verfügbar zu machen, greifen Sie die Bauchhaut in der Nähe der Harnröhrenöffnung mit einem mittleren Punkt Spitze Pinzette. Verwenden Sie dann einen scharfen sezierenden Schere zum einen kleinen Schnitt an der erfassten Bauchhaut zu erstellen.
      4. Untermesser der Schere in der kleine Schnitt zwischen Haut und Bauchfell und einen seitlichen Schnitt von der Leiste bis zum Kinn.
      5. Ziehen Sie vorsichtig wieder die Haut zu entlarven die intakte Bauchhöhle und Thoraxwand, machen einen seitlichen Schnitt durch das Peritoneum und Verbrauchsteuern die Membran.
      6. Heben Sie das Brustbein und sorgfältig einzuschneiden Sie das Zwerchfell, achten Sie darauf, nicht zu der unteren Hohlvene (IVC) stören. Bewegen Sie die gastro-intestinalen Organe zur Seite, und suchen Sie die subhepatic IVC. Verwenden Sie blutstillende Zange um Suprahepatic IVC lokalisierte Perfusion zu spannen.
        Hinweis: Übermäßige Ansammlung von weißen viszeralen Fettgewebe kann oft die IVC maskieren. Um dieses Schiff besser zu visualisieren, kann ein kleiner Bereich des Fettgewebes neben der IVC herausgeschnitten werden. Das eingeschnittene Fenster innerhalb der biegsamen Fettgewebe kann dann über die IVC, das Schiff für Kanülierung aussetzen positioniert werden.
      7. Legen Sie die Spritze gefüllt mit vorgewärmten PB auf die 23 G Blut Sammlung und Infusion. Drücken Sie vorsichtig auf den Kolben, bis der Schlauch und Nadel mit PB gefüllt sind.
      8. Setzen Sie die 23 G-Nadel, parallel zur Ebene des subhepatic IVC. Sichern Sie die Nadel mit einer 4 cm blutstillende Klemme.
        Hinweis: Kanülierung der Subhepatic, die IVC bei Diät gefütterten Mäusen bevorzugt wird, insofern als die IVC besser sein kann visualisiert und kanülierte innerhalb des Hohlraums mit Fett gefüllt.
      9. Schieben Sie den Kolben Perfusion beginnen, Farbe wird schnell Spülen aus der Leber (rechter Lappen zuerst) wenn die Nadel in das Gefäß entsprechend positioniert ist. Erweiterung der Lappen ist auch sichtbar, wenn die Nadel richtig in die subhepatic IVC eingesteckt ist.
      10. Schneiden Sie prompt die Pfortader damit die PB frei durch die Leber fließen kann.
      11. Durchspülen Sie die Leber, bis Blut nicht mehr sichtbar ist. Massieren Sie gelegentlich Leber Lappen zwischen Vordergrund-Finger und Daumen Perfusion zu erleichtern.
        Hinweis: Es ist wichtig, nicht gezahnt stumpfen scharfkantigen Werkzeuge verwenden, um die Leber um Gewebeschäden zu vermeiden zu behandeln.
      12. 5 mL PB in der Spritze bleibt, ändern Sie in der Spritze mit vorgewärmten Dissoziation Puffer gefüllt. Stören Sie die Position der gesicherten Nadel während dieser Zeit nicht.
        Hinweis: Vergrößerte Leber, die deutlich über 1,5 g mit einem größeren Volumen von vorgewärmten Verdauung Puffer garantieren erfolgreiche Leber Dissoziation durchblutet werden sollte.
      13. Durchspülen der Leber bis vollständig verdaut. Massieren Sie Leber Lappen um die Durchblutung zu erleichtern.
        Hinweis: Trennung Glissons Kapsel aus Parenchym ist zu beobachten, in der erfolgreich verdaute Leber. Um dies zu beurteilen, verwenden der stumpfen Kante eines Paares von Zangen, sanft auf der linken seitlichen Lappen drücken. Ein Bild sollte erscheinen auf der Oberfläche und die Einrückung sollte langsam füllen, sobald die Zange entfernt wird.
      14. Entfernen Sie die Nadel aus der subhepatic IVC. Entfernen Sie nicht die blutstillende Zange spannen Suprahepatic IVC.
      15. Die gesamte Leber durch sorgfältig durch die Verbindung der Bänder mit einer kurzen geraden Klinge Präparierscheren schneiden Verbrauchsteuern und die Gallenblase zu entfernen.
      16. Legen Sie die gesamte Leber in einer 10 cm Petrischale mit 10 mL eiskaltes Erhaltung Puffer und Speicher auf 4 ÜberprüfungenC bis bereit, um Zellen zu befreien.
    4. Leberzelle Dissoziation
      1. Übertragen Sie die Leber auf eine 10 cm Schale mit 10 mL eiskaltes DMEM.
      2. Fassen Sie den abgetrennten Suprahepatic IVC die ausgeschnittenen Leber mit einem gezahnten Zangen befestigt. Verwenden Sie mittlerer Punkt Zange, die Zellen aus der Glisson Kapsel freizugeben, indem Sie streicheln Eilgang auf jeder Lappen.
      3. Ein 70 µm Zelle Sieb angebracht zu einem Sammelrohr 50 mL durchlaufen Sie gesättigte DMEM.
      4. Pipettieren 10 mL eiskaltes DMEM 10 cm Petrischale und wiederholen Sie die Schritte 1.2.4.1. zu 1.2.4.3 bis Medien Sättigung nicht mehr eingehalten werden. Ort der Zellsuspension auf Eis oder bei 4 ° C.
      5. Vorsichtig mischen die Zellsuspension durch invertieren das Sammelröhrchen und anschließend Zentrifugieren bei 54 X g für 2 min bei 4 ° C.
      6. Den Überstand in ein sauberes 50 mL Sammelrohr zu sammeln. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 54 X g für 2 min bei 4 ° C.
      7. Wiederholen Sie Schritt 1.2.4.6. zwei weitere Male, bevor Sie mit Schritt 1.2.4.8.
      8. Den Überstand auf eine saubere 50 mL-Sammelröhrchen übertragen und Zentrifugieren der Zellsuspension bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C.
      9. Re nicht parenchymatösen Zelle Pellet in FACS Puffer und in ein Burker Kammer/Hemocytometer zu zählen.
      10. Übertragen Sie 1 x 106 Zellen (für grundlegende Durchflusszytometrie) oder 15 x 106 - 20 x 106 Zellen (FACS) auf 5 mL Rundboden Polystyrol Röhrchen beschriftet. Weiter zu Abschnitt 2 für Durchflusszytometrie Färbeprotokoll.
  3. Aorta Isolation und Dissoziation
    Hinweis: Dieses Protokoll wurde vom Metzgeret al.26
    1. Bereiten Sie die gewebespezifischen Puffer basierend auf den in Tabelle 1 enthaltenen Rezepte zu und aufbewahren Sie, wie beschrieben.
    2. Die folgenden Reagenzien vorzubereiten.
      1. Bereiten Sie die Verdauung Puffer durch Auftauen das entsprechende Volumen der WAT Dissoziation Puffer und Speicher bei 4 ° C bis zur Verwendung. Unmittelbar vor dem Gebrauch warm Puffer auf 37 ° C.
      2. Bereiten Sie eine 10 X Heparin-Lösung durch Auflösen von Heparin Natriumsalz in 1 X PBS in einer Konzentration von 200 U/mL. Verdünnen Sie die 10 x Heparin-Stammlösung mit 1 X PBS, 1 x Heparin-Lösung vorzubereiten. 10 X und 1 x Heparin Lösungen bei 4 ° C bis zur Verwendung aufbewahren.
      3. Vorbereiten der FACS-Puffer mit 1 X PBS mit 2 % FBS.
    3. Aorta Dissektion
      1. Eine Maus in einer Kammer Kohlendioxid gefüllt und mit 70 % igem Ethanol spülen einschläfern.
      2. Legen Sie die Maus Bauchseite nach oben auf der Bühne der Dissektion, verbreiten Sie Maus Vorder und Hinterpfoten zu und die Dissektion gegenüber mit 21 G Nadeln befestigen.
      3. Unmittelbar nach dem euthanizing der Maus ausführen Herzpunktion. Beziehen sich auf Schritte 1.3.3.4, 1.3.3.9, falls erforderlich.
      4. Suchen Sie das Xiphoid Prozess am unteren Ende des Brustbeins
      5. Dazu legen Sie einen Finger Mittelpunkt entlang der Breite der Hals des Tieres. Verfolgen Sie entlang der ventralen Mittellinie vom Hals bis zum kaudalen Ende des Brustbeins bis eine knorpelige Erweiterung zu spüren ist.
      6. Verwenden Sie mittlerer Punkt Zange, um die knorpelige Erweiterung zu erfassen und ggf. Markieren Sie die Position des Xiphoid Prozesses durch das Entfernen des Patches von Haar oder Haut im Bereich.
      7. Teilweise Nadel 26 G unter dem Xiphoid Prozeß in 20-30°-Winkel.
      8. Leicht negativen Druck auf die Spritze durch den Kolben langsam zurückziehen, dann stechen Sie die Nadel weiter in den Hohlraum bis Blut fließt.
      9. Wenn der Blutfluss stoppt, drehen Sie die Nadel oder bewegen Sie langsam etwas in und heraus.
      10. Verwenden Sie das Paar der Zange zu greifen die Bauchhaut anterior Harnröhre halten öffnen und verwenden einen scharfen sezierenden Schere entlang der ventralen Mittellinie durch das Bauchfell von der Leiste bis zum Kinn geschnitten.
      11. Ziehen Sie die Haut, die Bauchorgane und Brustkorb mit Fingern aussetzen oder stumpfen Pinzette vorsichtig Bauchorgane zur Seite bewegen.
      12. Verwenden Sie die Zange greifen des Xiphoid-Prozesses halten heben das Brustbein und Einschneiden des Zwerchfells.
      13. Mit der sezierenden Schere, Schnitt durch die seitlichen Rippen auf beiden Seiten. Greifen des Brustbeins, drehen Sie den Brustkorb nach oben und durch die verbindende Basis geschnitten. Entfernen Sie den Brustkorb, die Freilegung der zugrunde liegenden thorakalen Organe.
      14. Durchspülen der Aorta mit einer 26-Gauge Nadel eine 10 mL-Spritze gefüllt mit 1 x Heparin-Lösung durch die Injektion von 1-2 mL der Lösung in den linken Ventrikel (LV) des Herzens.
        Hinweis: Achten Sie darauf, mit einer niedrigen Übertragungsrate mit wenig Druck darauf intakte atherosklerotische Läsionen Aorten durchspülen.
      15. Verbrauchsteuern Sie, Thymus, Lungen und Bindegewebe. Beziehen sich auf Schritte 1.3.3.16 und 1.3.3.17, falls erforderlich.
        1. Anterior Herzen zu finden, der weiße Bi-gelappt (oder Schmetterling geformt) Orgel und fest greifen Halt des Thymus mit der Zange. Beide Lappen von der Kavität nach oben ziehen und an der Basis mit der Schere ausschneiden.
        2. Um die Lunge zu entfernen, drücken Sie ein Lungenflügel mit der Zange, ziehen Sie das Gewebe von der Brusthöhle und Schneiden an der Basis. Wiederholen Sie für jeden verbleibenden Lappen.
      16. Verwenden Sie eine Dissektion Mikroskop und Mikro-sezieren Werkzeuge und sammeln die Aortenklappe (einschließlich der Innominate Arterie, linke gemeinsame Halsschlagader und linken subclavia), Bogen der aufsteigend, absteigend, thorakalen und abdominalen Aorta.
        1. Suchen Sie die Aorta ascendens auf dem linken Ventrikel des Herzens.
        2. Mit ein paar gebogene 0,07 x 0,04 mm-Tipp greifen Zange vorsichtig den Teil der Aorta ascendens aus der linken Herzkammer.
          Hinweis: Im Vergleich zu den umliegenden gelb gefärbten Fettgewebe, wird die Aorta eine helle weiße Schiff aus der LV, wenn ausreichend mit der Heparin-Lösung gespült werden.
          1. Wenn die Aorta durch kardiale Perfusion nicht richtig gespült wurde, spülen Sie die Aorta wieder während die Aorta in die Kavität verbunden bleibt. Dazu schneiden Sie in der Nähe der Herz-Aorta-Kreuzung, entfernen Sie Herzen zu und dann horizontal durchschneiden Sie die Low-End der Bauchschlagader. 26 G Nadel in die Öffnung der Aorta ascendens und sanft spülen der Aorta mit 1 x Heparin-Lösung.
          2. Ziehen Sie vorsichtig, auf die Aorta ascendens, besser zwischen dem Fettgewebe und eingebettete Aorta zu unterscheiden.
          3. Noch leichtes Ziehen an der Aorta ascendens, mit der Spitze eines geschlossenen Frühling Präparierscheren, um das Fett, das die aufsteigende Aorta und Aortenbogen Kapseln zu löschen. Um dies zu tun, streicheln Sie das Fettgewebe mit der Spitze des geschlossenen Schere Messer das verbindende Fett losreißen.
            Hinweis: Verzichten Sie besteuert jeder Fettgewebe durch Schneiden bis die aufsteigende Aorta und Bogen übersichtlich visualisiert werden können. Dies soll verhindern, dass die Aorta schneiden.
          4. Verwenden Sie die aufsteigende Aorta und Bogen deutlich aus dem Fettgewebe Surround abgegrenzt werden können, Frühjahr Präparierscheren, um überschüssiges Fett Verbrauchsteuern.
          5. Behutsam fasse sie der Aortenbogen mit der Zange. Wieder mit der Feder Schere Spitze, Strich am Fett entlang der Länge der absteigenden, thorakalen und abdominalen Aorta am kaudalen Ende der Bauchschlagader, auf der rechten Seite der Hülse von Fett.
          6. Weiter entlang der Aorta zu erfassen, wenn das Fett Weg zu reißen. Achten Sie darauf, so sanft tun, um zu verhindern, dass die Aorta zu beschädigen.
          7. Ziehen Sie vorsichtig die Aorta nach oben in Richtung des Mikroskops, so dass das Fett jetzt hinter der Aorta positioniert ist.
          8. Einfügen Sie die geschlossenen Schere Messer zwischen die Fett-Aorta-Schnittstelle am vorderen Ende der absteigenden Aorta, schwere das Fettgewebe Anlage an der Aorta Oberfläche stumpf mit einer schwungvollen Bewegung.
            Hinweis: Gründlich entfernen überschüssiges Fett und Gewebe zu verbinden, während die Aorta noch innerhalb des Hohlraums ist empfiehlt sich.
          9. Verbrauchsteuern Sie Herzen und am kaudalen Ende der Bauchschlagader quer geschnitten. Entfernen Sie die gesamte Aorta.
          10. Legen Sie die Aorta in einer 35-mm-Schale und entfernt necken Sie überschüssiges Fett auf der Aorta mit zwei 21-Gauge Nadeln zu. Legen Sie die ausgeschnittene Aorta in 1,7 mL Microcentrifuge Schlauch auf Eis.
    4. Dissoziation der Aorta in einzelnen Zellsuspensionen
      1. Pipettieren 0,2 mL Aorta Dissoziation Puffer, das Rohr mit der Aorta. Legen Sie die Frühling Scheren Messer in Richtung das spitz zulaufende Ende des Rohres und schnell Zerkleinern der Aorta zur enzymatischen Verdauung zu erleichtern.
      2. Übertragen Sie die Gewebe-Lösung-Mischung in einen 15 mL Sammlung Rohr- und Pipette 1,8 mL Aorta Dissoziation Puffer für ein Gesamtvolumen von 2 mL.
        Hinweis: Für den problemlosen Austausch der Gewebe-Suspension, schneiden Sie die 1 cm das verjüngte Ende des einen standard 1.000 µL Pipettenspitze ab. Verwenden Sie die verkürzte Spitze, um das Fahrwerk mit einer Mikropipette übertragen.
      3. Inkubieren Sie die Hackfleisch / Aorta in die Aorta Dissoziation Puffer 55 Minuten bei 37 ° C, bei 220 u/min (0.514 x g) schütteln.
      4. 50-µm-Zelle-Sieb durchlaufen Sie die Suspension in einem 15 mL Polypropylen Sammelröhrchen. Verwenden des Kautschuk-Kolbens von einem Spritzenkolben Filterung zu erleichtern.
      5. Spülen Sie das Sammelröhrchen 15 mL mit 1 mL FACS-Puffer, sammeln Sie die Aussetzung und die Zelle Sieb passieren.
      6. Waschen Sie die 50 µm Zelle Sieb zwei weitere Male mit 1 mL FACS Puffer.
      7. Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 300 X g für 5 min bei 4 ° C. Wieder aussetzen Sie-Zellen in kalten FACS-Puffer. Zählen der Zellen in einem Burker Kammer/Hemocytometer.
      8. Übertragen Sie 1 x 106 (für grundlegende Durchflusszytometrie) Zellen oder die gesamte Zellsuspension (für FACS) auf einem beschrifteten 5 mL Rundboden Polystyrol Rohre. Weiter zu Abschnitt 2 für Durchflusszytometrie Färbeprotokoll.

(2) flow Cytometry und FACS Färbung

FluorophorR-Phycoerythrin (PE)PE/Cyanin (Cy) 7PE/Cyanin (Cy) 5Pacific Blue (PB)
Laser (nm)Blau (488 nm) / gelb (561-570 nm) - grün (532 nm)Blau (488 nm) / gelb (561-570 nm) - grün (532 nm)Blau (488 nm) / gelb (561-570 nm) - grün (532 nm)Violett (405 nm)
ErregungMAX (nm)496496496401
EmissionMAX (nm)578785667455
Phänotypischer MarkerF4/80CD11cCD11bCD45
EMR1, Ly71ΑX Integrin Integrin αX Kette, CR4, p150, ITGAXΑM Integrin, Mac-1, Mo1, CR3, Ly-40, C3biR, ITGAMT200, Ly-5, LCA
Gezielte ZelltypResident Gewebe Makrophagen(M1) klassisch aktivierte MakrophagenMonozyten / MakrophagenLeukozyten (Makrophagen / Monozyten, Lymphozyten und Granulozyten)
Teilmenge von dendritischen ZellenDendritische Zellen, NK-Zellen, aktiviert T-Zellen und eine Teilmenge der intestinalen intraepitheliale Lymphozyten (IEL)Teilmengen von T- und B-Zellen, Granulozyten, dendritische Zellen und NK-Zellen
Verdünnungsfaktor01:501: 1001: 1001: 100
Isotype KontrollenPE Ratte IgG2aPE/Cy7 armenischen Hamster IgGPE/Cy5 Ratte IgG2bPacific Blue Ratte IgG2c

Tabelle 2: Liste der Fluorophor getaggt Antikörper spezifisch für anspruchsvolle Gewebe resident Makrophagen.

  1. Sammeln und bereiten Sie die folgenden Elemente: FACS Puffer 5 mL Rundboden Polystyrol Rohre, Anti-Maus-CD16/32 Fc-Rezeptor blockieren Antikörper, Fluorophor konjugiert oder unkonjugierten Primärantikörper, Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper (If erforderlich), 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
    Hinweis: Für große Mengen von Zellen beflecken, ist Antikörperkonzentration kritischste statt Handynummer. Beispielsweise wenn Färbung 10 x 106 die Färbung Puffervolumen Zellen und Antikörperkonzentration gleich sein sollte, als ob Färbung 1.0 x 10 Zellen6 in 100 µL Puffervolumen. Zum Beizen 1.0 x 108 Zellen, Erhöhung der Antikörper-Menge 5-Fach wird empfohlen.
  2. Jedes FACS-Rohr zusätzliche eiskalte FACS-Puffer hinzu, falls erforderlich, pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 751 X g für 5 min (4 ° C). Aspirieren Sie der Überstand folgende Zentrifugation.
  3. Fügen Sie Anti-Maus-CD16/CD32 Fc-Rezeptor blockieren Antikörper gegen alle Proben entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Inkubieren Sie für 15 min bei 4 ° C oder auf Eis.
  4. Fügen Sie Fluorophor konjugiert Primärantikörper cocktail direkt an den Fc-Rezeptor blockierende Antikörper enthaltende Zelle Aussetzung und inkubieren Sie Proben bei 4 ° C für 30 min. Protect Proben vom Licht zum Bleichen von Fluorophor-konjugierten Antikörpern zu minimieren.
    1. Im Falle unconjugated Primärantikörper verwendet wurden, gehen Sie folgendermaßen vor nach Abschluss von Schritt 2.4.
    2. Wash Primärantikörper gefärbten Proben durch Zentrifugation bei 751 X g für 5 min (4 ° C).
    3. Entfernen Sie überstand durch Dekantieren und wieder auszusetzen Sie Pellet in 100 µL FACS Puffer.
    4. Alle notwendigen Proben konjugierten Sekundärantikörper hinzu und 30 min bei 4 ° c inkubieren Fahren Sie mit Schritt 2.5.
  5. Folgende Antikörper Inkubationszeit, fügen Sie 2 mL Eis kalt FACS Puffer dann pellet-Zellen bei 751 X g für 5 Minuten (4 ° C). Abgießen Sie überstand und achten Sie darauf, nicht zu Pellets zu stören.
  6. Zellen vorsichtig mischen und mit 200-400 µL FACS Puffer wieder aussetzen dann halten Sie dies im Dunkeln bei 4 ° C bis standard Flow Cytometry-Analyse oder Zellsortierung.
  7. Fahren Sie für kurzfristige Fixierung der gefärbten Zellen mit Schritte 2,8 bis 2.10. Verwenden Sie Fixierung für standard Durchflusszytometrie nur.
  8. Unmittelbar nach Schritt 2.5 wieder auszusetzen, Zellen in 0,5 mL 2-4 % Paraformaldehyd (PFA) für 15-30 min bei 4 ° C.
    Hinweis: Vorsicht: PFA ist ein bekanntes Ärgernis mit Karzinogenen und toxischen Wirkungen. Bei der Verwendung von PFA mit äußerster Sorgfalt zu behandeln. Achten Sie darauf, die geeignete persönliche Schutzausrüstung benutzen und Absaugung.
  9. Folgenden Fixierung waschen Zellen durch Zugabe von 2 mL FACS Puffer auf alle Proben und Zentrifugieren bei 751 X g bei 4 ° C für 5 min. entfernen überstand folgende Zentrifugation.
  10. Aufschwemmen Sie feste Zellen in 200 µL Eis kalt FACS-Puffer und Speicher bei 4 ° C. Shop Update Zellen bis zu 1 Woche bei 4 ° C, im Idealfall führen Flow Cytometry Erwerb innerhalb von 48 Stunden, Autofluoreszenz zu minimieren.
  11. Erwerben Sie Flow Cytometry Daten gemäß Anweisungen des Herstellers Flow Cytometer oder führen Sie fluoreszierende aktivierte Zellsortierung wie von Basu Et al.beschrieben. 23

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bei der Verwendung von Apolipoprotein E mangelhaft (ApoE KO) C57BL/6 (BL6) Mäuse auf einem hohen Fett hohe Cholesterin-Diät (HCHFD oder HCD) für 18 Wochen, 1 x 10-4 - 2 x 104 CD45 gepflegt+F4/80+ Aorten Makrophagen können isoliert werden, wenn zwei Proben zusammengefasst. Lebern von HFHCD gefütterten ApoE KO Mäusen seziert produziert größer als 5 x 105 sortiert Kupffer Zellen (die Sortierung zur Verfügung stehende Zeit abhängt). Wenn ...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diät-induzierten Stoffwechselstörung Modelle, die Komorbiditäten wie Atherosklerose, einfache Steatose, Steatohepatitis zu imitieren und Typ-2-Diabetes, sind weitgehend verwendet, um die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der Progression der Erkrankung besser zu verstehen. Kollagenase abhängigen Verdauung wird häufig verwendet, Gewebe, Zellen aus der extrazellulären Matrix (ECM)16,27zu befreien zu distanzieren. Enzyme wie Kollagenase stören Kollagen die s...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autoren haben keine Interessenskonflikte offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir möchten den Flow Cytometry Core Facility in The Pennsylvania State University Millennium Science Complex danken.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
26 G x 5/8 Zoll NadelnBD305115
23 G x 0,75 Zoll Nadel x 12 Zoll Schlauch BlutentnahmesetBD367297Wird zur Kanülierung von subhepatischer IVC während der Leberperfusion
verwendet 21 G 1 1/2 Zoll NadelnBD305156
1 mL Spritze mit GummistoppsBD309659
10 mL SpritzenBD309604
1 mL SpritzeBD309659
F4/80 PEBiolegend123110
CD11c PE/Cy7Biolegend117318
CD11b PE/Cy5eBioscience15-0112-81
Anti-Maus CD16/32 Fc-Block Biolegend101320
CD45 Pacific BlueBiolegend103126
PE Ratte IgG2aBiolegend400508
PE/Cy7 Armenischer Hamster IgGBiolegend400922
PE/Cy5 Ratte IgG2bBiolegend400610
Pacific Blue Rat IgG2cBiolegend400717
Dulbecco' s Modifizierter Eagle Medium (DMEM)Cellgro15-017-CV
1x Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Cellgro21-031-CV
70 μ m Zell-SiebeCorning, Inc.352350
1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen DenvilleC2170
Wässrige Paraformaldehyd-Lösung -16xElektronenmikroskopie SciencesCAS #30525-89-4
Mikro-Präparierschere, 3,5 Zoll, gerade, 23 mm, scharf &Stoelting52132-10PWird für allgemeine Präparierzwecke verwendet
Mikropinzette, 4 Zoll, volle Kurve, 0,8 mmStoelting52102-37P Wird für allgemeine Präparierzwecke verwendet
Feder-Präparierschere   3 mm Schneide Fine Science Tool15000-10Wird für die Aortendissektion Stufen 1.3.3.17 bis 1.3.3.28
Gebogen 0,07 mm x 0,04  mm Tip PinzetteFine Science Tool11297-10Wird für die Aortendissektion verwendet Schritte 1.3.3.17 bis 1.3.3.28
Hämostatische Pinzette (gebogen)Fine Science Tool13021-12
Heparin-NatriumsalzFischer Scientific9041-08-1
35 mm Zellkultur/PetrischalenFischer Scientific12-565-90
Petrischalen aus Polystyrol (10 cm) mit DeckelFischer Scientific08-757-100D
15 mL konische Zentrifugenröhrchen (Polypropylen)Fischer Scientific14-959-53A
50 mL konische Zentrifugenröhrchen ( Polypropylen)Fischer Scientific14-432-22
5 mL Polystyrol-Röhrchen mit rundem Boden Fischer Scientific14-959-5
Fötales RinderserumGemini Bio-Products100-106
Ethanol (Stamm Ethylalkohol denaturiert, wasserfrei)MilliporeEX0285-1
RinderserumalbuminRocklandBSA-50
HEPESSigma-AldrichH3375
Kollagenase Typ IISigma-AldrichC6885
Kollagennase Typ XISigma-AldrichC7657
Hyaluronidase Typ ISigma-AldrichH3506
DNAseSigma-AldrichDN25
Kollagenase Typ ISigma-AldrichC0130
NaOHSigma Aldrich1310-73-2 
CaCl2Sigma Aldrich449709-10G
500 mL Becherglas Sigma Aldrich02-540M
4 cm Hämostatische KlemmeStoelting52120-40
ZahnzangeStoelting52104-33P
50 μ m EinwegfilterSystemex04-0042-2317
Kollagenase Typ IVThermoFischer Scientific17104019
Ammoniumchlorid Kalium (ACK)ThermoFischer Scient 
Rasierer (0,22 mm (0,009"))VWRInternational55411-050
Texas Rot Lebend/Tot-Fleck(in Abbildung 1A)
A1049201 Roter Viabilitätsfleck

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Davies, L. C., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages: Then and Now. Immunology. 144 (4), 541-548 (2015).
  2. Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444 (12), 840-846 (2006).
  3. Van Gaal, L. F., Mertens, I. L., De Block, C. E. Mechanisms linking obesity with cardiovascular disease. Nature. 444 (12), 875-880 (2006).
  4. Jung, U., Choi, M. -S. Obesity and Its Metabolic Complications: The Role of Adipokines and the Relationship between Obesity, Inflammation, Insulin Resistance, Dyslipidemia and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Int J Mol Sci. 15 (4), 6184-6223 (2014).
  5. Emanuela, F., Grazia, M., Marco, D. R., Maria Paola, L., Giorgio, F., Marco, B. Inflammation as a link between obesity and metabolic syndrome. Nutr Metab. 2012, 1-7 (2012).
  6. Vieira-Potter, V. J. Inflammation and macrophage modulation in adipose tissues. Cell Microbiol. 16 (10), 1484-1492 (2014).
  7. Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P. S. Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease. Nat Rev Immunol. 11 (11), 738-749 (2011).
  8. Dey, A., Allen, J., Hankey-giblin, P. A. Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation : blood monocytes versus tissue macrophages. Front Immunol. 5 (1), 1-15 (2015).
  9. Mills, C. D., Lenz, L. L., Ley, K. Macrophages at the fork in the road to health or disease. Front Immunol. 6 (2), 1-6 (2015).
  10. Italiani, P., Boraschi, D. From monocytes to M1/M2 macrophages: Phenotypical vs. functional differentiation. Front Immunol. 5 (8), 1-22 (2014).
  11. Guilherme, A., Virbasius, J. V., Vishwajeet, P., Czech, M. P. Adipocyte dysfunctions linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (5), 367-377 (2008).
  12. Cummins, T. D., Holden, C. R., et al. Metabolic remodeling of white adipose tissue in obesity. Am J Physiol Endocrinol Metab. 307 (3), 262-277 (2014).
  13. Fujisaka, S., Usui, I., et al. Regulatory Mechanisms for Adipose Tissue M1 and M2 Macrophages in Diet Induced Obese Mice. Diabetes. 58 (9), 2574-2582 (2009).
  14. Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. Obesity induces a phenotipic switch in adipose tissue macrophage polarization. J Clin Invest. 117 (1), 175-184 (2007).
  15. Qureshi, K., Abrams, G. A. Metabolic liver disease of obesity and role of adipose tissue in the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver disease. World J Gastroenterol. 13 (26), 3540-3553 (2007).
  16. Bedossa, P., Paradis, V. Liver extracellular matrix in health and disease. J Pathol. 200 (4), 504-515 (2003).
  17. Tilg, H., Moschen, A. R. Evolution of inflammation in nonalcoholic fatty liver disease: The multiple parallel hits hypothesis. Hepatology. 52 (5), 1836-1846 (2010).
  18. Milic, S., Lulic, D., Stimac, D. Non-alcoholic fatty liver disease and obesity: Biochemical, metabolic and clinical presentations. World J Gastroenterol. 20 (28), 9330-9337 (2014).
  19. Williams, I. L., Wheatcroft, S. B., Shah, A. M., Kearney, M. T. Obesity, atherosclerosis and the vascular endothelium: mechanisms of reduced nitric oxide bioavailability in obese humans. Int J Obesity. 26 (12), 754-764 (2002).
  20. Mestas, J., Ley, K. Monocyte-Endothelial Cell Interactions in the Development of Atherosclerosis. Trends Cardiovasc Med. 18 (6), 228-232 (2008).
  21. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
  22. Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages. Nat Rev Immunol. 14 (10), 986-995 (2013).
  23. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), e1546(2010).
  24. Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots. J Vis Exp. (94), e52174(2014).
  25. Smedsrød, B. Protocol for preparation of mouse liver Kupffer cells and liver sinusoidal endothelial cells. 1, Available from: http://munin.uit.no/handle/10037/4575 1-10 (2012).
  26. Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas. J Vis Exp. (53), e2848(2011).
  27. Salamone, M., Saladino, S., Pampalone, M. Tissue Dissociation and Primary Cells Isolation Using Recombinant Collagenases Class I and II. Chemical Engineering Transactions. 38, Matsushita 1994 247-252 (2014).
  28. Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47 (4), 1394-1400 (2008).
  29. Fain, J. N. Isolation of Free Brown and White Fat Cells. Diabetologia. 375 (1964), 555-561 (1968).
  30. Seglen, P. Preparation of isolated rat liver cells. Method Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
  31. Yu, S., Allen, J. N., et al. The Ron Receptor Tyrosine Kinase Regulates Macrophage Heterogeneity and Plays a Protective Role in Diet-Induced Obesity, Atherosclerosis, and Hepatosteatosis. J Immunol. 197 (1), 256-265 (2016).
  32. Yu, Y. R. A., O'Koren, E. G., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS ONE. 11 (3), 1-23 (2016).
  33. Zizzo, G., Hilliard, B. A., Monestier, M., Cohen, P. L. Efficient clearance of early apoptotic cells by human macrophages requires "M2c" polarization and MerTK induction. J Immunol. 100 (2), 130-134 (2012).
  34. Jablonski, K. A., Amici, S. A., et al. Novel markers to delineate murine M1 and M2 macrophages. PLoS ONE. 10 (12), 5-11 (2015).
  35. Rőszer, T. Understanding the Mysterious M2 Macrophage through Activation Markers and Effector Mechanisms. Mediators of Inflamm. 2015, 1-16 (2015).
  36. Cho, K. W., Morris, D. L., Lumeng, C. N. Flow Cytometry Analysis of Adipose Tissue Macrophages. Methods Enzymol. 4 (164), 297-314 (2011).
  37. Kim, Y. -J., Brox, T., Feiden, W., Weickert, J. Technical Note: Flow Cytometry Controls, Instrument Setup, and the Determination of Positivity. Cytometry A. 71 (1), 8-15 (2007).
  38. Tung, J. W., Heydari, K., et al. Modern Flow Cytometry: A Practical Approach. Clin Lab Med. 27 (3), 453-468 (2007).
  39. Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000. 6 (3), 13(2014).
  40. Porcheray, F., Viaud, S., et al. Macrophage activation switching: An asset for the resolution of inflammation. Clin Exp Immunol. 142 (3), 481-489 (2005).
  41. Plouffe, B. D., Murthy, S. K., Lewis, L. H. Fundamentals and Application of Magnetic Particles in Cell Isolation and Enrichment. Rep Prog Phys. 1 (78), 1-6 (2010).

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Macrophage IsolationTissue DigestionFlow CytometryFluorescent activated Cell SortingObesity related InflammationDiet induced ObesityLiver Cell DissociationCell Surface StainingFACS BufferPerfusion Buffer

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