Detektion von Liganden-aktivierte G-Protein gekoppelten Rezeptor-Internalisierung durch konfokale Mikroskopie

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt Konfokalmikroskopie Nachweis von G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR) Internalisierung in Säugerzellen. Es umfasst die Grundzellkultur, Transfektion und Konfokalmikroskopie Verfahren und stellt ein effizientes und leicht interpretierbares Verfahren, die subzelluläre Lokalisierung und Internalisierung von Fusion exprimierten GPCR zu detektieren.

Zusammenfassung

Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) ist ein optisches Bildgebungsverfahren für die kontrastreiche Bildgebung. Es ist ein leistungsfähiger Ansatz zur Visualisierung von fluoreszierenden Fusionsproteinen, wie z. B. grün fluoreszierendem Protein (GFP), um deren Expression, Lokalisation und Funktion zu bestimmen. Die subzelluläre Lokalisierung von Zielproteinen ist wichtig für die Identifizierung, Charakterisierung und funktionelle Analyse. Die Internalisierung ist einer der vorherrschenden Mechanismen, die die Signalübertragung des G-Protein-gekoppelten Rezeptors (GPCR) steuern, um die angemessene zelluläre Reaktion auf Reize sicherzustellen. In dieser Arbeit beschreiben wir eine experimentelle Methode zum Nachweis der subzellulären Lokalisation und Internalisierung von GPCR in HEK293-Zellen mit konfokaler Mikroskopie. Darüber hinaus liefert dieses Experiment einige Details über Zellkultur und Transfektion. Dieses Protokoll ist kompatibel mit einer Vielzahl von weit verbreiteten Fluoreszenzmarkern und ist anwendbar auf die Visualisierung der subzellulären Lokalisation einer Mehrheit der Proteine sowie der Internalisierung von GPCR. Diese Technik sollte es Forschern ermöglichen, die GPCR-Genexpression in Säugetierzelllinien effizient zu manipulieren und Studien zur subzellulären Lokalisierung und Internalisierung von GPCR zu erleichtern.

Einleitung

Zellen Frachthandel Maschinen besitzen extrazelluläre Materialien-wie Liganden, Mikroorganismen, Nährstoffe zu transportieren und Transmembranproteine-in die Zelle für Information, Energie und andere Zwecke ^{1, 2.} Es ist von entscheidender Bedeutung für die zelluläre Homöostase, Gewebefunktion, und die allgemeine Überleben der Zelle. Die zellbasierte Expression von fluoreszierenden Fusionsproteinen ist eine leistungsfähige Methode die Lokalisierung und Internalisierung von Transmembran - Rezeptoren, wie G - Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) zu untersuchen, in Signalweg ^3.

Protokoll

1. Zellpräparation

1. Zellgewinnung
   1. Übertragen der kryokonservierten menschlichen embryonalen Nieren-293-Zellen (HEK293) aus einem Flüssigstickstofftank zu einem 37 ° C Wasserbad und schütteln kontinuierlich für 1 bis 2 min.
   2. 10 ml äquilibriertem Wachstumsmedium (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), das 10% fötales Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung) zu einer 10-cm Zellkulturschale. fügen Sie vorsichtig die aufgetauten Zellen auf das ins Gleichgewicht gebracht Wachstumsmedium.
   3. Inkubieren die Zellen in einem 37 ° C mit Wassermantel CO ₂ -Inkubator mit einer befeuchteten Atmosp....

Ergebnisse

Figur 1 zeigt ein Beispiel eines konfokalen Mikroskopsystems. Abbildung 2 zeigt die Expression von pEGFP-N1 in HEK293 - Zellen. Das GFP-Signal wurde im Zytoplasma und Zellkern nachgewiesen werden. Abbildung 3 zeigt die subzelluläre Lokalisation von GnRH von S. japonica in HEK293 - Zellen, im Einklang mit unseren bisher veröffentlichten Ergebnissen ^15. Das Fusionsprotein mit dem EGFP - Tag am C-Terminus vo.......

Diskussion

Das Protokoll hier vorgestellten bietet eine effiziente und einfach zu interpretierende Methode, um die subzelluläre Lokalisierung und Internalisierung von exprimierten GPCR-Fusionsprotein in HEK293-Zellen zu erkennen. Die Technik kann leicht für viele verschiedene Gene und Zelltypen angepasst werden, wie für die zelluläre Lokalisation und Internalisierung des Rezeptors corazonin von Bombyx mori in HEK293 und BmN Zellen ^16.

Die erfolgreiche Anwendung dieser l.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
HEK293 Zelllinie
DMEM/Hyklon mit hohem Glukosegehalt		SH30022,01	L-Glutamin mit hohem Glukosegehalt 4,0 mM
Fötales Rinderserum (FBS)	PuFei	1101-100
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Genom	GNM10010
0,25 % Trypsin und 0,02 %	EDTA-Genom
Opti-MEM (1x)	GIBCO, von Life Technologies	31985-062	reduziertes Serummedium
Lipofectamine 2000 Transfektionsreagenz	Invitrogen	11668027	Reagenz 1
X-tremeGENE HP DNA Transfektionsreagenz	Roche	6366236001	Reagenz 2
DAPI Färbelösung	Beyotime	C1006
DiI	Beyotime	C1036
Antifade-Eindeckmedium	Beyotime	P0126
Paraformaldehyd	Sinopharm Chemisches Reagenz Co. (SCRC)	80096618
100 mm Zellkultur	CORNING	430167
6-Well-Platte	ExCell Bio	CS016-0092
12-Well-Platte	ExCell Bio	CS016-0093
Deckglas	NEST	801007
Objektträger	Citoglas	10127105P-G
Thermo Scientific Forma CO2 Inkubator	Thermo	3111
TCS SP5II konfokales Laserscanning-Mikroskop	Leica

Penicillin-Streptomycin-Genom GNM15140 GNM252005100001311