Galaxy und DAVID haben als beliebte Werkzeuge entstanden, die Ermittler ohne Bioinformatik Ausbildung ermöglichen RNA-Seq Daten zu analysieren und zu interpretieren. Wir beschreiben ein Protokoll für C. elegans Forscher RNA-Seq Versuche, den Zugang und verarbeiten die Daten - Set mit Galaxy und erhalten aussagekräftige biologische Informationen aus den Gen - Listen mit DAVID auszuführen.
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In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Next Generation Sequencing (NGS) Technologien haben die Art der biologischen Untersuchung revolutioniert. Von diesen hat RNA Sequencing (RNA-Seq) als ein leistungsfähiges Werkzeug für die Gen-Expressionsanalyse und Kartierung Transkriptom entstanden. Allerdings erfordert ausgefeilte Rechenkompetenz RNA-Seq Datensätze Handhabung und inhärente Herausforderungen für Biologie Forscher darstellt. Dieser Engpass wurde von dem Open-Access-Galaxy-Projekt gemildert, die RNA-Seq Daten zu analysieren, und die Datenbank für die Annotation, Visualisierung und integrierte Entdeckung (DAVID), ein Gen Ontology (GO) Zeitanalyse-Suite Benutzer ohne Bioinformatik Fähigkeiten ermöglicht, das hilft biologische Bedeutung von großen Datenmengen abzuleiten. Doch für Erstanwender und Bioinformatik Amateure, selbstlernend und Einarbeitung in diesen Plattformen können zeitaufwendig und entmutigend sein. Wir beschreiben einen einfachen Workflow, den C. elegans Forscher RNA zu isolieren Wurm helfen, führen ein RNA-Seq - Experimentund analysiert die Daten mit Galaxy und DAVID-Plattformen. Dieses Protokoll stellt schrittweise Anweisungen für die Verwendung der verschiedenen Galaxy Modulen für den Zugriff auf rohe NGS Daten, Qualitätskontrollen, Ausrichtung und Differentialgenexpressionsanalyse, Führen des Benutzers mit Parametern bei jedem Schritt ein Gen-Liste zu generieren, die für die Anreicherung gescreent werden können von Genklassen oder biologische Prozesse unter Verwendung von DAVID. Insgesamt erwarten wir , dass diese Artikel Informationen zur Verfügung stellen werden , um C. elegans Forscher RNA-Seq Experimente zum ersten Mal sowie häufige Benutzer eine kleine Anzahl von Proben Unternehmen ausgeführt wird .
Einleitung
Die erste Sequenzierung des menschlichen Genoms führte Fred Sanger-Didesoxynucleotid-Sequenzierungsverfahren verwendet wird , dauerte 10 Jahre und kostete schätzungsweise US $ 1 3000000000, 2. Doch in etwas mehr als ein Jahrzehnt seit seiner Gründung, Next-Generation Sequencing (NGS) Technologie hat es ermöglicht, das gesamte menschliche Genom innerhalb von zwei Wochen sequenzieren und für US $ 1.000. Neue NGS Instrumente, die ständig steigenden Geschwindigkeiten von Sequenzierungs-Datenerfassung mit unglaublicher Effizienz, zusammen mit starken Kostensenkungen ermöglichen, revolutionieren die moderne Biologi....
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Protokoll
1. RNA-Isolierung
- Vorsichtsmaßnahmen
- Wischen der gesamte Arbeitsfläche, Instrumente nach unten und Pipetten mit einem handelsüblichen RNase Spray eventuell vorhandenen RNAsen zu beseitigen.
- Handschuhe tragen zu allen Zeiten, sie regelmäßig mit frischen, um während der verschiedenen Schritte des Protokolls zu ändern.
- Verwenden Sie nur Filterspitzen und hält alle Proben auf Eis so viel wie möglich RNA-Abbau zu vermeiden.
HINWEIS: Um die besten Daten von NGS-Plattformen zu erhalten, ist es wichtig, mit qualitativ hochwertigen RNA zu beginnen. RNA-Isolierung und Herstellungsmethoden variieren je nach Probe H....
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Ergebnisse
In C. elegans, Eliminierung der Keimbahn - Stammzellen (GSCs) erstreckt Lebensdauer erhöht Stressresistenz, und erhöht Körperfett 24, 28. Verlust von GSCs entweder durch Laserablation oder durch Mutationen , wie GLP-1, verursacht durch die Aktivierung Lebensdauer Erweiterung eines Netzes von Transkriptionsfaktoren 29 hervorgerufen wird . Ein solcher Faktor, TCER-1 kodiert das worm Homolog.......
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Diskussion
Bedeutung der Galaxy Sequencing-Plattform in der modernen Biologie
Die Galaxy-Projekt hat instrumental werden Biologen ohne Bioinformatik Ausbildung helfen Sequenzierungsdaten mit hohem Durchsatz auf eine schnelle und effiziente Art und Weise zu verarbeiten und zu analysieren. Sobald eine Herkules-Aufgabe betrachtet, diese öffentlich zugängliche Plattform komplexe Bioinformatik-Algorithmen gemacht lief NGS-Daten einen einfachen, zuverlässiger und einfacher Prozess zu analysieren. Neben einer br.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Die Autoren möchten ihren Dank an die Laboratorien, Gruppen und Einzelpersonen zum Ausdruck bringen, die Galaxy und DAVID entwickelt hat und damit gemacht NGS für die wissenschaftliche Gemeinschaft allgemein zugänglich. Die Hilfe und Rat von Kollegen an der University of Pittsburgh während unserer Bioinformatik Ausbildung zur Verfügung gestellt werden anerkannt. in Aging Award (AG-NS-0879-12) und einen Zuschuss von der National Institutes of Health (R01AG051659) zu AG Diese Arbeit wurde von einer Ellison Medical Foundation New Scholar unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| RNase-Sprühnebel | Fisher Scientific | 21-402-178 | |
| Trizol | Ambion | 15596026 | |
| Sonicator | Sonics Vibra-Zelle | VCX130 | |
| Zentrifuge | Eppendorf | 5415C | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 288306 | |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A416P-4 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2705HC | |
| RNasefreies Wasser | Fisher Scientific | BP561-1 | |
| Bioanalysator | Agilent | G2940CA | |
| Mac/PC |
Referenzen
- Venter, J. C., et al. The sequence of the human genome. Science. 291 (5507), 1304-1351 (2001).
- Lander, E. S., et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409 (6822), 860-921 (2001).
- Afgan, E., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
