Eine einfache Methode zur Identifizierung von Kinasen, die die embryonale Stammzell-Pluripotenz durch Hochdurchsatz-Inhibitor-Screening regulieren

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein quantitatives und skalierbares Protokoll vor, um gezielte kleine Molekülbildschirme für Kinase-Regulatoren des naiv-grundierten pluripotenten Übergangs durchzuführen.

Zusammenfassung

Embryonale Stammzellen (ESCs) können sich in alle Zelltypen selbst erneuern oder differenzieren, ein Phänomen, das als Pluripotenz bekannt ist. Es wurden ausgeprägte pluripotenten Zustände beschrieben, die als "naive" und "grundierte" Pluripotenz bezeichnet werden. Die Mechanismen, die den naiv-vorbereiteten Übergang kontrollieren, sind schlecht verstanden. Insbesondere bleiben wir schlecht über Proteinkinasen informiert, die naive und grundierte pluripotenten Zustände angeben, trotz der zunehmenden Verfügbarkeit von hochwertigen Werkzeugverbindungen zur Sonden-Kinase-Funktion. Hier beschreiben wir eine skalierbare Plattform, um gezielte kleine Molekülbildschirme für Kinase-Regulatoren des naiv-grundierten pluripotenten Übergangs in Maus-ESCs durchzuführen. Dieser Ansatz nutzt einfache Zellkulturbedingungen und Standardreagenzien, Materialien und Geräte, um Kinase-Inhibitoren mit bisher nicht geschätzten Effekten auf Pluripotenz aufzudecken und zu validieren. Wir diskutieren potenzielle Anwendungen für diese Technologie, einschließlich Screening von anderen kleinen MolekülSammlungen wie zunehmend anspruchsvolle Kinase-Inhibitoren und auftauchende Bibliotheken epigenetischer Werkzeugverbindungen.

Einleitung

Embryonale Stammzellen (ESCs) haben die Fähigkeit, sich selbst zu erneuern oder in jeden Zelltyp im erwachsenen Körper zu differenzieren, ein Phänomen, das als Pluripotenz bekannt ist. Der jüngste Beweis deutet darauf hin, dass entwicklungsbedingte pluripotenten Zustände existieren, die als "naive" und "grundierte" Pluripotenz bezeichnet werden. Naive ESCs repräsentieren einen Entwicklungszustand ähnlich dem, der im Präimplantationsembryo gefunden wurde ³ . Im Gegensatz dazu sind grundierte pluripotenten ESCs bereit, Pluralipotenz zu verlassen und in spezialisierte embryonische Linien ^{4 , 5} zu differenzieren.

Naive und grundierte pluripotenten Zustände sind durch unterschiedliche Genregulationsnetze gekennzeichnet. Naive Pluripotenz ist durch die Expression von Schlüsselpluripotenz-Transkriptionsfaktoren wie Nanog, Krueppel-artigen Transkriptionsfaktoren (Klfs), Rex1 ² und Esrrb charakterisiert 6 Bei Maus-ESCs (mESCs) ist die grundierte Pluripotenz durch eine reduzierte Expression von naiven Markern und einer spezifischen Genexpressions-Signatur charakterisiert, die die de novo DNA-Methyltransferase Dnmt3b ^{7 enthält} . In vivo exprimieren die grundierten pluripotenten postimplantation epiblaststammzellen (EpiSCs) ^{4 , 5} zusätzlich den Epiblastmarker Fgf5 und Marker der Abstammungsgrundierung wie Brachyury ⁸ .

MESCs stellen ein tragbares Modell zur Verfügung, um Mechanismen zu untersuchen, die naiv-grundierte pluripotenten Übergänge in vitro kontrollieren. Bei der Kultivierung in Leukämie-Hemmfaktor (LIF) und fötalem Rinderserum (FBS) unterliegen mESCs einem dynamischen Übergang zwischen naiven und grundierten pluripotenten Zuständen ^{9 , 10} . LIF-Jak-Stat3-Signalisierungsfunktionen zur Förderung eines naiven Genregulationsnetzes ¹¹ , während die autokrine Signalisierung über den Fibroblastenwachstumsfaktor 4 (Fgf4) Erk1 / 2-Weg den Übergang zum grundierten Zustand ¹² überträgt. Allerdings bleibt es eine Herausforderung, die Rolle der Proteinkinasen bei der Festlegung unterschiedlicher pluripotenter Zustände systematisch zu bewerten.

Hier beschreiben wir eine quantitative und skalierbare Plattform, mit der gezielte kleine Molekülbildschirme für Kinase-Regulatoren des naiv-grundierten pluripotenten Übergangs durchgeführt werden können. Wir verwenden einfache mESC-Kulturbedingungen und Standardreagenzien, Materialien und Ausrüstung, um Kinase-Inhibitoren mit bisher unbekannter Fähigkeit zur Stabilisierung naiver Pluripotenz aufzudecken und zu validieren. Darüber hinaus diskutieren wir potenzielle erweiterte Anwendungen für diese Technologie, einschließlich für das Screening von anderen kleinen Molekülsammlungen wie auftauchende Inhibitorbibliotheken, die epigenetische Regulatoren ansprechen.

Protokoll

1. Sortierung von kleinen Molekül-Kinase-Inhibitor-Bibliotheken

1. Sortierung von Inhibitorbibliotheken aus öffentlich zugänglichen Kinase-Inhibitor-Sammlungen, zB Library of Integrated Network-based Cellular Signatures (LINCS) von der Harvard Medical School, eine gezielte Sammlung von 228 potenten und selektiven Kinase-Inhibitoren (http://lincs.hms.harvard.edu) , Und das Protein-Kinase-Inhibitor-Set (PKIS), eine 376 zusammengesetzte Sammlung, die von Industrieforschern zusammengestellt wurde (https://www.ebi.ac.uk/chembldb/extra/PKIS) ¹³ . Alternativ können Sie eine maßgeschneiderte Kinase-Inhibitor-Kollektion aus handelsüblichen Verbindungen zusammensetzen.
   HINWEIS: In unserem Labor haben wir eine Sammlung von 72 potenten und selektiven Werkzeugkinase-Inhibitoren zusammengestellt, die 51 primäre Zielkinasen abdecken, die alle aus kommerziellen Quellen verfügbar sind.
2. Zusammensetzen von Kinase-Inhibitoren in 96-Well-Platten für eine optimale Hochdurchsatzverarbeitung bei mehreren Konzentrationen (Einsatz 1, 0,1 aNd 0,01 mM). In jede Plattenkontakt-Vertiefungen, die nur DMSO enthalten, und Referenzkontrollinhibitoren PD173074 (FGFRi) und Ruxolitinib (JAKi), die bekanntermaßen naive und grundierte pluripotenten Zustände fördern, enthalten sind. Annotieren Sie in einer Tabellenkalkulation oder einer ähnlichen Software.

2. mESC-Kulturbedingungen und -verfahren für die Screen-Vorbereitung

1. 0,1 g-Gelatine-beschichtete 10-cm-Schalen zugeben, indem man 5 ml 0,1% (w / v) Gelatine zu 10 cm-Platten hinzufügt und bei Raumtemperatur für 5 min inkubiert. Gelatine anziehen und 2 Minuten trocknen lassen.
2. Kultur jeder Standard-MESC-Linie bei 37 ° C 5% CO ₂ auf 0,1% mit Gelatine beschichteten 10 cm-Schalen in Standard-MESC-Medien (siehe Materialtabelle ) mit 100 ng / mL GST-LIF, 10% Fetal-Kalbs Serum und 5% Knockout Serum Ersatz. Ersetzen Sie Medien jeden Tag und Durchgang mESCs bei etwa 80% Konfluenz jeden zweiten Tag bei einer Verdünnung von 1: 5-1: 10.
3. Zum Durchgang von MESCs, Absaugen von Medien und Waschen mit 5 ml OF Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) pro Platte.
4. Füge 1 ml Trypsin-EDTA (0,05% Trypsin, 0,02% EDTA) pro Platte von mESCs hinzu und inkubiere bei 37 ° C für 10 min.
5. Restenzen Sie die trypsinisierten Zellen in 4 ml mESC-Medien und zentrifugieren Sie bei 1200 U / min für 5 min.
6. Das Pellet in 5 ml MESC-Medien sorgfältig resuspendieren, nach oben und unten pipettieren, um eine einzelne Zellsuspension zu erzeugen.
7. Zählzellen durch Kombinieren einer 10 & mgr; l Zellsuspension und 10 & mgr; l Trypan Blue (0,4%). In eine Zellzählkammer stellen oder ein Hämocytometer und Lichtmikroskop verwenden.
8. Samen 3 x 10 ³ mESCs in 0,1% gelatinebeschichtete 96-Well-Platten, Endvolumen 100 μl Medium, unter Verwendung einer Mehrkanalpipette.
9. Die Kinase-Inhibitoren bei 1: 100 Verdünnung (1 & mgr; l Inhibitor zu 100 & mgr; l Medium) unter Verwendung einer Mehrkanalpipette auftragen. Sanftes Pipettieren von Medikamenten, um Inhibitor und Zellsuspension zu mischen, dann lassen sich die Zellen in einer Gewebekulturhaube für 1 h absetzen, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleistenSs die Überzugsfläche. Kulturzellen für 48 Stunden ohne Medienwechsel.
   HINWEIS: Stammplatten von 1 / 0,1 / 0,01 mM ergeben eine endgültige Inhibitorkonzentration von 10/1 / 0,1 μM. Empfiehlt es sich, den Bildschirm bei einer Endkonzentration von 1 μM zu starten, um eine wirksame Hemmung der primären Zielkinasen zu gewährleisten und gleichzeitig die Off-Target-Effekte zu minimieren.

3. Kinase Inhibitor Screening Analyse

1. Waschen Sie 96 gut mESC Platten in 200 μL PBS mit Mehrkanal-Aspirator und Pipetten.
2. Zellextrakte in 150 μl Lysepuffer (20 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40 (v / v), 0,5% Natriumdeoxycholat (w / v), 10 mM β-Glycerophosphat , 10 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM NaF, 2 mM Na ₃ VO ₄ , komplette Protease-Inhibitor-Cocktail-Tabletten).
3. Klären Sie die Extrakte durch Zentrifugation bei 1.500 xg für 30 min in V-Boden-96-Well-Platten.
4. 100 μl Überstände auf ein Nitrocel immobilisierenLymphmembran unter Verwendung eines 96-Well-Vakuum-Punkt-Blot-Verteilers.
5. Trocknen Sie die Membran und Fleck mit 40 ml Ponceau S, um eine gleichmäßige Übertragung zu gewährleisten.
6. Waschmembran mit TBST und Block in TBST / 3% (w / v) Milch.
7. Inkubieren in Nanog- und Dnmt3b-Antikörpern bei einer Verdünnung von 1: 1000 (v / v) in TBST / 3% (w / v) Milchpulver über Nacht.
8. Waschmembranen in 3 x 10 min in TBST waschen und in 30 ml Sekundärantikörper bei einer Verdünnung von 1: 10.000 (v / v) in TBST / 3% (w / v) Milch inkubieren.
9. Entwickeln Sie mit einem digitalen Immunoblotting-Imaging-System.
   HINWEIS: Wenn möglich, verwenden Sie quantitative Fluoreszenz-Immunoblotting, um Nanog und Dnmt3b zu erkennen. Allerdings ist das Hintergrundsignal für Dnmt3b durch Fluoreszenz-Immunoblotting zu hoch. Daher werden 800 nm Fluoreszenz-Anti-Kaninchen (Nanog) und Anti-Maus-HRP (Dnmt3b) sekundäre Antikörper verwendet.

4. Analyse der Screen-Daten und Validierung von Inhibitoren als Bona Fide Pluripotency Regulatoren

HINWEIS: Dies ist ein kritischer Schritt, um sicherzustellen, dass nur bona fide Pluripotenzmodulatoren identifiziert werden. Es ist entscheidend für Triage-Inhibitoren, die sowohl auf Nanog: Dnmt3b-Verhältnis als auch auf Gesamtsignal basieren, um sicherzustellen, dass Kinase-Inhibitoren, die das MESC-Überleben negativ beeinflussen, nicht für eine weitere Analyse ausgewählt werden.

1. Quantifizieren Sie Nanog- und Dnmt3b-Signal mit Hilfe von Immunoblotting-Analyse-Software und importieren Sie Werte in eine Tabellenkalkulation oder ähnliche Software. Berechnen Sie das Nanog: Dnmt3b-Verhältnis für alle Proben im Vergleich zur DMSO-Kontrolle. Außerdem bestimmen Sie das gesamte Nanog- und das Dnmt3b-Signal, um sicherzustellen, dass Kinase-Inhibitoren das Nanog: Dnmt3b-Verhältnis nicht beeinflussen, indem sie die Lebensdauer von mESC verändern.
2. Verwenden Sie Ranglisten-Nanog: Dnmt3b-Verhältnisse, um Inhibitoren zu identifizieren, die naive Pluripotenz fördern (Nanog: Dnmt3b-Verhältnis höher als Kontrolle) und grundierte Pluripotenz (Nanog: Dnmt3b-Verhältnis niedriger als Kontrolle). Setzen Sie den Cut-off bei 2x Abweichung von den Steuerwerten und filtern Sie Kinase-Inhibitoren aus, die ein Gesamt-Nanog + Dnmt3b-Signal erzeugen50% des DMSO-Kontrollwertes, um eine hohe Vertrauensliste von Kinase-Inhibitoren zu erzeugen, die das naive (hohe Nanog: Dnmt3b-Verhältnis) und das geplante (niedrige Nanog: Dnmt3b-Verhältnis) pluripotenten Zustände stabilisieren.
3. Validieren von Kinase-Inhibitoren durch Samen von mESCs bei 2 x 10 ⁵ Zellen pro 6-Well in 2-ml-Medien und Zugabe von Kinase-Inhibitoren bei 1 μM für 48 h, ohne Medienwechsel.
4. Lyse mESCs in Lysepuffer und analysieren Nanog- und Dnmt3b-Expression durch konventionelles SDS-PAGE-Immunoblotting.
5. Weiterhin validieren Sie Treffer durch SDS-PAGE-Immunoblotting für naive Pluripotenzmarker Klf2 und Klf4 und Oct4, um sicherzustellen, dass die Pluripotenz nach 48 h Inhibitorbehandlung aufrechterhalten wird.

Ergebnisse

Mit dem hier vorgestellten Verfahren (Abbildung 1 ) werden die LINCS-Bibliothek von 228 potenten und selektiven Kinase-Inhibitoren zur Identifizierung von MESC-Pluripotenzen untersucht. Die Bibliothek wird in einer Konzentration von 0,1 mM für eine 1: 100-Verdünnung und endgültige Siebkonzentration von 1 & mgr; M in mESCs hergestellt. 48 h später wurden MESCs lysiert und Extrakte wurden für die quantitative Dot-Blot-Analyse der Nanog- und Dnmt3b-Expression vorbereitet (Abbildung 2 , oben). Ergebnisse aus anderen Screening-Konzentrationen sind hier nicht zur Kürze dargestellt. Nanog: Dnmt3b-Verhältnis wird für jeden Kinase-Inhibitor bestimmt und die Verbindungen werden eingestuft und ein 2x-Cut-off angewendet (Abbildung 2 , unten). Das Gesamt-Nanog- und Dnmt3b-Signal relativ zur Kontrolle wird auf die Inhibitor-Rangliste überlagert und einem 0,5-fachen Cut-off unterworfen, um ein Triaging von Inhibitoren zu ermöglichen, die eine signifikante MESC-Toxizität aufweisen. Wählen Sie Kinase-Inhibitoren, die die naive sta stabilisierenTe werden mit konventioneller Nanog / Dnmt3b-Immunoblotting validiert (Abbildung 3 ). Die primären Kinase-Targets dieser Inhibitoren sind in Tabelle 1 dargestellt. Wir zeigen auch die Anwendbarkeit dieses Bildschirms, um Inhibitoren zu identifizieren, die den grundierten Zustand stabilisieren ¹⁴ .

Abbildung 1: Workflow zum Screening von Kinase-Inhibitoren, die den naiv-primierten Übergang modulieren MESC wurden mit einer 228-Verbindungs-Kinase-Inhibitor-Bibliothek in einer Endkonzentration von 1 & mgr; M behandelt. Lysate wurden hergestellt und auf Nitrozellulosemembranen zur Immuno-Dot-Blot-Analyse transferiert und Nanog- und Dnmt3b-Spiegel bestimmt (Abbildung von Williams et al., ¹⁴ ). Bitte klicken Sie hier um al Arger Version dieser Figur.

Abbildung 2: Naive-grundierte Pluripotenz-Screen-Analyse und Inhibitor-Identifizierung. (Top) Repräsentative Nanog- und Dnmt3b-Immuno-Dot-Blot-Bilder. (Bottom) Nanog- und Dnmt3b-Werte für jeden Kinase-Inhibitor wurden relativ zu der DMSO-Kontrolle bestimmt, und Nanog: Dnmt3b-Verhältnisse und insgesamt relatives Nanog + Dnmt3b-Signal bestimmt und Inhibitoren im Vergleich zur DMSO-Kontrolle eingestuft. Inhibitoren gefunden, um Nanog zu ändern: Dnmt3b-Verhältnis über eine 2-fache Schwelle oberhalb oder unterhalb der DMSO-Kontrolle wurden als Treiber der naiven oder grundierten Pluripotenz identifiziert. Eine Schwelle von 2x unterhalb der DMSO-Kontrolle wurde auf Triage-Inhibitoren eingestellt, die das Überleben von MESC beeinträchtigen. Für die weitere Validierung ausgewählte Inhibitoren werden hervorgehoben. (Abbildung von Williams et al., ¹⁴ ).S / ftp_upload / 55515 / 55515fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3: Validierung ausgewählter Trefferverbindungen identifiziert MESCs wurden entweder mit 1 & mgr; M AZD4547 (einem selektiven FGFR-Inhibitor) oder den angegebenen Inhibitoren, die aus dem Screen in Fig. 2 identifiziert wurden, behandelt. Nanog: Dnmt3b-Spiegel, bestimmt durch Standard-SDS-PAGE und Immunoblot-Analyse. Numerische Werte von relativen Nanog: Dnmt3b und Nanog + Dnmt3b sind in der nachstehenden Tabelle angegeben und Inhibitoren, die den naiven pluripotenten Zustand, der grün hervorgehoben ist, stabilisieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Verbindung	Primäre Ziele		Andere Ziele
AV-951	VEGFR
HG-6-64-01	ABL, BRAF, RET, CSF1R, EGFR, EPHA8, FGFR, FLT3, KIT, LOK, MAP4K1, p38b, MUSK, PDGFR, TAOK3, TNNI3K
WH-4-023	Lck		Src
R406	Syk
GW-572016	HER2		EGFR
KIN001-244	PDK1
WZ-4-145	CSF1R, DDR1, EGFR, TIE1, PDGFR2
WZ-7043	CSF1R, DDR1, FGFR und TAO1
GW786034	VEGFR1		VEGFR2, VEGFR3 &# 160;
AZD-1480	JAK2

Tabelle 1: Ausgewählte Hit-Verbindungen und ihre primäre Kinase-Ziel (e).

Diskussion

Hier zeigen wir eine weit verbreitete Methodik, um die Rolle der Kinase-Signalwege bei der Regulierung des naiv-basierten pluripotenten Übergangs zu untersuchen. Hierbei handelt es sich um eine zentrale Frage im ESC-Bereich. Obwohl Hochdurchsatz-Genomik- und Transkriptomikansätze routinemäßig zur Identifizierung von Schlüssel-Transkriptionsregulatoren naiver und grundierter pluripotenter Zustände verwendet werden, hat sich die Aufklärung von Pluripotenz-Signalisierungsnetzwerken als herausfordernd erwiesen. Wir stellen nun eine flexible Strategie zur Verfügung, die chemische Inhibitoren einsetzt, um Kinasen zu identifizieren, die den naiv-basierten pluripotenten Übergang in mESCs kontrollieren. Dies beruht auf einfachen Geräten, Reagenzien und Materialien, die für die meisten Laboratorien zur Verfügung stehen, die Zellsignalisierung und ESC-Biologie untersuchen. Kritisch für den Erfolg dieser Plattform ist unsere Entwicklung eines robusten Assays, um den Übergang zwischen naiven und grundierten pluripotenten Zuständen zu quantifizieren. Die Etablierung dieses Assays erforderte signifikante iterative Modifikationen an ZellplattDichte, Zeit der Inhibitor-Inkubation und Immunoblotting-Bedingungen.

Kleine Molekülansätze gewinnen Traktion für rationellen Einsatz in therapeutischen ESC-Anwendungen ^{15 , 16} . Eine wesentliche Stärke des kleinen Molekülscreens ist, dass Werkzeugverbindungen für eine effiziente zelluläre Aufnahme entworfen und / oder modifiziert werden. Die Transfektionseffizienz ist nicht beschränkend, und die Verwendung von gefährlichen Abgabesystemen wie Lentivirus ist nicht erforderlich. Darüber hinaus hemmen Inhibitoren häufig mehrere Isoformen innerhalb einer Kinase-Familie ( z. B. Fgfr1-4, Jak1-3), die eine funktionelle Redundanz überwindet, die genetische / genomische Interferenztechniken wie RNAi und CRISPR / Cas9 behindert. Da stärkere und selektive Werkzeugverbindungen sowohl aus akademischen als auch pharmazeutischen Wirkstoffforschungsprogrammen zur Verfügung stehen, werden unterschätzte und schlecht verstandene Kinasen an die Spitze der ESC-Forschung gelegt. Wir schlagen daher vor, dass diese hoch-thRoughput Screening-Ansatz eröffnet neue Wege der Forschung in Kern-ESC Regulierungsnetzwerke.

Eine geringfügige Einschränkung dieser Technologie ist, dass selbst die stärksten und selektivsten Molekülinhibitoren in vivo mehrere nicht verwandte Kinasen einspritzen und hemmen. Jedoch erlauben zunehmend umfassende Kinase-Inhibitor-Profiling-Daten, dass funktionelle Ziele von Kinase-Inhibitoren leicht identifiziert werden können (http://lincs.hms.harvard.edu/kinomescan; http://www.kinase-screen.mrc.ac.uk/kinase -Inhibitoren). Schließlich kann grundsätzlich unsere Plattform angewendet werden, um jeden kleinen Molekülsammel- und / oder zellulären Assay abzufragen, für den qualitativ hochwertige Immunoblotting-Antikörper verfügbar sind. Dies ermöglicht die Untersuchung mehrerer regulatorischer Systeme in der Pluripotenzregulation und erleichtert die Identifizierung von kleinen Molekülinhibitoren, die verschiedene zelluläre Prozesse modifizieren. Speziell sehen wir die Anwendung von aufkommenden kleinen Molekülsammlungen wie dem EpigenTic-Sonden, die vom Structural Genomics Consortium (http://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics) entwickelt wurden, haben das Potenzial, weitere neuartige Regulatoren von pluripotenten Übergängen aufzudecken.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
mESC media
CCE mESCs	ATCC	ATCC  SCRC-1023
DMEM Media	Gibco	11965092
L-Glutamin	Gibco	25030081	Finale: 2 mM
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140122	Finale: 50 U/ml
2-Mercaptoethanol	Sigma	M6250	Finale: 0,1 mM
Leukämie-Hemmfaktor (GST-Fusion)	MRC-PPU Reagenzien und Dienstleistungen		Final: 100 ng/ml
Leukämie-Hemmfaktor	Thermo	PMC9484	Final: 100 ng/ml
nicht-essentielle Aminosäuren	Gibco	11140050	Finale: 0,1 mM
Natriumpyruvat	Gibco	11360070	Finale: 1 mM
KnockOut-Serumersatz	Invitrogen	10828-028	Final: 5%
definiertes fötales Rinderserum	Fisher	10703464	Finale: 10%
Name	<>Company	Katalognummer	Kommentare
TC-Materialien
Trypsin-EDTA (0,05%), phenolrot	Thermo	25300054
Gelatine aus Schweinehaut	Sigma	1890
Nunc MicroWell 96-Well Microplatten	Thermo	156545
DPBS, kein Calcium, kein Magnesium	Gibco	14190136
V-Boden 96 Well Platten	Greiner Bio-one	651261
Name	Company<	strong>Katalognummer	Kommentare
>LysepufferTris-Puffer
	VWR	103157P
Natriumchlorid	VWR	97061
EDTA	Sigma	E4884
1% NP-40	Sigma	9016-45-9
Natrium Desoxycholat	Sigma	D6750-100g
β-Glycerophosphat	Sigma	G9422
Natriumpyrophosphat	Sigma	13472-36-1
Natriumfluorid	Sigma	450022
Natriumorthovanadat	Sigma	450243
Roche Complete Protease Inhibitor Cocktail Tabletten	Sigma	CO-RO
strong>Name	Unternehmen	Katalognummer	<>Kommentare
Chemicals
Tween	Sigma	P1379-1L
Milchpulver	Marvel
Name	Unternehmen	<>Katalognummer	Kommentare
Western Blotting
Protran BA 85 Nitrocellulose 0,45 &m³; M  Porengröße (20 cm x 20 cm Bogen) (25 Blatt)	GE	10401191
Ponceau S	Sigma	P7170-1L
Name	Firma	Katalognummer	Kommentare
>Laborgeräte
Minifold I System	GE	10447850
ChemiDoc Imager	BioRad	1708280
LiCor Odyssey Imager	LiCor
Name	Company	Katalognummer	>
Antikörper
Anti-Maus	Nanog Reprocell	RCAB001P
Anti-Dnmt3b	Imgenex	IMG-184A
IRDye 800CW Esel Anti-Kaninchen	Licor	926-32213
Anti-Maus-HRP	Zellsignaltechnologie	7076S
Anti-Klf2	Millipore	09-820
Anti-Klf4	R& D Systems	AF3158
Anti-Oct4	Santa Cruz	SC-5279