Nachweis der microRNA-Expression in der peritonealen Membran von Ratten unter Verwendung der quantitativen Echtzeit-PCR

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll für den Nachweis der microRNA-Expression in der Ratten-Peritonealmembran unter Verwendung einer quantitativen Echtzeit-Reverse-Transkription-Polymerase-Kettenreaktion vor. Diese Methode eignet sich zur Untersuchung des microRNA-Expressionsprofils in der Ratten-Peritonealmembran in mehreren pathologischen Zuständen.

Abstract

MicroRNAs (miRNAs) sind kleine nicht-kodierende RNAs, die die Messenger-RNA-Expression posttranskriptional regulieren. Das miRNA-Expressionsprofil wurde in verschiedenen Organen und Geweben bei Ratten untersucht. Allerdings sind Standardmethoden für die Reinigung von miRNAs und den Nachweis ihrer Expression in der Ratten-Peritonealmembran nicht gut etabliert. Wir haben eine wirksame und zuverlässige Methode entwickelt, um miRNAs mit quantitativer Echtzeit-Reverse-Transkription Polymerase Kettenreaktion (qRT-PCR) in Ratten-Peritonealmembran zu reinigen und zu quantifizieren. Dieses Protokoll besteht aus vier Schritten: 1) Reinigung der Peritonealmembranprobe; 2) Reinigung der Gesamt-RNA einschließlich miRNA aus der Peritoneal-Membranprobe; 3) reverse Transkription von miRNA zur Erzeugung von cDNA; Und 4) qRT-PCR zur Detektion der miRNA-Expression. Mit diesem Protokoll haben wir erfolgreich festgestellt, dass die Expression von sechs miRNAs (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 und miRNA-34a-5p) zunahmSignifikant in der Peritonealmembran eines Ratten-Peritoneal-Fibrose-Modells im Vergleich zu denen in Kontrollgruppen. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um das Profil der miRNA-Expression in der Peritonealmembran von Ratten in vielen pathologischen Zuständen zu untersuchen.

Introduction

MicroRNAs (miRNAs) sind kurze, nicht-kodierende RNAs, die post-transkriptional die messenger RNA (mRNA) Expression ¹ regulieren. Veränderungen in der Expression von miRNAs regulieren die Expression vieler mRNAs, die in verschiedenen pathologischen Zuständen, einschließlich Krebs, Entzündungen, Stoffwechselstörungen und Fibrose, ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8} , eine zentrale Rolle spielen. Daher haben miRNAs als neuartige Biomarker und therapeutische Ziele ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8} Potenzial. Das miRNA-Expressionsprofil wurde in verschiedenen Ratten bestimmtOrgane und Gewebe, einschließlich Leber, Herz, Lunge und Niere ⁹ . Allerdings sind Standardmethoden zur Reinigung und Detektion von miRNAs in der Ratten-Peritonealmembran nicht gut etabliert.

Das Gesamtziel dieses Protokolls besteht darin, miRNAs in der Ratten-Peritonealmembran erfolgreich zu reinigen und zu detektieren. Zuerst wurde die Peritonealmembranprobe unter Verwendung eines Glashomogenisators homogenisiert, gefolgt von einer Exposition gegenüber einem Biopolymer-Zerkleinerungssystem in einer Mikrozentrifugen-Spinsäule ¹⁰ . Als nächstes wurde die Gesamt-RNA, die miRNA enthielt, aus der Peritoneal-Membranprobe unter Verwendung einer Spin-Säule ^{10 auf} Siliciumdioxid-Membran-Basis gereinigt. Dann wurde cDNA aus der gereinigten Gesamt-RNA unter Verwendung von reverser Transkriptase, Poly (A) -Polymerase und Oligo-dT-Primer ¹¹ synthetisiert. Schließlich wurde die Expression von miRNA durch qRT-PCR unter Verwendung eines interkalierenden Farbstoffs ^{11 bestimmt} . Die Begründung dieses Protokolls ist bAuf früheren Studien, die eine signifikante Reinigung und Nachweis von miRNA in Geweben durch ein einfaches Verfahren ^{8 , 10 , 11} zeigten. Es wurde berichtet, dass die Verwendung eines Biopolymer-Zerkleinerungssystems in einer Mikrozentrifugen-Spinsäule und einer Spin-Säule auf Siliciumdioxid-Membran-Basis eine hochqualitative Gesamt-RNA aus den Geweben ¹⁰ reinigen kann. Das Verfahren zur Synthese von cDNA aus gereinigter Gesamt-RNA unter Verwendung von reverser Transkriptase, Poly (A) -Polymerase und Oligo-dT-Primer und das Verfahren zum Nachweis der miRNA-Expression durch qRT-PCR unter Verwendung eines interkalierenden Farbstoffs in diesem Protokoll wurde mit hoher Genauigkeit und einer hohen Genauigkeit beschrieben Empfindlichkeit ¹¹ Darüber hinaus ist dies ein einfacher Prozess, der Zeit spart und technische Fehler verhindert Daher ist dieses Protokoll in Studien nützlich, die einen hochgenauen und empfindlichen Nachweis von miRNA in der Ratten-Peritonealmembran in einem breiten Bereich von pathologischen Zuständen erfordern.

Protocol

Alle Tierversuchsprotokolle wurden vom Tierethikkomitee der Jichi Medical University genehmigt und wurden im Einklang mit den Richtlinien für die Verwendung und Pflege von Experimental Animals von der Jichi Medical University Guide für Labortiere durchgeführt.

1. Peritoneum Probensammlung

1. Sammeln Sie die folgenden Gegenstände: 50 ml Zentrifugenröhrchen mit Baumwolle in Isofluran, Korkplatte, Petrischale mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), chirurgischer Schere und Pinzette.
2. Euthanasieren Sie eine Ratte mit einer Überdosierung von Isofluoran, dann sprühen Sie die Bauchhaut der Ratte mit 70% Ethanol und montieren Sie die Ratte auf dem Korkenblatt auf dem Rücken.
3. Machen Sie einen Längsschnitt in der Bauchhaut, Muskel und Peritoneal Membran mit der Schere und Pinzette.
4. Heben Sie die Peritonealmembran mit der Pinzette auf und machen Sie horizontale Einschnitte auf ihren oberen Teil entlang der untersten Rippe Knochen unter dem Zwerchfell und auf seinem lOwer Seite auf der lateralen Region mit der chirurgischen Schere. Als nächstes machen Sie seitliche Längsschnitte, um die Peritonealmembran aus dem Körper mit der chirurgischen Schere zu entfernen. Dann waschen Sie es mit PBS in einer Petrischale.
5. Schneiden und trimmen 20 mg (3-5 mm ² ) der Peritonealmembranproben, die eine geeignete Größe für die folgenden Schritte ist, unter Verwendung der chirurgischen Scheren und der Pinzette.

2. Reinigung von Gesamt-RNAs aus Peritoneal-Membranproben

HINWEIS: Hier werden Peritonealmembranproben mit einem Gewicht von 20 mg unter Verwendung eines Glashomogenisators und eines Biopolymer-Zerkleinerungssystems in einer Mikrozentrifugen-Spinsäule homogenisiert. Dann wird die Gesamt-RNA aus der Peritoneal-Membranprobe unter Verwendung einer Spin-Säule auf Siliciumdioxid-Membran-Basis isoliert.

1. Sammeln Sie folgende Gegenstände: 1,5 oder 2,0 ml Mikrozentrifugenröhrchen, 100% Ethanol, Chloroform, Glashomogenisator, Eis, Biopolymer-Zerkleinerungssystem in einer Mikrozentrifugen-Spinsäule ¹⁰ , Siliciummembran-basierte Spinsäule ¹⁰ , Phenol / Guanidin-basiertes Lyse-Reagenz, Waschpuffer einschließlich Guanidin und Ethanol (Waschpuffer 1) und Waschpuffer einschließlich Ethanol (Waschpuffer 2).
2. Setzen Sie eine 20 mg Peritonealmembranprobe in einen Glashomogenisator und fügen Sie 700 μl des Phenol / Guanidin-basierten Lyse-Reagens hinzu.
3. Homogenisieren Sie die Peritoneal-Membranprobe durch langsames Drücken der Pistille auf die Probe mit Verdrehen. Wiederholen Sie diesen Vorgang mehrere Dutzend Mal auf Eis, bis die Peritonealmembranprobe vollständig in das Phenol / Guanidin-basierte Lyse-Reagens aufgelöst ist.
4. Zur weiteren Homogenisierung wird das homogenisierte Lysat zum Biopolymer-Zerkleinerungssystem in einer Mikrozentrifugen-Spinsäule in einem 2,0-ml-Sammelröhrchen überführt. Dann bei 14.000 xg für 3 min bei 4 ° C zentrifugieren.
5. Übertragen Sie das homogenisierte Lysat in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen.
6. Füge dem homogenisierten Lysat 140 & mgr; l Chloroform hinzu und bedecke die WanneE sicher. Dann mischen Sie die Röhre durch Inversion für 15 s.
7. Die Proben für 2-3 min bei Raumtemperatur inkubieren. Dann zentrifugiere sie bei 12.000 xg für 15 min bei 4 ° C.
8. Übertragen Sie den Überstand (üblicherweise 300 μl) in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen, ohne den Niederschlag zu stören, und fügen Sie 1,5x seines Volumens (üblicherweise 450 μl) 100% igem Ethanol hinzu. Dann mischen Sie die Probe durch Vortexen für 5 s.
9. Pipettieren Sie bis zu 700 μl der Probe in eine Spin-Säule auf Siliciumdioxid-Membran, die in einem 2,0 ml Sammelröhrchen platziert ist. Schließen Sie die Kappe der Säule. Dann zentrifugiere es bei 15.000 xg für 15 s. Nach der Zentrifugation den Durchfluss im Sammelrohr verwerfen.
10. Füge 700 μl Waschpuffer 1 zur Siliciummembran-basierten Spin-Säule hinzu, um die Probe streng zu waschen. Schließen Sie die Kappe der Säule. Dann zentrifugiere es bei 15.000 xg für 15 s. Nach der Zentrifugation den Durchfluss im Sammelrohr verwerfen.
11. Füge 500 μl Waschpuffer 2 zur Siliciumdioxid-Membran hinzuRane-basierte Spin-Säule, um jede Spur von Salz zu entfernen. Schließen Sie die Kappe der Säule. Dann zentrifugiere es bei 15.000 xg für 15 s. Nach der Zentrifugation den Durchfluss im Sammelrohr verwerfen.
12. Wiederholung 2.11.
13. Zentrifugieren Sie die Siliciummembran-basierte Spinsäule erneut bei 15.000 xg für 1 min. Nach der Zentrifugation den Durchfluss im Sammelrohr verwerfen.
14. Legen Sie die Siliciummembran-basierte Spin-Säule in ein neues 1,5-ml-Sammelröhrchen. Dann 25 μl RNase-freies Wasser in die Säule geben. Schließen Sie die Kappe der Säule. Lassen Sie die Probe bei Raumtemperatur für 5 min. Dann zentrifugiere es bei 15.000 xg für 1 min.
15. Übertragen Sie das 25 & mgr; l Eluat, das Gesamt-RNA enthält, in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Dann bei -80 ° C vor Gebrauch aufbewahren.

3. Reverse Transkription der Gesamt-RNA

HINWEIS: Referenz und Einhaltung der Mindestinformationen für die Veröffentlichung von quantitativen Echtzeit-PCR-ExpersIments (MIQE) Leitlinien fördern eine bessere Praxis und helfen bei der Erlangung zuverlässiger und eindeutiger Ergebnisse ¹² .
ANMERKUNG: Hier werden insgesamt 1,0 μg isolierte RNA unter Verwendung der reversen Transkriptase, der Poly (A) -Polymerase und des Oligo-dT-Primers umgekehrt transkribiert.

1. Sammeln Sie folgende Gegenstände: 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen; Acht-Well-Streifenrohre; RNase-freies Wasser; Eis; Reverse Transkriptase Kit (siehe Material Tabelle) ¹¹ .
2. Bereiten Sie eine Master-Mix-Lösung vor, die 2,0 μl 10x Nukleinsäuremischung, 2,0 μl reverse Transkriptase-Mischung (aus dem Kit) und 4,0 μl 5x Hi-Spec-Puffer für insgesamt 8,0 μl pro Röhrchen enthält.
3. 8,0 μl Master-Mix-Lösung (aus dem Kit) in jedes Röhrchen geben.
4. Messen Sie die Menge der Gesamt-RNAs mit einem Spektrophotometer. Addieren Sie 1,0 μg isolierte Gesamt-RNAs, die aus der Peritoneal-Membranprobe zu jedem Röhrchen gereinigt wurden.
   HINWEIS: qRT-PCR kann usi durchgeführt werdenNg Gesamt-RNAs als Vorlage ohne reverse Transkription für die Qualitätskontrolle von gereinigten Gesamt-RNAs. Wenn irgendeine DNA kontaminiert ist, werden unerwartete Amplifikationsprodukte durch qRT-PCR beobachtet.
5. Füge RNase-freies Wasser zu jedem Röhrchen zu insgesamt 20 μl hinzu. Dann gründlich durch Pipettieren mischen und für 15 s zentrifugieren.
6. Die Proben für 60 min bei 37 ° C inkubieren. Sofort 5 min bei 95 ° C inkubieren.
   HINWEIS: Dieser Schritt kann in einem Thermocycler durchgeführt werden.
7. CDNA in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführen und zehnmal (1:10) mit RNase-freiem Wasser verdünnen.
8. Die verdünnte cDNA auf Eis vorübergehend aufbewahren und bei -80 ° C für lange Zeit vor Gebrauch.

4. qRT-PCR von miRNA

HINWEIS: qRT-PCR von miRNA wird mit interkalierenden Farbstoff durchgeführt. Hier wurden Primer für RNA, U6 kleine nukleäre 2 (RNU6-2), miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 und miRNA-34a-5p wurden benutzt.

1. Sammeln Sie folgende Gegenstände: 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen, 96-Well-Reaktionsplatte für qRT-PCR, Klebefolie für die 96-Well-Reaktionsplatte, miRNA-spezifische Primer, grüner Farbstoff-basierter PCR-Kit (siehe Materialtabelle) ¹¹ und a Echtzeit-PCR-Instrument.
2. Eine Mastermischung, die 12,5 & mgr; l 2 × PCR-Mastermischung enthält, wurden 2,5 & mgr; l 5 & mgr; M pro miRNA-Primer, gelöst in nukleasefreiem Wasser, und 1,25 & mgr; l 10x Universalprimer für jede Vertiefung hergestellt.
3. 22,5 & mgr; l Mastermix in jede Vertiefung der 96-Well-Platte geben.
4. Füge 2,5 μl Template-cDNA zu jeder Vertiefung hinzu.
5. Die Platte mit Klebefolie für die 96-Well-Reaktionsplatte abdichten. Dann die Platte bei 1000 xg für 30 s zentrifugieren.
6. Führen Sie das PCR-Cycling-Programm mit dem Echtzeit-PCR-Instrument und der Software wie folgt aus.
   1. Stellen Sie die Platte in das Echtzeit-PCR-Instrument ein. In der Echtzeit-PCR-Software definieren wir experimentelle Eigenschaften (Eingang experimentellName, wählen Sie "96-wells" für die experimentelle Art von Instrument, wählen Sie "2 ^{- ΔΔCT-} Methode" für die Quantifizierung Methode, wählen Sie "SYBR grüne Reagenzien" für das Reagenz, um die Zielsequenz zu erkennen, wählen Sie "Standard-Rampenzahl" für die Instrument laufen).
   2. Dann ordnet man den Samples Namen zu und setzt miRNAs in jeder Vertiefung. Die Proben werden immer doppelt oder dreifach getestet, um genügend Daten zur Validierung der Ergebnisse zu erhalten. Wählen Sie Referenzmuster und endogene Kontrolle. Wählen Sie "none" für den Farbstoff, um als passive Referenz zu verwenden.
   3. Geben Sie ein Reaktionsvolumen von "20 μL" und die folgenden PCR-Zyklusbedingungen in der Echtzeit-PCR-Software gemäß den Anweisungen ein: Vorinkubation bei 95 ° C für 15 min und dann 40 Zyklen der Denaturierung bei 94 ° C für 15 s , Glühen bei 55 ° C für 30 s und Verlängerung bei 70 ° C für 30 s.
7. Analysieren Sie qRT-PCR Daten uSingen die Software des Echtzeit-PCR-Instruments. Vergewissern Sie sich, dass die Schwelle und die Grundlinie, die automatisch durch Software bestimmt werden, in jeder Vertiefung angemessen sind.
8. Überprüfen Sie den Schwellenzyklus der Ziel-miRNAs in jeder Probe. Der Schwellenzyklus ist der Schnittpunkt zwischen einer Verstärkungskurve und einer Schwellenlinie. Dann normalisieren Sie das Expressionsniveau von Ziel-miRNAs gegen RNU6-2 als endogene Kontrolle und berechnen das relative Expressionsniveau von Ziel-miRNAs unter Verwendung des 2- ^ΔΔCT- Verfahrens ¹³ .
   HINWEIS: Es sollte beachtet werden, dass die Stabilität des Expressionsniveaus der endogenen Kontrolle miRNA überprüft werden sollte. In diesem Experiment wurde RNU6-2 bestätigt, dass es auf hohem Niveau exprimiert wurde und relativ invariant über jede Gruppe hinweg war.

Results

Die hier vorgestellten Ergebnisse basieren auf unserer bisher gemeldeten Studie ⁸ . Wir untersuchten das miRNA-Expressionsprofil in der peritonealen Fibrose. Peritoneale Fibrose ist eine große Komplikation bei der Peritonealdialyse. Es ist durch den Verlust der mesothelialen Zellmonoschicht und die überschüssige Akkumulation von extrazellulären Matrixkomponenten gekennzeichnet und ist mit dem Peritonealmembranversagen ^{14 ,}

Discussion

Unter Verwendung des in diesem Manuskript dargestellten Protokolls wurden miRNAs in der Ratten-Peritonealmembran erfolgreich gereinigt und unter Verwendung von qRT-PCR nachgewiesen. Die Zuverlässigkeit der qRT-PCR-Datenanalyse hängt von der Qualität der gereinigten miRNAs ab. Daher kann die Reinheit von miRNAs vor der qRT-PCR durch das Verhältnis der Extinktion bei 260 nm zu dem bei 280 nm überprüft werden, was mit einem Spektrophotometer gemessen werden kann. Wenn eine signifikante Amplifikation von miRNA nicht unter V...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
QIA-Aktenvernichter	Qiagen	79654	Biopolymer-Zerkleinerungssystem in einer Mikrozentrifuge Spin-Säule
miRNeasy Mini-Kit	Qiagen	217004	Spin-Säule auf Kieselsäuremembranbasis
QIAzol Lysereagenz	Qiagen	79306	Lysereagenz auf Phenol-/Guanidinbasis
Puffer RLT	Qiagen	79216	Waschpuffer 1
Puffer RWT	Qiagen	1067933	Waschpuffer 2
miScript II RT Bausatz	Qiagen	218161	beinhaltet 10 mal Nukleinsäure-Mix, der Desoxynukleotide, Ribonukleotidtriphosphate und Oligo-dT-Primer enthält; miScript Reverse Transkriptase-Mix mit Poly(A)-Polymerase und Reverser Transkriptase und; miScript HiSpec Puffer
miScript SYBR Green PCR-Kit	Qiagen	218073	enthält QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix und miScript Universal Primer
RNU6-2 Primer.	Qiagen	MS00033740
miRNA-142-3p Primer	nicht offenbart Qiagen	MS00031451	5'-UGUAGUGUUUCC UACUUUAUGGA-3'
miRNA-21-5p Primer	Qiagen	MS00009079	5'-UAGCUUAUCAG ACUGAUGUUGA-3'miRNA-221-3p
Primer	Qiagen	MS00003857	5'-AGCUACAUUGU CUGCUGGGUUUC-3'miRNA-223-3p
Primer	Qiagen	MS00033320	5'-UGUCAGUUUG UCAAAUACCCC-3'miRNA-34a-5p
Primer	Qiagen	MS00003318	5'-UGGCAGUGUCU UAGCUGGUUGU-3'miRNA-327
Primer	Qiagen	MS00000805	5'-CCUUGAGGGG CAUGAGGGU-3'MicroAmp
Optische 96-Well-Reaktionsplatte für qRT-PCR	Thermo Fisher Scientific	4316813	96-Well-Reaktionsplatte
MicroAmp Optischer Klebefilm	Thermo Fisher Scientific	4311971	Klebefolie für 96-Well-Reaktionsplatte
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	4472380	real-time PCR Gerät
QuantStudio 12K Flex Software Version 1.2.1.	Thermo Fisher Scientific	4472380	real-time PCR Gerätesoftware
Methylglyoxal	Sigma-Aldrich	M0252
Midperic	Terumo	nicht zugewiesen	Peritonealdialyseflüssigkeit
Sprague– Dawley Rats	SLC	nicht zuweisen