Wir beschreiben ein Verfahren zur Erzeugung von Precision-cut Lung Slices (PCLS) und immunostaining sie die Lokalisierung verschiedenen Immunzelltypen in der Lunge sichtbar zu machen. Unser Protokoll kann erweitert werden, um die Position und Funktion vieler verschiedenen Zelltypen unter einer Vielzahl von Bedingungen zu visualisieren.
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Methodenartikel
Precision-cut Maus Lung Slices Live-Pulmonary Dendritische Zellen sichtbar zu machen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Inhalation von Allergenen und Krankheitserregern entlockt mehrere Änderungen in einer Vielzahl von Immunzelltypen in der Lunge. Die Durchflusszytometrie ist eine leistungsstarke Technik für die quantitative Analyse von Zelloberflächenproteinen auf Immunzellen, aber es gibt keine Informationen über die Lokalisierung und Migrationsmuster dieser Zellen in der Lunge. In ähnlicher Weise kann Chemotaxis - Assays durchgeführt werden , um das Potenzial der Zellen zu untersuchen , um chemotaktische Faktoren in vitro zu reagieren, aber diese Tests nicht die komplexe Umgebung des intakten Lunge reproduzieren. Im Gegensatz zu diesen oben genannten Techniken kann die Lage der einzelnen Zelltypen innerhalb der Lunge leicht durch Erzeugen von präzisionsgeschliffenen Lung Slices (PCLS), Anfärben sie mit handelsüblichen, fluoreszenzmarkierten Antikörpern und Visualisierungen der Abschnitte durch konfokale Mikroskopie sichtbar gemacht werden. PCLS kann für beide verwendet werden, leben und Lungengewebe fixiert ist, und die Scheiben Bereiche so groß wie ein Querschnitt einer gesamten Lappen umfassen kann. Wir haben dieses Protokoll verwendet, um erfolgreich die Position eine Vielzahl von Zelltypen in der Lunge, einschließlich verschiedenen Arten von dendritischen Zellen sichtbar zu machen, Makrophagen, Neutrophile, T-Zellen und B-Zellen, sowie Strukturzellen wie Lymph-, endotheliale und Epithelzellen. Die Fähigkeit, zelluläre Interaktionen sichtbar zu machen, wie die zwischen dendritischen Zellen und T-Zellen, live, dreidimensionalen Lungengeweben kann zeigen, wie Zellen in der Lunge bewegen und miteinander in einem stabilen Zustand und während der Entzündung in Wechselwirkung treten. Somit wird, wenn in Kombination mit anderen Verfahren, wie Durchflusszytometrie und quantitative PCR verwendet wird, kann PCLS zu einem umfassenden Verständnis von zellulären Ereignissen beitragen, die allergischen und entzündlichen Erkrankungen der Lunge zu Grunde liegen.
Einleitung
Nach Einatmen von proinflammatorischen Stimuli wie Lipopolysaccharide (LPS), gibt es eine koordinierte Bewegung von Immunzellen in die, innerhalb und aus der Lunge. Zum Beispiel werden Neutrophile Lungenparenchym und Atemwegs schnell rekrutiert. Darüber hinaus sind einige professionelle antigenpräsentierende als herkömmliche dendritische Zellen (cDCs) bekannten Zellen durchlaufen eine relativ komplizierte Migrationsmuster 1, 2. cDCs kann CD11c auf ihrer Anzeige des Oberflächenmarker, unter Verwendung von identifizierte Durchflusszytometrie, basierend teilweise. Distinct Subsets von DCs können durch die Differ....
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Protokoll
Tierversuchsverfahren in diesem Dokument beschrieben sind, wurden durch die NIEHS Animal Care und Use Committee (IACUC) zugelassen.
1. Lung Vorbereitung
- Hausmäuse zwischen 6 und 12 Wochen alt ist in spezifischen pathogenfreien Bedingungen in Übereinstimmung mit den von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschüssen vorgesehen Richtlinien.
HINWEIS: Abgebildete Mäuse können entweder naiv oder behandelt sein, abhängig von jedem spezifischen Interessen des Forschers. Hier beschreiben wir Immunzelllokalisierung in naiven Mäusen und in Mäusen, die mit 100 & mgr; g Ovalbumin (OVA) und 0,1 ug Lipopolysaccharid (LPS), un....
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Ergebnisse
Um die Position von zwei DC - Untergruppen, CD11b hallo cDCs und CD103 + cDCs, PCLS von C57BL / 6 - Mäusen wurden geschnitten und gefärbt mit monoklonalen Antikörpern (mAb) , spezifisch für CD11c, CD88, CD103 und CD324 (E-Cadherin) zu identifizieren. Antikörper gegen CD324 stain Atemwegsepithelzellen und CD88 auf Makrophagen und Neutrophile angezeigt, aber nicht mehr als 8 cDCs. Dies ermöglichte es uns cDCs von CD11c + Makrophagen .......
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Diskussion
Das hier beschriebene Protokoll wurde ursprünglich die Positionen von zwei Untergruppen von cDCs in der Lunge sichtbar zu machen entwickelt. Jedoch kann dieses Protokoll ohne weiteres viele verschiedene Zelltypen zu untersuchen, während die Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Zellen und die dreidimensionale Architektur der Lunge angepasst werden. Das letztere Merkmal ist ein wesentlicher Vorteil gegenüber Kultursysteme Zelle und erleichtert die Identifizierung von seltenen Zelltypen. Das Verfahren beruht auf der E.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt zu erklären.
Danksagungen
Wir danken Jeff Tucker, Erica Scappini und Agnes Janoshazi für ihre Hilfe bei der Mikroskopie Ligon Perrow für ihre Verwaltung der Maus Kolonie, und Jun Chen und Michael Sanderson um Hilfe mit dem Gewebe Hobel, und Michael Fessler und Derek Cain für kritische Lektüre das Manuskript. Diese Arbeit wurde durch den intra-Zweig des NIEHS, NIH (ZIA ES102025-09) finanziert, die von der Abteilung für Gesundheit und Human Services gesponsert wiederum.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| C57BL/6J Mäuse | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Prox1-TdTomato transgene Mäuse | Jackson Laboratory | 018128 | B6; 129S-Tg(Prox1-tdTomate)12Nrud/ |
| J OT-II OVA-spezifische TCR x Nur77-GFP transgene Mäuse | Jackson Laboratory | 004194, 016617 | B6. Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J |
| Rag1 Knock-out-Mäuse | Jackson Laboratory | 002216 | B6.129S7-Rag1tm1Mom/J |
| Ovalbumin, Low Endo, gereinigt | Worthington Biochemical Corporation | LS003059 | |
| Lipopolysaccharide aus Escherichia | coli Sigma-Aldrich Co. | L2630-25MG | |
| Polyethylenschlauch (unsteril) 100 ft | BD Diagnostic Systems | 427421 | 0,86 mm Innendurchmesser, 1,27 mm Außendurchmesser |
| GeneMate Sieb GQA Low Melt | Agarose BioExpress | E-3112-125 | 2%ige Lösung, gelöst in PBS bei 70 & Grad; C und wurde bei 40 °C gehalten. |
| Compresstome VF-300 Precisionary | Instruments, Inc. | VF-300 | |
| Doppelschneidige Edelstahl-Rasierklinge | Elektronenmikroskopie Sciences | 72000 | Einweg; 250/Karton Die Klinge sollte für jede Lunge gewechselt werden. |
| Krazy Glue All Purpose Instant Gel | VWR | 500033-484 | Allgemein erhältlich für 3 $/Tube in lokalen Drogerien |
| Leibovitz's L-15 Medium, kein Phenolrot | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Normales Rattenserum (NRS) | Jackson ImmunoResearch Inc. | 012-000-120 | |
| Normales Mausserum (NMS) | Jackson ImmunoResearch Inc. | 015-000-120 | |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Hyclone | SH30071.03HI | |
| Färbepuffer | Made in House | N/A | PBS mit 0,5 % Rinderserumalbumin, 0,1 % NaN3, pH 7,4 |
| Fc-Blocker (Anti-CD16/32-Antikörper) | Made in House | N/A | Überstand der kultivierten Hybridom-Zelllinie 2.4G2 |
| Anti-Maus CD11b eFluor 450 | eBioscience | 48-0112-80 | Anti-Maus CD11b eFluor 450 (Klon: M1/70) |
| Anti-Maus CD11c Brilliant Violet 605 | BioLegend | 101237 | Brilliant Violet 605 Anti-Maus CD11c (Klon: M1/70) |
| Anti-Maus CD11c Phycoerythrin | eBioscience | 12-0114-82 | PE konjugiertes Anti-Maus CD11c (Klon: N418) |
| Anti-Maus CD11c Allophycocyanin | BD Phamingen | 550261 | APC-markiertes Anti-Maus CD11c 9Klon: HL3) |
| Anti-Maus CD88 Phycoerythrin | BioLegend | 135806 | PE Anti-Maus CD88 (Klon: 20/70) |
| Anti-Maus CD103 Allophycocyanin | eBioscience | 17-1031-82 | Anti-Maus CD103 APC (Klon: 2E7) |
| Anti-Maus CD90.2/Thy1.2 eF450 | eBioscience | 48-0902-82 | Anti-Maus CD90.2 eFluor 450 (Klon: 53-2.1) |
| Anti-Maus CD172a/Sirp1a Allophycocyanin | eBioscience | 17-1721-82 | Anti-Maus CD172a APC (Klon: P84) |
| Anti-Maus CD324 Brilliant Violet 421 | BD Horizon | 564188 | BV421 Maus Anti-E Cadherin (Klon: 5E8 auch bekannt als 5E8-G9-B4) |
| Anti-Maus CD324 Alexa Fluor 488 | eBioscience | 53-3249-82 | Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 488 (Klon: DECMA-1) |
| Anti-Maus CD324 Alexa Fluor 647 | eBioscience | 51-3249-82 | Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 647 (Klon: DECMA-1) |
| Mikrotiterschalen mit Glasboden 35 mm Petrischale, 14 mm Mikrotiglas, Nr. 1,5 Deckglas | MatTek Corperation | P35G-1.5-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Kammer-Deckglas | ThermoFisher Scientific | 155411PK | Packung mit 16 Stück |
| 15 mm Deckglas, Nr. 1,5 Glasstärke | MatTek Corperation | PCS-1,5-15 | |
| Blanker Platindraht | World Precision Instruments | PTP201 | 0,020" (0,5 mm) Durchmesser in ~1 cm lange Stücke geschnitten und in eine "L"-Form gebogen |
| ProLong Gold Antifade Eindeckmittel | ThermoFisher Scientific | P36934 | Bei 4 & Grad halten; C, vor Gebrauch auf Raumtemperatur erwärmen. |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basalmembranmatrix, phenolrotfrei, *LDEV-frei | Corning | 356231 | |
| Zeiss 880 Multiphotonen-Laser-Scanning-Mikroskop | Carl Zeiss | Zen Black Softwareversion 8.1, 2012 (Zeiss) | |
| Plan-Apochromat 20X/0,8 M27 Objektiv verleiht | Carl Zeiss | 420650-9901-000 |
Referenzen
- Schneider, T., van Velzen, D., Moqbel, R., Issekutz, A. C. Kinetics and quantitation of eosinophil and neutrophil recruitment to allergic lung inflammation in a brown Norway rat model. Am J Respir Cell Mol Biol. 17 (6), 702-712 (1997).
- Vermaelen, K. Y., Carro-Muino, I., Lambrecht, B. N., Pauwels, R. A.
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Nachdrucke und Genehmigungen
