Detektion von Liganden-aktivierte G-Protein gekoppelten Rezeptor-Internalisierung durch konfokale Mikroskopie

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt Konfokalmikroskopie Nachweis von G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR) Internalisierung in Säugerzellen. Es umfasst die Grundzellkultur, Transfektion und Konfokalmikroskopie Verfahren und stellt ein effizientes und leicht interpretierbares Verfahren, die subzelluläre Lokalisierung und Internalisierung von Fusion exprimierten GPCR zu detektieren.

Zusammenfassung

Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) ist ein optisches Bildgebungsverfahren für die kontrastreiche Bildgebung. Es ist ein leistungsfähiger Ansatz zur Visualisierung von fluoreszierenden Fusionsproteinen, wie z. B. grün fluoreszierendem Protein (GFP), um deren Expression, Lokalisation und Funktion zu bestimmen. Die subzelluläre Lokalisierung von Zielproteinen ist wichtig für die Identifizierung, Charakterisierung und funktionelle Analyse. Die Internalisierung ist einer der vorherrschenden Mechanismen, die die Signalübertragung des G-Protein-gekoppelten Rezeptors (GPCR) steuern, um die angemessene zelluläre Reaktion auf Reize sicherzustellen. In dieser Arbeit beschreiben wir eine experimentelle Methode zum Nachweis der subzellulären Lokalisation und Internalisierung von GPCR in HEK293-Zellen mit konfokaler Mikroskopie. Darüber hinaus liefert dieses Experiment einige Details über Zellkultur und Transfektion. Dieses Protokoll ist kompatibel mit einer Vielzahl von weit verbreiteten Fluoreszenzmarkern und ist anwendbar auf die Visualisierung der subzellulären Lokalisation einer Mehrheit der Proteine sowie der Internalisierung von GPCR. Diese Technik sollte es Forschern ermöglichen, die GPCR-Genexpression in Säugetierzelllinien effizient zu manipulieren und Studien zur subzellulären Lokalisierung und Internalisierung von GPCR zu erleichtern.

Einleitung

Zellen Frachthandel Maschinen besitzen extrazelluläre Materialien-wie Liganden, Mikroorganismen, Nährstoffe zu transportieren und Transmembranproteine-in die Zelle für Information, Energie und andere Zwecke ^{1, 2.} Es ist von entscheidender Bedeutung für die zelluläre Homöostase, Gewebefunktion, und die allgemeine Überleben der Zelle. Die zellbasierte Expression von fluoreszierenden Fusionsproteinen ist eine leistungsfähige Methode die Lokalisierung und Internalisierung von Transmembran - Rezeptoren, wie G - Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) zu untersuchen, in Signalweg ^3.

Die Expression von Fusionsproteinen mit grün fluoreszierendem Protein (GFP) markiert aus Qualle Aequorea victoria, direkte Fluoreszenznachweistechniken kombiniert werden , hat breite Akzeptanz in Protein-Targeting Research ^{4, 5, 6} gewonnen. GFP-basierte DETECTIauf den Vorteil der Echtzeit - Abbildung von lebenden Zellen ermöglicht , während Fixations Artefakte vermieden ^7. Eine Reihe von vielseitigen Klonierungsvektoren wurde in verschiedenen Zellen ^{8, 9} , die Expression von Proteinfusionen auf GFP zu erleichtern konstruiert. Der pEGFP-N1-Vektor ist ein weit verbreiteter und kommerzialisierte Plasmidvektor ein verbessertes grün fluoreszierendes Protein (EGFP) kodieren, die für hellere Fluoreszenz und höhere Expression in Säugerzellen von Wildtyp-GFP optimiert wurde. Um das Fluoreszenzsignal von EGFP zu beobachten in Säugerzellen exprimiert, sollte die Fluoreszenzmikroskopie mit einer Anregung bei 488 nm und der Emission bei 507 nm, vorzugsweise mit konfokaler Mikroskopie durchgeführt werden.

Überwachung der subzellulären Lokalisation und Ligand-vermittelte Internalisierung der Rezeptoren ist eine übliche Technik , die die Signaltransduktion und Funktion von GPCRs ¹⁰ zu untersuchen , ^11. In den meisten Fällen führt zu Internalisierung Desensibilisierung der GPCRs (die Dämpfung der Reizantwort , trotz der Anwesenheit von Agonisten) ^{12, 13.} Die internalisierten Rezeptoren können in die Lysosomen aufgenommen werden und abgebaut werden, oder sie können wieder an die Zelloberfläche zurückgeführt werden, abhängig von der Art der Rezeptoren und die in den Experimenten verwendeten Zelllinien.

Die Gonadotropin-Releasing - Hormon - Rezeptoren (GnRHRs) gehören zu der GPCR - Familie und haben eine typische GPCR - Proteinstruktur, mit einer extrazellulären aminoterminalen, ein intrazelluläres -COOH - Terminal, und sieben Transmembran (TM) -Domäne ^14. Die Transfektion des rekombinanten Plasmids Sj GnRHR-EGFP (mit den GnRHR - Genen aus Sepiella japonica) und der konfokalen Mikroskopie Nachweis von EGFP-markierten Sj GnRHR (in HEK293 - Zellen exprimiert) wurden berichtet früsly und GFP - Fluoreszenz wurde ¹⁵ als Reporter für Transmembranprotein Lokalisierungs Assays etabliert. Nun wird die Internalisierung von Sj GnRHR, aktiviert durch S. japonica Gonadotropin-Releasing - Hormon (GnRH Sj) wurde in zeit- und dosisabhängigen Art und Weise durch konfokale Mikroskopie demonstriert.

Protokoll

1. Zellpräparation

1. Zellgewinnung
   1. Übertragen der kryokonservierten menschlichen embryonalen Nieren-293-Zellen (HEK293) aus einem Flüssigstickstofftank zu einem 37 ° C Wasserbad und schütteln kontinuierlich für 1 bis 2 min.
   2. 10 ml äquilibriertem Wachstumsmedium (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), das 10% fötales Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung) zu einer 10-cm Zellkulturschale. fügen Sie vorsichtig die aufgetauten Zellen auf das ins Gleichgewicht gebracht Wachstumsmedium.
   3. Inkubieren die Zellen in einem 37 ° C mit Wassermantel CO ₂ -Inkubator mit einer befeuchteten Atmosphäre mit 95% Luft und 5% CO ₂ für 2 - 4 Stunden.
   4. Nach 2 bis 4 Stunden, überprüfen Sie, dass die Zellen gebunden sind. Ersetzen Sie das ins Gleichgewicht gebracht Wachstumsmedium und Kultur für eine weitere 24 bis 48 h.
      HINWEIS: Um das ins Gleichgewicht gebracht Wachstumsmedium zu ändern, ist nützlich, weil es Dimethylsulfoxid entfernt (DMSO) und schützt vor Zellschäden.
2. Zellpassage
   1. Nach 24 bis 48 h, wenn die Zellen in der Nähe von Konfluenz gewachsen sind, verwerfen, das Wachstumsmedium equilibriert und die Zellen mit 2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) waschen. Schwenken Sie die sanft Gericht.
   2. Verwerfen Sie den PBS und füge 1 ml Trypsin-EDTA (Kochsalzlösung, 0,25% Trypsin und 0,02% EDTA). Um die Zellen vollständig zu verdauen, wirbeln die Schale vorsichtig und absaugen die Trypsin-EDTA-Lösung. Setzen Sie die Schale in dem 37 ° C mit Wassermantel CO ₂ -Inkubator für 3 min.
      HINWEIS: In dieser Zeit bereitet drei neue 10-cm-Zellkulturschalen und 10 ml Medium zu jedem ins Gleichgewicht gebracht Wachstums hinzuzufügen.
   3. Unter Verwendung eines Lichtmikroskops, festzustellen, ob die Zellen vom Boden der Schale angehoben haben. In 2 ml äquilibriert Wachstumsmedium in die Schale. Mischen durch Pipettieren und Pipettieren sofort 0,6 ml der Zellsuspension zu jeder der neuen Gerichte. Vorsichtig mischen durch Pipettieren und lassen die Zellen bei 37 ° C und 5% CO ₂ inkubieren.

2. Zell Seeding

1. Nach 24 bis 48 h, wenn die passagierten Zellen nahe Konfluenz gewachsen sind, verwerfen, das Wachstumsmedium equilibriert und die Zellen mit 2 ml PBS waschen. Schwenken Sie die sanft Gericht.
2. Verwerfen Sie den PBS und füge 1 ml Trypsin-EDTA. Um die Zellen vollständig zu verdauen, wirbeln die Schale vorsichtig und absaugen den Trypsin-EDTA. Setzen Sie die Schale in dem 37 ° C mit Wassermantel CO ₂ -Inkubator für 3 min.
   HINWEIS: In dieser Zeit bereitet eine 6-Well-Platte durch Zugabe von 2 ml äquilibriert Wachstumsmedium in jeder Vertiefung.
3. 1 ml Wachstumsmedium equilibriert in die Schale, wenn, unter mikroskopischer Beobachtung, um die Zellen von der Schale Boden abgehoben zu haben. Mischte durch Pipettieren und Pipettieren sofort 0,1 ml der Zellsuspension (das Volumen wird so eingestellt, entsprechend die Zellwachstumsdichte) zu jeder Vertiefung der hergestellten Platte mit 6 Vertiefungen (cell-less 6-Well-Platte mit 2 ml äquilibriert Wachstumsmedium). Vorsichtig mischen durch Pipettieren und lassen die Zellenbei 37 ° C und 5% CO ₂ inkubieren.

3. Zelltransfektion

1. Transfektionsverfahren 1, mit Liposomformulierungen
   HINWEIS: Bitte beachten Sie die Tabelle der Materialien für Transfektionsreagenz 1.
   1. Am folgenden Tag, stellen Sie sicher, dass die Zellen 85 sein sollte - 95% konfluent.
   2. Hinzufügen 3 ug Plasmid-DNA (500 ng / ul) und 100 ul reduzierten Serummedien in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen und vorsichtig mischen. Inkubieren Sie für 5 min bei Raumtemperatur.
   3. Bereiten 9 & mgr; l Reagenz 1 und 100 & mgr; l der reduzierten Serummedium in ein anderes Mikrozentrifugenröhrchen und vorsichtig mischen. Inkubieren Sie für 5 min bei Raumtemperatur.
   4. Kombinieren des verdünnten Gemisches mit Plasmid verdünnt Reagenz 1 (Gesamtvolumen = 215 ul). Vorsichtig mischen und Inkubation für 20 min bei Raumtemperatur.
   5. Aspirat Medium aus Zellen kultiviert Platte, und 1,5 ml frisches DMEM ohne FBS hinzuzufügen.
   6. In 215 & mgr; l DNA-transfection Reagenzmischung zu jeder Vertiefung tropft und vorsichtig mischen, indem die Platte wirbelnden.
   7. Inkubieren bei 37 ° C und 5% CO ₂ für 4 - 8 h. Ersetzen mit frischem DMEM mit 10% FBS.
   8. Inkubiere Zellen bei 37 ° C und 5% CO ₂ für weitere 24 bis 48 h , bevor irgendwelche Versuche ausgeführt wird .
2. Transfektionsverfahren 2, mit Liposomformulierungen
   HINWEIS: Bitte beachten Sie die Tabelle der Materialien für Transfektionsreagenz 2.
   1. Fügen Sie 2 ug Plasmid-DNA (500 ng / & mgr; l), 4 & mgr; l Reagenz 2 und 100 & mgr; l reduzierten Serummedium in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen. Vorsichtig mischen und Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur.
   2. Fügen Sie das Transfektionsgemisch zu den Zellen in tropfenweise.
   3. Nach der Transfektion inkubieren Zellen für 24 bis 48 h bei 37 ° C und 5% CO _2, bevor irgendwelche Versuche ausgeführt wird .

4. Zellkultur auf Deckgläser

1. Rebewegen, um das Wachstumsmedium aus der Kultur 6-Well-Platte.
2. Waschen Sie die Zellmonoschicht mit 1 ml PBS ohne Calcium und Magnesium.
3. In 0,5 ml Trypsin-EDTA. Schwenken Sie die Schale vorsichtig und absaugen Trypsin-EDTA. Inkubieren der Kulturplatte für 3 min bei 37 ° C und 5% CO _2. Die tatsächliche Inkubationszeit variiert mit der Zelllinie verwendet.
   HINWEIS: In dieser Zeit bereitet eine neue 12-Well-Platte und 15 mm Durchmesser hinzuzufügen sterile Abdeckung zu jeder Vertiefung rutscht. Deckplättchen beschichtet mit Lysin, Laminin oder Kollagen kann Zellanheftung für HEK293-Zellen verbessern, die sich leicht lösen.
4. Wenn Zellen abgelöst sind, 1 ml vorgewärmtem vollständige Wachstumsmedium in jeder Vertiefung. Mischen durch Pipettieren und sofort übertragen, um die erforderliche Anzahl von Zellen in die 12-Well-Platte mit Deckgläsern. In frisches vollständiges Wachstumsmedium zu jeder Vertiefung das Gesamtvolumen auf 1 ml einzustellen
5. Inkubieren der Zellen für 16 bis 24 h bei 37 ° C und 5% CO _2.
   HINWEIS: Nach 30 -60 min, haben die Mehrzahl der Zellen in den sterilen Deckgläschen geklebt.

5. konfokale Mikroskopie Nachweis

1. zelluläre Lokalisation
   1. Nach 16 - 24 h, wenn die Zellen in der Nähe von Konfluenz auf dem sterilen Deckgläschen in 12-Well-Platte gewachsen sind, fügen die Membransonde DiI, in jede Vertiefung, um eine Endkonzentration von 5 & mgr; M ergibt. Lassen Sie die Zellen für 30 min bei 37 ° C und 5% CO ₂ inkubieren.
   2. Nach 30 min Entfernen des Wachstumsmediums ins Gleichgewicht gebracht und die Zellen zweimal in kaltem PBS waschen (2 - 8 ° C).
   3. Fixieren Sie die Zellen durch Zugabe von 1 ml einer 4% Paraformaldehyd-Lösung (in PBS) in jede Vertiefung. Sanft für 15 min rühren.
      Achtung: Paraformaldehyd ist mäßig giftig durch Hautkontakt oder Einatmen und als wahrscheinlich krebserzeugend beim Menschen bezeichnet. Chemikalien Abzugshauben, belüftete Balance-Gehäuse oder anderen Schutzmaßnahmen werden während des Wiegens und die Handhabung von Paraformaldehyd verwendet werden.
   4. Waschen der fixierten Zellen zweimal in PBS. Hinzufügen 200-300 uL DAPI (4' , 6-Diamidino-2-phenylindol) Lösung (0,5 ug / ml) in jede Vertiefung und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur.
   5. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. Entferne vorsichtig die Deckgläser aus der Platte und der Docht aus überschüssigem PBS. Invertieren auf Mikroskop-Objektträger, beladen mit einem Tropfen Eindeckmediums (50% v / v Glycerin / Wasser). Entfernen Sie überschüssiges Eindeckmedium aus den Folien.
2. Cellular Internalisierung
   1. Nach 16 - 24 h, wenn die Zellen in der Nähe von Konfluenz auf dem sterilen Deckgläschen in 12-Well-Platte gewachsen sind, das äquilibrierte Wachstumsmedium entfernen und frische hinzufügen, erwärmt DMEM-Medium (37 ° C). Inkubieren der Zellen für 1 h bei 37 ° C und 5% CO _2.
   2. Behandeln , um die Zellen mit verschiedenen Konzentrationen (0, 10 ^-12, 10 ^-9 und 10 ^-6 M) von Liganden für 30 min und behandelt sie mit 10 ^-6 M Ligand für verschiedene Zeiten (0,10, 30 und 60 min).
   3. Wasche die Zellen zweimal in kaltem PBS (2 - 8 ° C). Fixieren Sie die Zellen durch Zugabe von 1 ml einer 4% Paraformaldehyd-Lösung (in PBS) in jede Vertiefung. Sanft für 15 min rühren.
   4. Wasche die Zellen zweimal in PBS. Entferne vorsichtig die Deckgläser aus der Platte und der Docht die überschüssige PBS ab. Invertieren auf Mikroskop-Objektträger, beladen mit einem Tropfen Eindeckmediums (50% v / v Glycerin / Wasser). Entfernen Sie überschüssiges Eindeckmedium aus den Folien.
3. Die konfokale Mikroskopie
   1. Schalten Sie die Hardware der konfokalen Mikroskop, einschließlich der Quecksilberlampenleistung, PC Mikroskop, Scanner und Laser. Login für das Betriebssystemkonto, um die Software starten, überprüfen Sie die Konfiguration und wählt Laser. Schalten Sie die verschiedenen Einheiten der konfokalen Mikroskopie-System in der Reihenfolge entsprechend den Anweisungen.
   2. Legen Sie die vorbereiteten Folien auf dem Mikroskoptisch. Platzieren Sie die Probe über die Objektivlinse unter Verwendung der Stufensteuerung. Einen Tropfen Zedernöl aufzu Deckglas, wenn die Linse Ölkapselung ausgewählt ist. Legen Sie die Deckgläser auf Objektträger der Linse gegenüber.
   3. Finden Sie die Zellen von Interesse unter der Fluoreszenzmikroskopie.
   4. Schalten Sie Modus zu scannen. Wählen Sie die Laserleistung und den spektralen Emissionsbereich des Fluorophors. Erfassen Sie die hohe Qualität konfokale Bilder von Tuning Laserintensität und andere Parameter.

Ergebnisse

Figur 1 zeigt ein Beispiel eines konfokalen Mikroskopsystems. Abbildung 2 zeigt die Expression von pEGFP-N1 in HEK293 - Zellen. Das GFP-Signal wurde im Zytoplasma und Zellkern nachgewiesen werden. Abbildung 3 zeigt die subzelluläre Lokalisation von GnRH von S. japonica in HEK293 - Zellen, im Einklang mit unseren bisher veröffentlichten Ergebnissen ^15. Das Fusionsprotein mit dem EGFP - Tag am C-Terminus vo...

Diskussion

Das Protokoll hier vorgestellten bietet eine effiziente und einfach zu interpretierende Methode, um die subzelluläre Lokalisierung und Internalisierung von exprimierten GPCR-Fusionsprotein in HEK293-Zellen zu erkennen. Die Technik kann leicht für viele verschiedene Gene und Zelltypen angepasst werden, wie für die zelluläre Lokalisation und Internalisierung des Rezeptors corazonin von Bombyx mori in HEK293 und BmN Zellen ^16.

Die erfolgreiche Anwendung dieser l...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
HEK293 Zelllinie
DMEM/Hyklon mit hohem Glukosegehalt		SH30022,01	L-Glutamin mit hohem Glukosegehalt 4,0 mM
Fötales Rinderserum (FBS)	PuFei	1101-100
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Genom	GNM10010
0,25 % Trypsin und 0,02 %	EDTA-Genom
Opti-MEM (1x)	GIBCO, von Life Technologies	31985-062	reduziertes Serummedium
Lipofectamine 2000 Transfektionsreagenz	Invitrogen	11668027	Reagenz 1
X-tremeGENE HP DNA Transfektionsreagenz	Roche	6366236001	Reagenz 2
DAPI Färbelösung	Beyotime	C1006
DiI	Beyotime	C1036
Antifade-Eindeckmedium	Beyotime	P0126
Paraformaldehyd	Sinopharm Chemisches Reagenz Co. (SCRC)	80096618
100 mm Zellkultur	CORNING	430167
6-Well-Platte	ExCell Bio	CS016-0092
12-Well-Platte	ExCell Bio	CS016-0093
Deckglas	NEST	801007
Objektträger	Citoglas	10127105P-G
Thermo Scientific Forma CO2 Inkubator	Thermo	3111
TCS SP5II konfokales Laserscanning-Mikroskop	Leica