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Methodenartikel

Precision-cut Maus Lung Slices Live-Pulmonary Dendritische Zellen sichtbar zu machen

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DOI:

10.3791/55465

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5. April 2017

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1Immunity, Inflammation, and Disease Laboratory, Division of Intramural Research, National Institute of Environmental Health Sciences, NIH

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Verfahren zur Erzeugung von Precision-cut Lung Slices (PCLS) und immunostaining sie die Lokalisierung verschiedenen Immunzelltypen in der Lunge sichtbar zu machen. Unser Protokoll kann erweitert werden, um die Position und Funktion vieler verschiedenen Zelltypen unter einer Vielzahl von Bedingungen zu visualisieren.

Zusammenfassung

Inhalation von Allergenen und Krankheitserregern entlockt mehrere Änderungen in einer Vielzahl von Immunzelltypen in der Lunge. Die Durchflusszytometrie ist eine leistungsstarke Technik für die quantitative Analyse von Zelloberflächenproteinen auf Immunzellen, aber es gibt keine Informationen über die Lokalisierung und Migrationsmuster dieser Zellen in der Lunge. In ähnlicher Weise kann Chemotaxis - Assays durchgeführt werden , um das Potenzial der Zellen zu untersuchen , um chemotaktische Faktoren in vitro zu reagieren, aber diese Tests nicht die komplexe Umgebung des intakten Lunge reproduzieren. Im Gegensatz zu diesen oben genannten Techniken kann die Lage der einzelnen Zelltypen innerhalb der Lunge leicht durch Erzeugen von präzisionsgeschliffenen Lung Slices (PCLS), Anfärben sie mit handelsüblichen, fluoreszenzmarkierten Antikörpern und Visualisierungen der Abschnitte durch konfokale Mikroskopie sichtbar gemacht werden. PCLS kann für beide verwendet werden, leben und Lungengewebe fixiert ist, und die Scheiben Bereiche so groß wie ein Querschnitt einer gesamten Lappen umfassen kann. Wir haben dieses Protokoll verwendet, um erfolgreich die Position eine Vielzahl von Zelltypen in der Lunge, einschließlich verschiedenen Arten von dendritischen Zellen sichtbar zu machen, Makrophagen, Neutrophile, T-Zellen und B-Zellen, sowie Strukturzellen wie Lymph-, endotheliale und Epithelzellen. Die Fähigkeit, zelluläre Interaktionen sichtbar zu machen, wie die zwischen dendritischen Zellen und T-Zellen, live, dreidimensionalen Lungengeweben kann zeigen, wie Zellen in der Lunge bewegen und miteinander in einem stabilen Zustand und während der Entzündung in Wechselwirkung treten. Somit wird, wenn in Kombination mit anderen Verfahren, wie Durchflusszytometrie und quantitative PCR verwendet wird, kann PCLS zu einem umfassenden Verständnis von zellulären Ereignissen beitragen, die allergischen und entzündlichen Erkrankungen der Lunge zu Grunde liegen.

Einleitung

Nach Einatmen von proinflammatorischen Stimuli wie Lipopolysaccharide (LPS), gibt es eine koordinierte Bewegung von Immunzellen in die, innerhalb und aus der Lunge. Zum Beispiel werden Neutrophile Lungenparenchym und Atemwegs schnell rekrutiert. Darüber hinaus sind einige professionelle antigenpräsentierende als herkömmliche dendritische Zellen (cDCs) bekannten Zellen durchlaufen eine relativ komplizierte Migrationsmuster 1, 2. cDCs kann CD11c auf ihrer Anzeige des Oberflächenmarker, unter Verwendung von identifizierte Durchflusszytometrie, basierend teilweise. Distinct Subsets von DCs können durch die Differentialoberflächenexpression von CD11b CD103 und 3 unterschieden werden. Bei inhalativen Antigen Erwerb verlassen einige cDCs die Lunge und wandern durch die Lymphgefäße zu Lungen-Lymphknoten (LNS) , wo sie Peptide präsentieren 4 T - Zellen-spezifisches Antigen. Dies ist ein kritisches frühes Ereignis in der Einleitung der adaptiven Immun rAHMEN. Aus unbekannten Gründen jedoch nicht alle cDCs , die inhaliert Antigene erwerben lassen , die Lunge, und viele dieser Zellen bleiben in diesem Organ für mehrere Monate 5, 6. Diese Beobachtung kann teilweise durch die Entwicklungs Vorfahren dieser Zellen , da Monozyten abgeleiteten Zellen CD11c + erklärt werden , um den Chemokin - Rezeptor fehlen, CCR7, sind nicht in der Lage zu regionalen LNs 7, 8 zu wandern. Es scheint wahrscheinlich, dass das Migrationspotenzial von cDCs auch bestimmt ist, zumindest teilweise durch ihre anatomische Position innerhalb der Lunge. Jedoch ist die genaue Lokalisierung dieser verschiedenen Populationen von cDCs in der Lunge nicht vollständig charakterisiert. Eine verbesserte Kenntnis von Immunzellen Lokalisation innerhalb der Lunge und des Moleküls, die sie leiten, ist für ein besseres Verständnis davon, wie das Immunsystem der Lunge benötigt wird aktiviert.

PCLS werden steigendely verwendete als ex - vivo - Ansatz zellulare Positionierung und Zell-Zell - Wechselwirkungen sichtbar zu machen , während die strukturelle Integrität der Lungenarchitektur 9, 10 aufrechterhalten wird . PCLS wurden verwendet Lungen vielen Arten zu untersuchen, darunter Mäuse, Rinder, Affen, Schafe, Pferde und Menschen 11. Ein wesentlicher Vorteil dieser Technik besteht darin, dass etwa 20 Scheiben aus einer einzigen Keule einer Mauslunge hergestellt werden können, wodurch die Anzahl von Tieren für die einzelnen Versuche benötigt reduzieren. Praktisch alle Immunzelltypen, einschließlich DCs, Makrophagen, Neutrophile und T-Zellen, sind in PCLS und pflegen ihre normalen Strukturen.

PCLS 13 kann auch mit Acetylcholin oder Methacholin 12 zu studieren Calcium - Signalisierung und die Kontraktilität des Atemweg und glatten Muskelzellen nach der Behandlung verwendet werden. Bei diesem Ansatz ist nur ein kleiner Teil der Lunge einalyzed mikroskopisch, aber eine Studie berichtete , dass die Messungen der Atemwegskontraktion in PCLS nur etwa 10% von der Scheibe variieren zu schneiden, und diese Varianz vergleichbar ist , das zu 14 in intakten Tieren unter Verwendung von Lungenfunktionstests beobachtet. Andere Forscher haben PCLS als Ex - vivo - Ansatz verwendet zu untersuchen Veränderungen in der Zytokin - Expression und Zelloberflächenmarker nach der Inkubation mit LPS 15. PCLS haben auch in einem ex vivo - Modell der hypoxischen pulmonalen Vasokonstriktion in kleinen intra acinar Arterien eingesetzt. Diese Schiffe sind im Teil der Lunge entfernt , die mit anderen Verfahren nicht erreicht werden können, darunter Aufnahmen von sezierten arterielle Segmenten oder Analyse von subpleural Gefäßen 16. Unser Labor hat PCLS zu visualisieren Immunzellortung in lebenden Lungengeweben in einem stabilen Zustand und nach einem In - vivo - Entzündungsreiz eingesetzt. Die Verfahren haben wir dafür entwickelt wurden, sind wie folgt.

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Protokoll

Tierversuchsverfahren in diesem Dokument beschrieben sind, wurden durch die NIEHS Animal Care und Use Committee (IACUC) zugelassen.

1. Lung Vorbereitung

  1. Hausmäuse zwischen 6 und 12 Wochen alt ist in spezifischen pathogenfreien Bedingungen in Übereinstimmung mit den von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschüssen vorgesehen Richtlinien.
    HINWEIS: Abgebildete Mäuse können entweder naiv oder behandelt sein, abhängig von jedem spezifischen Interessen des Forschers. Hier beschreiben wir Immunzelllokalisierung in naiven Mäusen und in Mäusen, die mit 100 & mgr; g Ovalbumin (OVA) und 0,1 ug Lipopolysaccharid (LPS), unter Verwendung von phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) als Vehikel in einem Gesamtvolumen von 50 & mgr; l. Um oropharyngeally OVA / LPS in die Atemwege zu vermitteln, wurden die Tiere mit Isofluran anästhesiert und inhalative vertikal durch ihre Zähne mit einem Gummiband aufgehängt ist. Die Zunge wurde vorsichtig mit einer Pinzette ergriffen und zu einer Seite gehalten zu verhindern, Schlucken und 50 & #181; L der OVA / LPS - Lösung auf der Rückseite der Mundhöhle abgeschieden , wie zuvor beschrieben 17.
  2. Euthanize die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von Natriumpentobarbital (100 mg / kg) und der Stift, das Tier zu einem Polystyrol-Basis.
  3. Öffnen der Bauchhöhle mit einer Schere durch Schneiden der Haut und Bauchfells von der Mitte des Bauches auf den Unterkiefer nach oben. Ziehen Sie den Darm beiseite mit Zange oder der stumpfen Kante der Schere, und schneidet die untere Hohlvene Blut abzulassen weg von Lungen. Durchstechen der Membran mit der scharfen Spitze der Schere Expansion des Brustkorbs zu erlauben, darauf achten, daß die Lungen zu schneiden.
  4. Klare Speicheldrüsen und andere Gewebe aus der Luftröhre entfernt, indem das Gewebe greifen und manuell entfernt von der darunter liegenden Luftröhre mit einem Pinzette herausziehen. Führe einen kleinen Einschnitt in der Luftröhre an der vorderen Seite des dicksten Bandes des Knorpels mit feinen Pinzetten oder Scheren, aufpassen, nicht dem ganzen Weg, obwohl die tra zu schneidenChea. Der Schnitt wird nur groß genug, um eine 20-G-Nadel zu ermöglichen, hindurchzutreten.
  5. Schieben eine 1,5 Zoll, 20 G Nadel auf einen Abschnitt von Polyethylenschlauch, so dass etwa 1 cm des Schlauchs über das Ende der Nadel. Schneiden Sie das Rohr in einem Winkel von etwa 45 ° das Ende abzuschrägen, Befestigen der Nadel an einer 1 ml Spritze und laden die Spritze durch Ziehen 0,8 ml warmem (40 ° C) 2% niedrig schmelzender Agarose nach oben durch die Nadel.
  6. Das Ende der Rohrleitung in den Einschnitt der Trachea und spritzen langsam die Agarose in die Lunge. Ohne Bewegen der Nadel oder Spritze, kleben die Spritze an die Polystyrolbasis die Nadel bleibt in der Trachea sicherzustellen.
    HINWEIS: Nach der Injektion wird die Lunge in der Brust größer und aufgeblasen werden. Die rechten Lappen erweitern zuerst, dann die linken Lappen. Wenn nur ein Lappen erweitert, hat die Nadel zu tief eingeführt worden ist (vorbei an der Bronchien), und es wird notwendig sein, um es leicht zu ziehen, bevor Sie fortfahren. Dieser Teil derVerfahren muss relativ schnell durchgeführt werden, bevor die Agarose zu erstarren beginnt.
  7. Platzieren Sie die Maus, mit der Basis und der Spritze noch in der Luftröhre eingeführt, in einem Kühlraum oder Kühlschrank für mindestens 10 min. Falls erforderlich, kann das Tier dort gehalten werden, bis zu mehreren Stunden, auch wenn Sie fortfahren zu Bildzellmigration durch Videomikroskopie.
  8. Sobald die Maus kalt ist, sorgfältig die Agarose aufgeblasenen Lungen mit einer Schere auszuschneiden und sie in einen 3-cm-Schale mit eiskaltem PBS. Halten Sie sich auf dem Eis.
  9. Wählen Sie die gewünschte Keulen für Gewebe Slicing (zB dem rechten oberen Lobus). Stellen Sie sicher, dass der innere Teil der Lunge (wo es zu Trachea verbindet) ist gegenüber in der Schale nach unten.
    HINWEIS: Der Lappen verwendet und seine Ausrichtung auf den Kolben wird die Größe der Schiffe und der Atemwege bestimmen, die sichtbar sein wird. Die Orientierung beschrieben hier ist ideal für die Visualisierung großer Atemwege und Parenchym. Mäuse haben eine große linke Lappen und vier kleinere Lappen auf der rechten Seite. ZumPCLS Bildgebung nach der Einführung von Allergenen in die Lungen über oropharyngealen oder intranasal Bestrebung, die rechten oberen Lappens wird teil typischerweise geschnitten, weil es eine bequeme Größe ist, sondern auch, weil inhalierten Mittel verteilen sich gleichmäßig in ihr. Jedoch können auch andere Lappen, vor allem der linke Lappen, kann auch untersucht werden. Wenn Mausstämme oder Behandlungen zu vergleichen, ist es wichtig, die gleichen Lappen zu vergleichen.

2. Lung Slicing

HINWEIS: Stellen Sie Scheiben eine automatisierte Schneidemaschine mit Metallkühlblock, Kolben und Metallspritze, nach den Anweisungen des Herstellers.

  1. Bringe einen kleinen Tropfen Allzweck-, kein Gel-run superglue auf den Kolben und verteilt den Klebstoff in einer kreisförmigen Bewegung, dabei nicht der Klebstoff an den Seiten des Metall Spritze berühren zu lassen. Wenn der Klebstoff an den Seiten der Spritze berührt, wird sie die Spritze und Kleber zusammenzuDruckFläche.
  2. Unmittelbar nach den Kolben mit Leim bedeckt, greifen die sanftexzidiert Lappens mit einer Pinzette mit der Trachea-Seite nach unten auf einem Gewebe dab überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, und vorsichtig auf der Oberseite des Kolbens zu legen. Schneiden Sie keine zusätzlichen Gewebe über den Rand des Plungers erstreckt.
  3. Bewegen Sie den Kolben nach unten, so dass die Seiten der Metall Spritze nach oben und über das Gewebe, die Schaffung einer gut mit der Lunge am Boden geklebt, nicht mehr als einige Zentimeter tief. Band um die Unterseite der Metall Spritze diese Position in Position zu halten.
  4. gießt vorsichtig 2% niedrig schmelzende Agarose bei 40 ° C in das Bohrloch, so dass es nur die Oberseite des Lappens erstreckt.
  5. Umgeben die Metall Spritze mit dem eiskalten Kühlblock und Kühlen des Lappens und Agarose für 1 bis 2 min.
    HINWEIS: Eine kürzere Zeit Kühlung des Agarose das umgebende Gewebe während des Schneidens zu einem Zerfall der Agarose führen könnte, was zu einer ungleichmäßig geschnitten PCLS führen könnte.
  6. Legen Sie die Probenspritze in die automatische Schneidemaschine und füllen den Puffertank mit eiskaltem PBS. Richten Sie die Schrittmotorantrieb mit der Spritze Probe und Entfernen von der Unterseite des Bandstückes. Schalten Sie den Schalter auf die Schnellvorlauf (FF) Position, bis der Schrittmotorantrieb nur die Rückseite des Kolbens berührt.
  7. Richten des frischen Klinge mit der Probenspritze. Set Gewebedicke, kontinuierlich / scheibe, Schwingung und die Geschwindigkeit in der Slicer. Zum Beispiel Gewebedicke: 150 & mgr; m, kontinuierliches Schneiden (Forts.), Oszillation: 9 und Geschwindigkeit: 3 - 4. Start drücken. Die obigen Einstellungen müssen auf die spezifischen automatisierten Slicer Spezifikationen angepasst werden.
  8. Mit einem dünnen Spatel oder Pinsel, sammelt das PCLS einen nach dem anderen, wie sie in den Puffertank fallen und sie in einer 24-Well-Platte eiskalten PBS enthält.
    HINWEIS: Es ist wichtig, die Scheiben zu halten, um die Konsistenz zwischen den Experimenten zu halten. Obwohl jeder Lunge unterschiedlich ist , je nach Alter, Geschlecht und Gewicht, die 10. Scheibe, so ergibt zB Atemwege im Allgemeinen ähnlich dimensionierten.
ove_title "> 3. Antikörper-Färbung

  1. Entwerfen eine Gruppe von fluoreszenzmarkierten Antikörpern auf dem Basis des Zelltyp von Interesse unter Berücksichtigung der potentielle fluoreszierende spektrale Überlappung und die Erfassungsfähigkeiten des Mikroskops.
    HINWEIS: Als Beispiel wird ein Panel für DC-Untergruppe Erkennung ist wie folgt: CD11c / alpha X Integrin - BrilliantViolet (BV) 605 (Excitation: 405 nm, Spitzenemission: 605 nm), CD324 / E-Cadherin - Alexa 488 (AF488 ) (Anregung: 488 nm, Spitzenemission: 519 nm), CD88 / C5Ra1 - Phycoerythrin (PE) (Anregung: 561 nm, Spitzenemission: 578 nm), CD103 / alpha E Integrin - Allophycocyanin (APC) (Anregung: 633 nm , Spitzenemission: 660 nm). Fluoreszenz spektrale Betrachter Tools (siehe Materialliste) sind nützliche Platten zu entwerfen.
  2. Stellen einen Antikörper-Cocktail die gewünschten Antikörper enthält.
    1. Für statische PCLS Bildgebung, fügen 800 & mgr; l Färbepuffer, 100 & mgr; l Fc-Blocker wurden 50 ul normales Mausserum und 50 & mgr; l normalem Rattenserum in ein 1,5 ml microcentrifugation Rohr für ein Gesamtvolumen von 1 ml. Für die Abbildung lebender Zellen, verwenden 800 & mgr; l Leibovitz-Medium (1x), das 10% FBS (Leibovitz-10) anstelle von Färbepuffer.
    2. eine gewünschte Endkonzentration jeden Antikörper hinzufügen Antikörper einzustellen. Übertragen Sie die Antikörperlösung auf eine 3-cm-Schale und halten im Dunkeln bis zur Verwendung.
      HINWEIS: Die Endkonzentrationen werden müssen, für jeden einzelnen Antikörper optimiert (in der Regel 1 bis 5 & mgr; g / ml).
  3. Wählen Sie eine PCLS mit einem anatomischen Bereich von Interesse, wie beispielsweise große Atemweg oder der Peripherie der Lunge, und in der 3-cm-Schale, die 1 ml Antikörperlösung.
  4. Stain PCLS im Dunkeln auf Eis, Schaukel langsam für 30 oder 60 min.
  5. Für statische PCLS Bildgebung, geht in Abschnitt 5 mit dem Abschnitt 4 für die Abbildung lebender Zellen, Proceed.

4. Statische Imaging von PCLS

  1. Nach 60 min Inkubation von PCLS mit Antikörpern, die Antikörperlösung aus der Schale entfernen und spülen ter schneidet zweimal mit 1 ml eiskaltem PBS.
  2. Pipettieren von 50 & mgr; l PBS auf ein 3 cm runden Glasbodenschale. Mit einem Spatel oder Pinsel, übertragen die gefärbten PCLS auf den Abfall, Manipulieren sanft die Scheibe, bis sie flach ist und sich auszubreiten. Entfernen Sie die PBS mit einer Pipette. Die Scheibe sollte so flach wie möglich liegt. Die oben genannten Verfahren müssen schnell Photobleichens zu vermeiden, durchgeführt werden.
  3. 1 Tropfen von Raumtemperatur Montagemedium auf die Scheibe sanft und ein Deckglas in die Vertiefung der Platte fallen. Halten PCLS im Dunkeln bei 4 ° C für bis zu einer Stunde vor der Bilderzeugung.
  4. Wenn unter einem konfokalen Mikroskop betrachten, verwenden Sie ein 20x - Objektiv (siehe Materialliste). Mit der „Kachel“ Werkzeug zu lokalisieren und die Ränder des Gewebes in der „konvexen Hülle“ Einstellmarke. Dies wird dazu beitragen, die Zeit der Fliese Scan zu reduzieren.
  5. Während des Z-Stapel Bereich einstellen, an mehreren Bereichen der Scheibe überprüfen, insbesondere entlang der Kanten, dass die eingestellten Bereichegeeignet sind.
    HINWEIS: Der z-Bereich wahrscheinlich brauchen wird größer zu sein als selbst die Dicke des Gewebes, weil es sehr schwierig ist, das Gewebe zu erhalten völlig flach zu legen. Beispielsweise mit einem 150 um dicken PCLS, der z-Stapelbereich muß wahrscheinlich auf 200 eingestellt werden - 250 um Beulen und Kurven in der Scheibe aufzunehmen. In Abhängigkeit von dem z-Stack-Bereich und der Größe des Gewebes, jede volle Lungenscan dauert zwischen 7 bis 12 h mit einem 20x-Objektiv. Jede Lunge ist einzigartig und die Einstellungen für jedes Experiment eingestellt werden.

5. Live Cell Imaging von PCLS

  1. Nach 30 min Inkubation von PCLS mit Antikörpern, die Antikörperlösung aus der Schale entfernen und die Scheiben zweimal mit 1 ml kalten Leibovitz-10 spülen.
  2. Pipette 50 ul frische Leibovitz-10 in einen Schlitz eines Kammerdeckgläser (8 Slots). Verwenden eines Spatels PCLS die auf das Medium zu übertragen, Manipulieren es leicht, bis die Scheibe flach ist und sich auszubreiten. Die obigen Verfahrenmüssen schnell Photobleichens zu vermeiden, durchgeführt werden.
  3. Entfernen Sie die 50 & mgr; l Medium mit einer Pipette. Die Scheibe ist so flach wie möglich zu liegen.
    HINWEIS: Es ist akzeptabel, wenn die Ränder der Scheibe sind vertikal an der Wand der Kammer nach oben geklappt. Des Weiteren kann, wenn vorhanden, ein Metall der Platingewicht verwendet werden, um die Scheibe zu verankern, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Siehe die beigefügte Materialliste für ein Beispiel aus Platindraht, der in kleine Gewichte geschnitten und gebogen werden kann.
  4. In einem 4 ° C kalten Raum, Mischung 100 & mgr; l Wachstumsfaktor reduziert, Phenolrot-freier extrazellulärem Matrix mit 100 & mgr; l Leibovitz-10. Verwenden vorgekühlten Pipettenspitzen für diese, oder die extrazelluläre Matrix wird in der Spitze verfestigen.
    Hinweis: Dieses Verhältnis von Matrix und Medium (1: 1) erzeugt ein Gel dicht genug, um die PCLS unten halten in Gewebekulturbedingungen.
  5. Pipette vorsichtig die Matrix zu mischen, und Pipette vorsichtig auf der Oberseite der PCLS, um sicherzustellen, dass das Gel auf das lu gehtng Scheibe, und dass die Scheibe aufschwimmen nicht auf der Oberseite des Gels. Das Gel sollte als Gewicht arbeiten, die PCLS nach unten auf den Boden der Platte zu verankern.
  6. übertragen sorgfältig die Kammerdeckgläser auf einen 37 ° C Inkubator und lassen die Matrix für ~ 5 min verfestigen.
  7. Überträgt die gesamten Kammerdeckgläser auf die vorgewärmte Phase eines konfokalen Mikroskops. Pflegen die Kammer bei 37 ° C im gesamten Bildgebung. CO 2 -Zufuhr wird während der Zellinkubation erforderlich , wenn Leibovitz-Medium verwendet wird .
  8. Stellen Sie den Z-Stapel Bereich und Fliesenbereich basierend auf dem gewünschten Abstand zwischen der Frames. Wenn unter einem konfokalen Mikroskop betrachten, verwenden Sie ein 20x-Objektiv (siehe Materialliste). Mit dem „Kachel“ Werkzeug den Bereich von Interesse in dem Gewebe zu bezeichnen, das „zentrierte Gitter“ -Einstellung verwendet ( zum Beispiel ein 2x2 Gitter zentriert).
  9. Während des Z-Stapel Bereich einstellen, an mehreren Bereichen der Scheibe überprüfen, ob die festgelegten Bereiche geeignet sind.
    HINWEIS: Die zrange wird die Dicke des Gewebes wahrscheinlich entsprechen. Jede Lunge ist einzigartig und die Einstellungen für jedes Experiment eingestellt werden. 2x2 Fliesen und 10 Z-Stapel werden in ~ 1 Bild / 2 min im Allgemeinen zur Folge hat. Sicherstellen, dass die Autofokusfunktion aktiviert ist vor Beginn des Versuchs xy und z-Drift während des Bilderzeugungsperiode zu minimieren.

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Ergebnisse

Um die Position von zwei DC - Untergruppen, CD11b hallo cDCs und CD103 + cDCs, PCLS von C57BL / 6 - Mäusen wurden geschnitten und gefärbt mit monoklonalen Antikörpern (mAb) , spezifisch für CD11c, CD88, CD103 und CD324 (E-Cadherin) zu identifizieren. Antikörper gegen CD324 stain Atemwegsepithelzellen und CD88 auf Makrophagen und Neutrophile angezeigt, aber nicht mehr als 8 cDCs. Dies ermöglichte es uns cDCs von CD11c + Makrophagen ...

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Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll wurde ursprünglich die Positionen von zwei Untergruppen von cDCs in der Lunge sichtbar zu machen entwickelt. Jedoch kann dieses Protokoll ohne weiteres viele verschiedene Zelltypen zu untersuchen, während die Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Zellen und die dreidimensionale Architektur der Lunge angepasst werden. Das letztere Merkmal ist ein wesentlicher Vorteil gegenüber Kultursysteme Zelle und erleichtert die Identifizierung von seltenen Zelltypen. Das Verfahren beruht auf der E...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt zu erklären.

Danksagungen

Wir danken Jeff Tucker, Erica Scappini und Agnes Janoshazi für ihre Hilfe bei der Mikroskopie Ligon Perrow für ihre Verwaltung der Maus Kolonie, und Jun Chen und Michael Sanderson um Hilfe mit dem Gewebe Hobel, und Michael Fessler und Derek Cain für kritische Lektüre das Manuskript. Diese Arbeit wurde durch den intra-Zweig des NIEHS, NIH (ZIA ES102025-09) finanziert, die von der Abteilung für Gesundheit und Human Services gesponsert wiederum.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
C57BL/6J MäuseJackson Laboratory000664
Prox1-TdTomato transgene Mäuse Jackson Laboratory018128B6; 129S-Tg(Prox1-tdTomate)12Nrud/
J OT-II OVA-spezifische TCR x Nur77-GFP transgene MäuseJackson Laboratory004194, 016617B6. Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J 
Rag1 Knock-out-MäuseJackson Laboratory002216B6.129S7-Rag1tm1Mom/J
Ovalbumin, Low Endo, gereinigtWorthington Biochemical CorporationLS003059
Lipopolysaccharide aus Escherichiacoli Sigma-Aldrich Co.L2630-25MG
Polyethylenschlauch (unsteril) 100 ftBD Diagnostic Systems4274210,86 mm Innendurchmesser, 1,27 mm Außendurchmesser
GeneMate Sieb GQA Low MeltAgarose BioExpressE-3112-1252%ige Lösung, gelöst in PBS bei 70 & Grad; C und wurde bei 40 °C gehalten.
Compresstome VF-300 PrecisionaryInstruments, Inc.VF-300
Doppelschneidige Edelstahl-RasierklingeElektronenmikroskopie Sciences72000Einweg; 250/Karton Die Klinge sollte für jede Lunge gewechselt werden.
Krazy Glue All Purpose Instant GelVWR500033-484Allgemein erhältlich für 3 $/Tube in lokalen Drogerien 
Leibovitz's L-15 Medium, kein PhenolrotThermoFisher Scientific21083027
Normales Rattenserum (NRS)Jackson ImmunoResearch Inc.012-000-120
Normales Mausserum (NMS)Jackson ImmunoResearch Inc.015-000-120
Fötales Rinderserum (FBS)HycloneSH30071.03HI
FärbepufferMade in HouseN/APBS mit 0,5 % Rinderserumalbumin, 0,1 % NaN3, pH 7,4
Fc-Blocker (Anti-CD16/32-Antikörper)Made in HouseN/AÜberstand der kultivierten Hybridom-Zelllinie 2.4G2
Anti-Maus CD11b eFluor 450eBioscience48-0112-80Anti-Maus CD11b eFluor 450 (Klon: M1/70)
Anti-Maus CD11c Brilliant Violet 605BioLegend101237Brilliant Violet 605 Anti-Maus CD11c (Klon: M1/70)
Anti-Maus CD11c PhycoerythrineBioscience12-0114-82PE konjugiertes Anti-Maus CD11c (Klon: N418)
Anti-Maus CD11c AllophycocyaninBD Phamingen550261APC-markiertes Anti-Maus CD11c 9Klon: HL3)
Anti-Maus CD88 PhycoerythrinBioLegend135806PE Anti-Maus CD88 (Klon: 20/70)
Anti-Maus CD103 AllophycocyanineBioscience17-1031-82Anti-Maus CD103 APC (Klon: 2E7)
Anti-Maus CD90.2/Thy1.2 eF450eBioscience48-0902-82Anti-Maus CD90.2 eFluor 450 (Klon: 53-2.1)
Anti-Maus CD172a/Sirp1a AllophycocyanineBioscience17-1721-82Anti-Maus CD172a APC (Klon: P84)
Anti-Maus CD324 Brilliant Violet 421BD Horizon564188BV421 Maus Anti-E Cadherin (Klon: 5E8 auch bekannt als 5E8-G9-B4)
Anti-Maus CD324 Alexa Fluor 488eBioscience53-3249-82Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 488 (Klon: DECMA-1)
Anti-Maus CD324 Alexa Fluor 647eBioscience51-3249-82Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 647 (Klon: DECMA-1)
Mikrotiterschalen mit Glasboden 35 mm Petrischale, 14 mm Mikrotiglas, Nr. 1,5 DeckglasMatTek CorperationP35G-1.5-14-C
Nunc Lab-Tek Kammer-DeckglasThermoFisher Scientific155411PK Packung mit 16 Stück
15 mm Deckglas, Nr. 1,5 GlasstärkeMatTek CorperationPCS-1,5-15
Blanker PlatindrahtWorld Precision InstrumentsPTP2010,020" (0,5 mm) Durchmesser in ~1 cm lange Stücke geschnitten und in eine "L"-Form gebogen
ProLong Gold Antifade EindeckmittelThermoFisher ScientificP36934Bei 4 & Grad halten; C, vor Gebrauch auf Raumtemperatur erwärmen.
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basalmembranmatrix, phenolrotfrei, *LDEV-freiCorning356231
Zeiss 880 Multiphotonen-Laser-Scanning-MikroskopCarl ZeissZen Black Softwareversion 8.1, 2012 (Zeiss)
Plan-Apochromat 20X/0,8 M27 Objektiv verleihtCarl Zeiss420650-9901-000

Referenzen

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