Mit einer vollständigen immunhistochemischen Methode, um die Innervation der Gallenwege zu studieren Suncus murinus

Summary

Ein ganzheitlicher immunhistochemischer Ansatz, um die Neurofilament-Protein-Expression im extrahepatischen Gallengang in Suncus murinus zu visualisieren. Wird hier vorgestellt. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Innervation aller viszeralen Organe in S. murinus oder anderen Spezies zu analysieren.

Abstract

Diese Arbeit beschreibt die Vollständige Immunhistochemie Färbung Methode im Detail, mit Neurofilament Protein-Antikörper, um die Innervation der Gallenwege in Suncus murinus ( S. murinus   ). Zuerst wurde das Exemplar von S. murinus seziert und in 4% Paraformaldehyd (PFA) fixiert. Zweitens wurde eine enzymatische Behandlung und potentielle endogene Peroxidase-Inaktivierung durchgeführt. Die Probe wurde dann dem primären Antikörper, Anti-Neurofilament-Protein-Antikörper, für 3-6 Tage ausgesetzt. Es wurde dann mit dem sekundären Antikörper inkubiert, der mit Meerrettichperoxidase konjugiert war. Die Farbreaktion wurde durch Umsetzen der Probe mit einem 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) -Substrat aufgedeckt. Diese Methode kann angewendet werden, um die Innervation aller viszeralen Organe zu analysieren. Darüber hinaus kann dieses Protokoll auch angepasst werden, um andere neuronale Antikörper zu testen, aber die Optimierung der antibodiEs sollte zuerst getan werden. Diese Methode wurde ursprünglich von Kuratani und Tanaka ^{1 , 2 , 3} eingeführt.

Introduction

Das Haus Moschusspitzmaus , Suncus murinus , gehört zur Ordnung Insektivora und die Familie Soricidae. Dieses kleine Säugetier ist in Südostasien verteilt und bewohnt Häuser und Rasenflächen, die in der Nähe von menschlichen Wohnräumen oder Viehstiften liegen ⁴ . Diese Spezies weist allgemeine morphologische Merkmale auf, die den Menschen ähnlicher sind als andere Labortiere wie Maus, Ratte und Kaninchen ⁵ . Bisher wurde eine Vollmontage-Immunfärbung mit einem peripheren Neuron-Marker für S. murinus- Neurofilament-Protein (NFP) verwendet, um die peripheren Nerven in der Bauchspeicheldrüse ⁶ , der großen Duodenalpapille ⁷ , dem Pylorus ⁸ , der Gallenblase ⁵ und dem extrahepatischen Gallengang ^{9 zu} markieren.

NFP ist ein makromolekularer Komplex, der Teil des reifen neuronalen Zytoskeletts ist. Neurofilament-verwandtes ProteinS Zwischenwechsel zwischen NFP und dem Zygosom. Sowohl die Enzymfunktion als auch die Struktur der Linkerproteine ​​werden durch NFP ¹⁰ reguliert. Der NFP-Komplex besteht aus drei Polypeptiden: NF-L (70 kDa), NF-M (150-160 kDa) und NF-H (200 kDa). NFP kann in neuronalen Axonen sowohl im zentralen als auch im peripheren Nervensystem gefunden werden. Anti-Human-NFP-Antikörper wurde gezeigt, um Axone des zentralen und peripheren Nervensystems zu etikettieren. Anatomische und elektrophysiologische Untersuchungen haben gezeigt, dass der Sphinkter, die Gallenblase und der proximale Magen-Darm-Trakt ^{11 , 12 , 13 , 14} verbunden sind. Allerdings sind die morphologischen Merkmale ihrer neuronalen Verbindungen noch nicht definiert.

Diese Arbeit zeigt die Verwendung einer ganz-montierten immunhistochemischen Färbemethode, um die Innervation des S. murinus bil zu etikettierenIary Trakt mit einem NFP-Antikörper.

Protocol

Alle experimentellen Verfahren wurden vom Tokyo Metropolitan University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt. Die Tiere wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren des Kanadischen Rates für Tierpflege untergebracht und behandelt . Wir benutzten Tiere, die im Functional Morphology Laboratory, Department of Frontier Health Sciences, Tokyo Metropolitan University, Japan gezüchtet und gepflegt wurden.

1. Tierpflege und Wohnraum

1. Erhalten Sie 7 S. murinus (3 Frauen und 4 Männer mit einem Gewicht von 70-90 g) aus einer geschlossenen Zuchtkolonie.
2. Käfig der S. murinus einzeln nach der Entwöhnung (20 d nach der Geburt) in Plastikkäfige ausgestattet mit einem hölzernen Nistkasten mit Papierstreifen. Halten Sie sie in einem konventionell konditionierten Tierraum: 23-27 ° C, keine Feuchtigkeitsregelung und ein 12:12 h Licht: dunkler Zyklus. Versorgung commercPellets und Wasser ad libitum.

2. Gewebevorbereitung

1. Zur Herstellung von 4% (Gew./Vol.) Paraformaldehyd (PFA) werden 40 g PFA in 1000 ml 0,01 M Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) gelöst. In einem Abzug, mischen mit einem Wirbel, bis die Lösung klar ist. Die 4% PFA O / N bei 4 ° C aufbewahren.
   Achtung: Bei der Handhabung von PFA geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) tragen.
2. Um das Tier zu perfundieren und zu fixieren, es mit Äther zu betäuben und dann eine intraperitoneale Injektion von Somnopentyl (Pentobarbital-Natrium, 0,6 ml / kg Körpergewicht) zu geben.
3. Nachdem das Tier vollständig narkotisiert ist, öffne die Bauchhöhle mit einem Skalpell und schaffe einen Mittellinien-Bauchschnitt 3 cm lang. Während man die untere Hohlvene zum Exsanguinieren eindringt, führe einen Katheter nachträglich in die Bauchaorta ein, und zwar auf dem Niveau unmittelbar oberhalb der Verzweigung dieser Arterie in die Arteria iliaca-Arterien.
4. Injizieren Sie Somnopentyl (Pentobarbital soDium, 1,0 mL / kg Körpergewicht). Nach vollständiger Euthanasie mit 0,01 M PBS (pH 7,4) und dann mit 4% PFA in einem Abzug.
5. Nach der Perfusion 2-3 ml weißer Neopren-Latex (verdünnter weißer Neopren-Latex 3: 2 mit destilliertem Wasser (DW)) einspritzen, um die Blutgefäße zu etikettieren.
6. Entleeren Sie die Bauchorgane, einschließlich der Leber, Gallenblase, gemeinsame Gallengang, Duodenum und Pankreas en bloc, mit den verwandten Nerven und Gefäßen.
7. Injizieren Sie etwa 0,1 ml blauen Neopren-Latex (fügen Sie einen Tropfen blauer Tinte zu 10 ml des verdünnten weißen Neopren-Latex hinzu) an die Gallenblase, um das Gallensystem zu markieren.
8. Nach-Fixierung über Nacht mit 4% PFA bei 4 ° C für Vollmontage-Immunfärbung.
   Achtung: PFA ist giftig. Vermeiden Sie die Handhabung von PFA direkt. PFA sollte in einem Abzug verwendet werden.

3. Vollständige Immunhistochemie

Anmerkung: Während des Protokolls, einschließlich während des Waschens, Antikörperinkubation und Färbung, thDie Probe muss auf dem Nutator bleiben, vorsichtig bei RT oder bei 4 ° C schaukeln ^.

1. Tag 1: Enzymatische Behandlung und Inaktivierung potentieller endogener Peroxidase
   1. Die vorbereitete Probe mit DW 4x für jeweils 1 h bei RT in einer entsprechend bemessenen Glasampulle waschen. Führen Sie die Probe sanft auf die Nutator, um die PFA zu entfernen. Vermeiden Sie es, die Probe beim Austausch von Lösungen zu beschädigen.
   2. Zur Herstellung von 1% (w / v) Orthopiodsäure, löst man 1 g Orthopiodsäure in 100 ml DW auf.
   3. Inkubieren Sie die Probe in 1% orthoperiodischer Säure für 20 min bei RT, um eine intrinsische Peroxidase-Reaktion zu verhindern.
   4. 0,004% (w / v) Papain durch Auflösen von 0,004 g Papain in 100 ml 0,025 mol / l Tris-HCl-Puffer (pH 7,6) vorbereiten.
   5. Die Probe mit DW für 10 min bei RT waschen.
   6. Inprobieren Sie die Probe in frisch zubereiteten 0,004% Papain für 2 h bei 37 ° C in einem konstanten Temperaturbad mit sanftem Schütteln.
   7. Waschen Sie das Exemplar mit DW für 50-60 min bei RT.
   8. Die Probe in 4% PFA bei 4 ° CO / N aufbewahren.
2. Tag 2: Enzymatische Behandlung
   1. Waschen Sie die gespeicherte Probe mit DW 4 mal für jeweils 1 h bei RT.
   2. Inprobieren Sie die Probe in frisch zubereiteten 0,004% Papain für 2 h bei 37 ° C in einem konstanten Temperaturbad mit sanftem Schütteln.
   3. Die Probe mit DW für 50-60 min bei RT waschen. Die Probe in 4% PFA bei 4 ° CO / N aufbewahren.
3. Tag 3: Einfrieren Behandlung
   1. Waschen Sie die gespeicherte Probe mit DW 4x für 1 h jeweils bei RT, wie oben.
   2. 2% (w / v), 5% (w / v) und 10% (w / v) Saccharose durch Auflösen von 2,5 g, 5 g bzw. 10 g Saccharose in 100 ml 0,01 M PBS ( PH 7,4).
   3. Tauchen Sie die Probe in 2,5% (w / v), 5% (w / v) und 10% (w / v) Saccharose für jeweils 30 min ein.
   4. Die Probe bei -20 ° C für 30 - 60 min einfrieren und bei RT vollständig auftauen; Wiederholen Sie den Zyklus 3x.
   5. Oben2% Triton X-100 (v / v) abgeben, 2 ml Triton X-100 zu 100 ml 0,01 M PBS (pH 7,4) zugeben.
   6. Die Probe in 2% Triton X-100 bei 4 ° CO / N aufbewahren.
4. Tag 4: Inkubation des primären Antikörpers
   1. Die Verdünnungslösung des primären Antikörpers wird durch Auflösen von 0,2 g Rinderserumalbumin (BSA), 0,3 ml Triton X-100 und 0,1 g Natriumazid in 100 ml 0,01 M PBS (pH 7,4) hergestellt.
      Achtung: Natriumazid ist akut toxisch. Einatmen und Berühren müssen vermieden werden. Tragen Sie geeignete PPE.
   2. Verdünnen Sie den primären Antikörper (NFP) 1: 600 im obigen Verdünnungspuffer (Schritt 3.4.1). Inkubieren Sie die Probe mit NFP-Antikörper bei 4 ° C für 3-6 Tage, wobei die Probe vorsichtig auf dem Nuss- Größere Exemplare benötigen erhöhte Inkubationszeiten.
5. Sekundäre Antikörper-Inkubation
   1. Waschen Sie die Probe in PBS 4x für 1 h jeweils bei RT, um ungebundenen primären Antikörper zu entfernen.
   2. Die Verdünnungslösung für den sekundären Antikörper durch Auflösen von 0,2 g BSA und 0,3 ml Triton X-100 in 100 ml 0,01 M PBS (pH 7,4) vorbereiten.
   3. Verdünnen Sie den sekundären Antikörper (Peroxidase-konjugiertes, affinitätsgereinigtes Schaf-anti-Maus-IgG-HRP) 1: 600 im Verdünnungspuffer (Schritt 3.5.2). Inkubieren Sie die Probe mit dem sekundären Antikörper bei 4 ° C für 3 d und halten Sie die Probe vorsichtig auf den Nutator.
6. Färbung
   1. Vorbereitung der DAB-Farblösung durch Zugabe von 0,002 g 3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB) zu 100 ml 0,05 mol / l Tris-HCl-Puffer (pH 7,6) unter einem Abzug, wobei die Lösung im Dunkeln gehalten wird.
   2. Waschen Sie die Proben bei RT in PBS 4x für jeweils 1 h.
   3. 10 μl 30% iges H ₂ O ₂ in frisch hergestellter DAB-Farblösung zugeben und mit der Lösung bei 4 ° CO / N oder für 3 d inkubieren, während sie vorsichtig auf den Nuss-
   4. Stoppen Sie die Reaktion von plaCing die Probe in PBS mit 0,04% Natriumazid, wenn die optimale Färbeintensität erreicht ist.
      HINWEIS: Vermeiden Sie die Verwendung von Natriumazid bis zu diesem Schritt, da es die Meerrettichperoxidase hemmt.
7. Bildgebung des gefärbten Gewebes
   1. Sorgfältig die Probe auf eine Petrischale (5 cm hoch, 10 cm im Durchmesser) mit PBS übertragen. Erfassen Sie ganzheitliche Bilder mit einer Kamera, die auf einem Stereomikroskop montiert ist.
      HINWEIS: Vollständig gefärbtes Gewebe sollte abgebildet werden, während es vollständig in PBS auf einer transparenten Glasschale eingetaucht wird.

Results

Die Abbildungen 1 - 4 zeigen typische Ergebnisse für NFP-positive Nervenfasern im extrahepatischen Gallengang in S. murinus . Der Antikörper gegen NFP markierte reproduzierbar die Innervation im gesamten Bild des extrahepatischen Gallenganges (Abbildung 1 ), Gallenblase (Abbildung 2 ), oberer Gallengang (Abbildung 3 ) und Duodenalpapillen (...

Discussion

Diese Arbeit beschreibt das experimentelle Verfahren zur Visualisierung der Innervation des extrahepatischen Gallenweges unter Verwendung eines Antikörpers gegen Neurofilamentprotein. Dieses Protokoll wurde aus dem von Kuratani und Tanaka ^{1 , 2 , 3} beschriebenen Protokoll angepasst.

Für dieses Experiment planen Sie die Timeline für jedes der Experimente, da der Voll-Mount-Färbe-Ansatz für 2-3 Wochen...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
orthoperiodische Säure	Wako	162-00732
Papain	Wako	164-00172
Rinderserumalbumin (BSA)	Wako	010-15131
Natriumazid	Nacalai Tesque	312-33
Neurofilament Protein (NFP) Antikörper	Dako	M0762, Los 089, Klon: 2F11
Peroxidase-konjugiert affinitätsgereinigtes Anti-Maus-IgG-HRP	MBL	Code 330
3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB)	Wako	349-00903
Imidazol	Sigma	I-0125