Die Analyse der Beendigung der Transkription unter Verwendung von BrUTP strangspezifische Transkription Run-on (TRO) Ansatz

Summary

Wir beschreiben einen grundlegenden experimentellen Ansatz zur Analyse der Beendigung der Transkription durch RNA-Polymerase II in vivo unter Verwendung von BrUTP durch den strangspezifischen Transkriptions-Run-on-Ansatz (TRO) in knospenden Hefen. Dieses Protokoll kann erweitert werden, um die Transkriptionsbeendigung durch andere RNA-Polymerasen sowohl in Hefe als auch in höheren Eukaryoten zu untersuchen.

Abstract

Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll Transkriptionsterminierungs Defekt in vivo zu erkennen. Die strangspezifischen TRO-Protokoll BrUTP hier beschrieben ist eine leistungsfähige experimentelle Ansatz für die Transkriptionsterminierungs Defekt unter physiologischen Bedingungen zu analysieren. Wie das traditionelle TRO - Assay beruht auf der Gegenwart einer transkriptionell aktiven Polymerase über das 3' - Ende des Gens als ein Indikator für eine Transkriptions - Terminationssequenz Defekt ^1. Es überwindet zwei große Probleme mit dem traditionellen TRO-Test festgestellt. Erstens kann sie erkennen, ob der Polymerase durch das Endsignal liest die ist, die Transkription von dem Promotor-proximalen initiiert Region oder wenn es einfach ist, die eine pervasively Transkribieren Polymerase, die unspezifisch von irgendwo in dem Körper eingeleitet bzw. das 3' Ende des Gens. Zweitens kann es zu unterscheiden, ob die transcriptionsaktive Polymerase-Signal über dieTerminatorregion ist wirklich die Readthrough Sense-mRNA transkribiert Polymerase oder ein Terminator-initiierte nicht-codierende anti-sense RNA-Signal. Kurz gesagt umfasst das Protokoll die exponentiell wachsenden Hefezellen durchdringbar, so dass die Transkripte , die in Gegenwart des BrUTP Nukleotid zu verlängern in vivo initiierten BrUTP-markierte RNA durch die Affinität Ansatz Reinigung in umgekehrter gereinigter naszierende RNA und Amplifizieren der cDNA unter Verwendung Transkribieren strangspezifischen Primern den Promotor und die Terminator - Regionen des ² - Gens flankieren.

Introduction

Die eukaryotischen Transkription Zyklus besteht aus drei Hauptschritten; Initiation, Elongation und Termination. Die Beendigung der Transkription durch RNA - Polymerase II besteht aus zwei verschiedenen, voneinander abhängigen Schritten ^3. Der erste Schritt beinhaltet die Spaltung, die Polyadenylierung und die Freisetzung von mRNA aus der Vorlage, und wird sofort durch den zweiten Schritt, gekennzeichnet durch Ausrücken der Polymerase aus der Vorlage. Ordnungsgemäße Beendigung ist entscheidend für die Wiederverwertung der Polymerase während der Initiierung / Reinitiierung der Transkription, für eine Interferenz mit der Transkription der nachgeschalteten Gene zu verhindern, und für aberrant Transkription unter Kontrolle zu halten , indem die Transkription des Begrenzens pervasive nicht-codierende RNA ^{4, 5.} Trotz der jüngsten Fortschritte ist Kündigung bei weitem am wenigsten verstandenen Schritt der RNA-Polymerase II Transkriptionszyklus. Eine zuverlässige Abschlusstest ist von wesentlicher Bedeutung für die Untersuchung des Mechanismus Sekundärmarkg Termination der Transkription durch RNA - Polymerase II in vivo.

Eine Reihe von experimentellen Ansätze werden verwendet, um die Beendigung Defekt in einem aktiv transkribierten Gen unter physiologischen Bedingungen zu erfassen. Dazu zählen Northern Blot, Terminationsfaktor ChIP (Chromatin Immunopräzipitation) und die traditionelle TRO-Test. Jede dieser Techniken haben einige Vorteile und Nachteile. Die traditionelle TRO - Assay verwendet werden , um verlässliche und sensibles Vorgehen zum Nachweis eines Transkriptionsterminierungs Defekt in vivo ^1. Dieser Assay lokalisiert die transkriptionell aktive Polymerase-Moleküle auf den verschiedenen Regionen eines Gens in der Zelle. Unter normalen Bedingungen zeigt der Assay transkriptionell Eingriff Polymerasemoleküle streng zwischen dem Promotor und Terminator - Region des Gens (1A) verteilt. Nach Beendigung defekte, jedoch ist die Polymerase nicht in der Lage das Beendigungssignal zu lesen,und in dem Bereich stromabwärts des 3' - Endes des Gens (1B) detektiert.

Eine Transkriptions - Terminationssequenz Defekt in Gegenwart eines Sinnes Transkribieren Polymerase manifestiert , die aus der Promotor-proximalen Bereich eingeleitet, und nicht in der Lage das Beendigungssignal zu lesen, setzt die Region stromabwärts von dem 3' - Ende eines Gens transkribiert , wie in Abbildung gezeigt 2A. Mit der Erkenntnis , dass die eukaryotische Genom es überwältigend Pervasive Transkription in Sinn sowie Antisense - Richtungen in und um ein Gen , ^{6, 7, 8, 9, 10,} wurde bald klar zeigt , dass die traditionelle TRO - Test nicht , wenn die Polymerase - Signal erkennen kann stromabwärts eines Gens stellt einen Promotor initiierte Transkript (2A) oder eine anomale RNA , die som initiiertewhere in der Mitte des Gens , oder stromabwärts des Terminators Element (2B) oder der Polymerase - Transkription in der anti-sense - Richtung vom 3' - Ende des Gens (Figur 2C). Die strangspezifischen TRO-Assay unter Verwendung BrUTP hier beschriebenen unterscheiden, wenn die beobachtete Überlesen Polymerase Signal Promotor initiierte erweiterten Sinne mRNA oder ein Antisense-Transkript darstellt, die stromabwärts des Gens unter Prüfung eingeleitet. Wir haben diesen Ansatz erfolgreich verwendet in Bäckerhefe ² die Rolle der Kin28 Kinase in Termination der Transkription zu demonstrieren. Der Einsatz der Ansatz hier zeigen wir , dass Rna14 für die Beendigung der Transkription von ASC1 in Bäckerhefe erforderlich ist.

Protocol

Hinweis: Diese Methode wurde in der Forschung Artikel berichtet in Medler, S und Ansari, A. ² verwendet.

1. Die Anzucht und Ernte der Zellen

1. Starten einer 5 ml - Kultur von Zellen in YPD - Medium (10 g / L Hefeextrakt, 20 g / l Pepton, 2% Dextrose) von einer frisch ausgestrichenen Platte Saccharomyces cerevisiae.
2. Wachsen die Zellen über Nacht in einem Orbitalschüttler bei 30 ° C und 250 Umdrehungen pro Minute.
3. Verdünnen Sie die über Nacht gewachsenen Kultur 100-mal auf ein endgültiges Volumen von 100 ml in YPD-Medium in einem 250 ml Schikanekolben.
   HINWEIS: Es wurden insgesamt 100 ml Kultur pro TRO Reaktion benötigt; Wenn mehrere Reaktionen benötigt werden, muss ein größeres Volumen der Kultur verwendet werden.
4. Wachsen die Zellen bis zu einer optischen Dichte von 0,8-1,0 bei 600 nm (A ₆₀₀ ~ 0,8-1,0).
5. Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 820 xg für 5 min bei 4 ° C in einem sterilen 50 ml konischen Röhrchen.
6. Resuspendieren der Zellen in 10 ml eiskaltem TMN buffer (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM MgCl _2, 100 mM NaCl) gegeben und 5 min auf Eis inkubieren.
7. Zentrifuge bei 820 × g für 5 min bei 4 ° C um die Zellen zu pelletieren. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Absaugen.

2. permeabilisierend und Vorbereitung Zellen für die Run-on-Test

1. Resuspendieren der Zellen in 1 ml 0,6% Sarkosyl Lösung durch Auf- und Abpipettieren sanft ein verkürztes P ₁₀₀₀ Spitze verwenden. Übertragen die Zellsuspension auf eine gekühlte 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
2. Schütteln, um die Zellen vorsichtig bei 4 ° C für 25 min auf einem Plattformschüttler.
   HINWEIS: Reaktionsgefäße sollten mit Eis in einem 50 ml konischen Röhrchen verpackt werden, um eine kalte Temperatur zu halten, was die Möglichkeit einer neuen Einleitung Ereignisse zu vermeiden an den Promotor in diesem Stadium auftreten.
3. Zentrifugieren der Zellen bei 1200 × g für 6 Minuten bei 4 ° C einer Tischkühlzentrifuge verwendet wird.
4. Den Überstand vorsichtig absaugen überschüssige Flüssigkeit aus dem pro entfernenmeabilized Zellpellet.

3. Die Transkription Run-on-Reaktion

1. Zugabe von 150 & mgr; l Transkriptions run-on - Puffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM KCl, 10 mM MgCl _2, 2 mM DTT (Dithiothreit), 0,75 mM jeweils von ATP, CTP, GTP und BrUTP, 200 U RNase Inhibitor) auf die permeabilisierten Zellpellet.
2. Vorsichtig mischen durch Pipettieren nach oben und unten ein verkürztes P ₂₀₀ Spitze mit.
   HINWEIS: Wenn mehrere Proben verarbeiten, alles auf Eis zu halten, bis alle Proben fertig sind und dann mit dem nächsten Schritt fortfahren.
3. Inkubieren für 5 min bei 30 ° C in einem Wasserbad.
   HINWEIS: Stellen Sie die Zeit der Inkubation zwischen 1 bis 5 min optimale Einbindung von BrUTP in die im Entstehen begriffenen RNA zu gewährleisten.
4. Die Reaktion durch Zugabe von 500 & mgr; l kaltem ready-to-use-RNA-Isolierung Reagenz. Inkubieren für 5 min bei Raumtemperatur.

4. RNA-Extraktion

1. In 200 ul Säure gewaschenen Glasperlen in die Zelle Schutzsperreauf (3.4 Schritt), und in einem Vortex-Mischer bei 4 ° C für 20 min kräftig schütteln.
2. Stechen Sie den Boden des Mikrozentrifugenröhrchen eine heiße 22 G-Nadel und legen Sie es auf der Spitze eines 15-ml sterilen konischen Röhrchen.
3. Zentrifuge bei 300 × g für 1 min bei 4 ° C, um das Zelllysat zu sammeln. Übertragen das Zelllysat in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
4. Hinzufügen 500 ul kaltem RNA Isolation Reagenz und 200 & mgr; l Chloroform zu dem Zelllysat. Mischen Sie den Inhalt auf einem Vortex-Mixer und Zentrifuge bei 16.168 xg für 20 min bei 4 ° C.
5. Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen.
6. Ein gleiches Volumen von kaltem Phenol / Chloroform / Isoamylalkohol (125: 24: 1) pH 4-5. Kräftig schütteln auf einem Vortex-Mischer und Zentrifuge bei 16.168 × g für 15 min bei 4 ° C.
7. Übertragen Sie die obere wässrige Phase, die RNA auf ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Wiederholen Sie Schritt 4.6 zwei weitere Male.
8. Um die endgültige RNA-haltige wässrige Phase, fügen 5 M NaCl stock eine Endkonzentration von 0,3 M zu erhalten, das Volumen von kaltem Ethanol In 3 mal die RNA auszufällen.
   1. Inkubieren für 1 h oder über Nacht bei -20 ° C.
      HINWEIS: Führen Sie die Schritte 4,9-4,11, während die Anti-BrdU-Perlen zum Blockieren inkubiert werden (siehe Schritt 5.3).
9. Zentrifuge bei 16.168 xg für 20 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren RNA-Pellet in 100 ul DEPC (Diethylpyrocarbonat) Wasser.
10. Verwenden Sie eine RNA-Isolierung Mini-Kit, um die RNA aus den unincorporated BrUTP Nukleotide zu trennen. Eluieren der RNA von der Säule mit 100 & mgr; l RNase-freiem Wasser.
11. Inkubieren Sie die RNA in einem 65 ° C Wasserbad für 5 min und dann übertragen auf Eis für mindestens 2 min.

5. Affinitätsreinigung von BrUTP-markierten RNA

1. Bis 25 & mgr; l Anti-BrdU besiedelt beads, 500 & mgr; l 0,25x SSPE (Natrium Saline Phosphate EDTA) Bindungspuffer (20x SSPE: 3 M NaCl, 0,2 M NaH ₂ PO ₄ , 0,02 M EDTA, pH 7,4, 1 mM EDTA, 0,05% Tween, 37,5 mM NaCl). Zentrifuge bei 200 × g für 30 s bei 4 ° C und entfernt den Überstand.
2. Wiederholen Sie Schritt 5.1 dreimal.
3. In 500 l Blocking-Puffer (1x Bindungspuffer, 0,1% Polyvinylpyrrolidon, 1 mg ultrareinem Rinderserumalbumin (BSA)) zu den Perlen und leicht schütteln mit 1 - 2 h bei 4 ° C auf einem Plattformschüttler.
4. Waschen der Kügelchen zweimal mit 500 ul Bindungspuffer, wie in Schritt 5.1 beschrieben.
5. In 400 & mgr; l Bindungspuffer an die Kügelchen.
6. Transfer von 100 & mgr; l RNA (aus Schritt 4.11) direkt an die Kügelchen. Inkubiere unter leichtem Schütteln für 1 - bei 4 ° C 2 h auf einem Plattformschüttler.
7. Waschen der Kügelchen nacheinander mit 500 ul Bindungspuffer, 500 & mgr; l Puffer mit niedrigem Salz (0,2X SSPE, 1 mM EDTA, 0,05% Tween), 500 ul Hochsalzpuffer (0,25x SSPE, 1 mM EDTA, 0,05% Tween, 100 mM NaCl) und zweimal mit 500 ul TET-Puffer (1x TE, 0,05% Tween), Verspinnen bei200 xg für 30 s bei 4 ° C zwischen jedem Waschen.
8. Eluieren die BrUTP-markierte RNA aus Perlen nacheinander zweimal mit 150 & mgr; l und einmal mit 200 & mgr; l Elutionspuffer (20 mM DTT, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,1% SDS), durch Inkubieren für 4 min bei 42 ° C in einem Wasserbad mit einer kurzen Spin gefolgt Perlen von dem Überstand zu trennen.

6. Fällung von BrUTP Beschriftete RNA

1. Fügen 500 ul kaltem Phenol / Chloroform / Isoamylalkohol (125: 24: 1) pH 4 - 5 an den affinitätsgereinigten BrUTP markierte RNA. Mit Hilfe eines Vortex-Mixer und Zentrifuge bei 16.168 × g für 15 min bei 4 ° C.
2. Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen.
3. Zugabe von 5 M NaCl Lager um eine Endkonzentration von 0,3 M und 3-fachen Volumen von kaltem Ethanol zu erhalten, die RNA auszufällen.
4. Inkubieren bei -20 ° C über Nacht.
5. Sammeln des ausgefällten RNA durch Zentrifugation bei 16.168 xg für 30 min bei 4 ° C.
6. Entfernen Sie den Überstand und lassen Sie das Pellet an der Luft trocknen für 10 min.
7. Resuspendieren RNA-Pellet in 26 & mgr; l DEPC-Wasser.
8. Bestimmen die endgültige RNA-Konzentration durch Absorption bei 260 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers gemessen wird. Außerdem bestimmen die 260/280 Verhältnis. Ein Verhältnis ~ 2 ist kennzeichnend für eine reine RNA Probe.
9. Speichern die RNA-Proben in Aliquots bei -80 ° C bis zur cDNA-Synthese benötigt wird.

7. reverse Transkription von BrUTP markierte RNA

1. Stellen Sie die RNA-Konzentration auf 100 ng / & mgr; l mit DEPC Wasser. Verwenden Sie 0,5 ug RNA für jede cDNA-Synthesereaktion.
   HINWEIS: Die Konzentration der RNA-Matrize 0,5 bis 1,0 & mgr; g variieren kann optimal cDNA-Synthese zu erreichen.
2. Reverse Transkription der RNA unter Verwendung von mehreren Rückwärtsprimer konstruiert stromabwärts des Poly (A) -Stelle (Terminationsstelle) , wie in 3A gezeigt.
3. Zu jeder reverse Transkriptionsreaktion, fügen Sie 5 ul RNA template (0,5 ug), 1 ul dNTP - Mix (jeweils 10 mM), 2 & mgr; l reverse Primer C, D, E, F oder G (50 & mgr; M jeweils) und nukleasefreiem Wasser (siehe 3A). Das endgültige Reaktionsvolumen in jedem Röhrchen 13 & mgr; l.
   HINWEIS: Die Anzahl der reversen Transkriptionsreaktionen werden für die cDNA-Synthese verwendet, von der Anzahl der Rückwärtsprimer abhängen. Zum Beispiel für ASC1 fünf Reverse - Primer verwendet wurden und daher fünf Reverse Transkriptionsreaktionen wurden eingerichtet. Beschriften der Rohre als C, D, E, F und G auf der Basis der Reverse-Primer für die cDNA-Synthese verwendet.
4. Inkubieren der Röhrchen RNA-Matrize, dNTP-Mix und Primern in einem Thermocycler bei 65 ° C für 5 min mit einer beliebigen sekundären strukturellen Konformation zu entfernen, und dann Abkühlen auf 4 ° C für mindestens 2 min.
5. 1 ul reverse Transkriptase (200 U / & mgr; l), 4 & mgr; l Puffer und 2 ul 0,1 M DTT in jedes Röhrchen, enthaltend die RNA-Matrize und Primer (Schritt 7.4). Mix von sanft bis Pipettieren und ab.
6. Führen der reversen Transkription, indem die Reaktionsmischung in einem Thermocycler bei 42 ° C inkubiert für 60 min.
7. Inaktivierung der reversen Transkriptase bei 65 ° C für 20 min.
8. Lagern Sie die cDNA bei -20 ° C oder fahren Sie mit dem nächsten Schritt.

8. Amplification of cDNA

1. Führen Sie die PCR - Reaktion zur Amplifikation von jeder cDNA - Präparation ( mit der Bezeichnung C, D, E, F und G für ASC1) aus Schritt 7.8 wie folgt: 3,0 & mgr; l cDNA - Matrize aus Schritt 7.8 und 1.0 & mgr; l Vorwärts - Primer B (10 & mgr; M), 1,0 & mgr; l Rückwärtsprimer C oder D oder E oder F oder G (10 uM), 2,5 ul 10x - Polymerase PCR - Puffer, 0,5 ul dNTP - Mix (jeweils 10 mM), 1,0 & mgr; l MgCl ₂ (2,5 mM) 15,5 & mgr; l PCR-Wasser, und 0,5 ul thermostabile Polymerase-Enzym.
   HINWEIS: Verschiedene Verdünnungen von cDNA-Matrize im Bereich von 1: 5 bis 1: 100 getestet werden sollte, die PCR Produktausbeute zu optimieren. Ein einzelner Promotor-proximalen Vorwärts-Primer werden verwendet, um cDNA zu verstärkenmit verschiedenen Reverse-Primer erhalten. So wurde beispielsweise für ASC1 in Kombination mit fünf Rückwärtsprimer von C bis G ein einziger Vorwärtsprimer B in der Nähe des Promotors verwendet. BC, BD, BE, BF und BG in Rohren als C, D, E, F und G jeweils gekennzeichnet sind, verwendet wurden , wie in 3A gezeigt.
2. Führen Sie die PCR die folgenden thermischen Zyklus Parametern: 1 Zyklus 95 ° C für 2 min (Hot-Start für die Aktivierung der Polymerase), 30 - 40 Zyklen 95 ° C für 30 s (Denaturierung), 54 ° C für 15 s (Annealing) , 68 ° C für 1 min (Verlängerung) und 1 Zyklus 68 ° C für 5 min (final Extension).
   HINWEIS: Die Glühtemperatur auf den spezifischen Primern variieren je verwendet wird und die Verlängerungszeit in Abhängigkeit von der erwarteten Produktgröße variieren.
3. Trenne die PCR-Produkts durch Elektrophorese auf 0,8%, 1,5% bzw. 2% Agarose-Gelen auf der erwarteten Größe des Produkts abhängig.
4. Quantifizierung der PCR - Produkt wie in El Kaderi et al. 2012 ^11.
   HINWEIS: Alternativ können Sie Echtzeit-RT-qPCR-Strategie die Menge der im Entstehen begriffenen Transkripte zu quantifizieren.

Results

Um die Anwendbarkeit des BrUTP strangspezifische TRO Verfahren bei der Erkennung eines Transkriptionsterminierungs Defekt zeigen, haben wir eine Beendigung-defekt, temperaturempfindliche Mutante von RNA14 rna14-1 genannt. Die Rolle der Rna14 in Beendigung der Transkription durch RNA - Polymerase II wurde mit der traditionellen TRO - Test gezeigt , dass RNA in der Terminator-proximalen Bereich ausgewählter Gene ¹ nachgewiesen. Der Nachweis von RNA...

Discussion

Die strangspezifischen TRO hier verwendete Protokoll wurde aus dem Protokoll für GRO-Seq (Global Run On-Sequenzierung) Analyse in Säugetierzellen ¹² verwendet angepasst. Wir modifizierten erfolgreich das Protokoll in Bäckerhefe im Entstehen begriffenen Transkription zu studieren. Um insbesondere die Transkriptionsterminierungs Defekt zu analysieren, passten wir das Protokoll weiter, indem sie von der RNA-Hydrolyse Schritt befreien. Dies ermöglichte es uns, um speziell die volle Länge im Entstehen...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Gemisch	Sigma-Aldrich	77619	pH 4-5
TRIzol-Reagenz	Life Technologies	15596-026
RNase-Inhibitor, menschliche Plazenta	New England Biolabs	M0307S
Anti-BrdU-Kügelchen	Santa Cruz Biotechnology	sc-32323AC
Protoscript II	New England Biolabs	M03368L	oder ein gleichwertiges
Enzym Advantage 2 Polymerase Mix	Clontech	639201	oder ein gleichwertiges Enzym
5-Bromouridin 5' Triphosphat Natriumsalz	Santa Cruz Biotechnologie	sc-214314A
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104
ATP	New England Biolabs	N0451AA
CTP		N0454AA
GTP		N0452AA
Ultrareines Rinderserumalbumin (BSA)	MC Labs	UBSA-100
Asc1 B			AGATTCGTCGGTCACAAGTCC
Asc1 C			GAACTTTATACATATTCTTAGTT AGCAGTC
Asc1 D			TGTACATATGTATTTTCGCAGCA
Asc1 E			GCCAAGGAGACTGAATTTAATG
Asc1 F			CTATGGAATGGGGGGGTTTTAAG
Asc1 G			GGTTATGGCAGACATGCCAC
5s cDNA			AGATTGCAGCACCTGAGT
5' 5s rückwärts			GGTTGCGGCCATATCTAC
3' 5s rückwärts			TGAGTTTCGCGTATGGTC