pHluorin-getaggt Receptors Verwendung zu überwachen subzelluläre Lokalisierung und Handel

Ashley M. Fox-Loe; Brandon J. Henderson; Christopher I. Richards

doi:10.3791/55466

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Methodenartikel

pHluorin-getaggt Receptors Verwendung zu überwachen subzelluläre Lokalisierung und Handel

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DOI:

10.3791/55466

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16. März 2017

Ashley M. Fox-Loe¹ , Brandon J. Henderson² , Christopher I. Richards¹

¹Department of Chemistry, University of Kentucky, ²Department of Biomedical Sciences, Marshall University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Kennzeichnung für die extrazelluläre Domäne eines Membranproteins mit einem pH-empfindlichen Fluorophors, superecliptic pHluorin (SEP), erlaubt die subzelluläre Lokalisierung, Ausdruck und Handel bestimmt werden. Imaging September-markierten Proteinen mit Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM) ermöglicht die Quantifizierung von Proteinspiegel im peripheren ER und Plasmamembran.

Zusammenfassung

Verstehen Membranprotein Handel, Montage und Ausdruck erfordert einen Ansatz, der zwischen die Personen mit Wohnsitz in intrazellulären Organellen und die lokalisierte auf der Plasmamembran unterscheidet. Traditionelle fluoreszenzbasierte Messungen fehlt die Fähigkeit Membranproteinen zu unterscheiden in unterschiedlichen Organellen befinden. Modernste Methoden überwinden traditionellen Methoden durch pH-sensitive Fluorophore mit Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM) Kopplung. TIRF Beleuchtungs regt die Probe bis zu etwa 150 nm von der Glasprobe Schnittstelle, wodurch Hintergrund abnimmt, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu erhöhen und zu verbessern Auflösung. Das Anregungsvolumen in TIRFM umfasst die Plasmamembran und in der Nähe Organellen wie die periphere ER. Superecliptic pHluorin (SEP) ist ein pH-empfindliche Version von GFP. Genetisch September kodiert, in die extrazelluläre Domäne eines Membranproteins von Interesse positioniert das Fluorophor aufdie luminale Seite des ER und in der extrazellulären Region der Zelle. SEP fluoreszierend, wenn der pH-Wert größer als 6 ist, sondern bleibt in einem Aus-Zustand bei niedrigeren pH-Werten. Daher Rezeptoren SEP fluoreszieren markiert, wenn in dem endoplasmatischen Reticulum (ER) oder beim Einführen in die Plasmamembran (PM) aufhalten, jedoch nicht, wenn sie einer Handel Vesikel oder andere Organellen wie der Golgi beschränkt. Die extrazelluläre pH kann eingestellt werden, um die Fluoreszenz von Rezeptoren auf der Plasmamembran zu diktieren. Der Unterschied in der Fluoreszenz zwischen TIRF Bilder bei neutralen und sauren extrazellulären pH-Wert für die gleiche Zelle entspricht einer relativen Anzahl von Rezeptoren auf der Plasmamembran. Dies ermöglicht eine gleichzeitige Messung von intrazellulären und Plasmamembran-Rezeptoren resident. Single Vesikel Insertionsereignisse kann auch gemessen werden, wenn der extrazelluläre pH neutral ist, entsprechend einem niedrigen pH Handel Vesikel mit der Plasmamembran verschmelzen und in einen fluoreszierenden Zustand übergeht. Diese versatilE-Technik kann die Lokalisierung, Ausdruck und Handel von Membranproteinen zu untersuchen ausgenutzt werden.

Einleitung

Veränderungen der Rezeptor - Expression, Verteilung und Anordnung haben zu einer Vielzahl von Krankheiten verbunden ist, einschließlich Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, zystischer Fibrose und Drogenabhängigkeit ^{^1,} ^{^2,} ^{^3,} ^{^4,} ^5. Zum Beispiel beeinflussen Nikotin und andere Nikotinliganden des Handels mit nikotinischen Acetylcholinrezeptoren (nAChR) , was zu Veränderungen in Handel, Ausdruck und upregulation ^{^1,} ^{^2,} ^....