Protokolle für die Visualisierung Steroidogenic Organe und deren Interactive Organe mit Immunostaining in der Fruchtfliege Drosophila melanogaster

Summary

Wir beschreiben ein Protokoll für die Präparation, Fixierung und Immunfärbung von steroidogenen Organen in Drosophila - Larven und erwachsenen Frauen Steroidhormon - Biosynthese und ihren Regulationsmechanismus zu studieren. Neben steroidogenen Organe visualisieren wir die Innervation steroidogenen Organe sowie steroidogenen Zielzellen wie Keimbahn-Stammzellen.

Abstract

In mehrzelligen Organismen wird eine kleine Gruppe von Zellen mit einer spezialisierten Funktion in ihrer biogenen Aktivität ausgestattet ist, um eine systemische Reaktion auf Wachstum und Vermehrung zu induzieren. Bei den Insekten, die Larven Prothoraxdrüse (PG) und die erwachsenen weiblichen Ovar wesentliche Rollen spielen in die Biosynthese der Hauptsteroidhormone genannt ecdysteroids. Diese ecdysteroidogenic Organe werden aus dem Nervensystem innerviert, durch welche der Zeitpunkt der Biosynthese durch Umweltreize beeinflusst wird. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Visualisierung ecdysteroidogenic Organe und deren interaktive Organe in Larven und Erwachsene der Fruchtfliege Drosophila melanogaster, die für das Studium Steroidhormon - Biosynthese und ihrer Regulationsmechanismus ein geeignetes Modellsystem zur Verfügung stellt. Geschickte Dissektion ermöglicht es uns, die Positionen der ecdysteroidogenic Organe und deren interaktive Organe einschließlich des Gehirns, der Bauchmark und andere Gewebe zu halten. Immunostaining mit einemntibodies gegen ecdysteroidogenic Enzyme, zusammen mit transgenen Fluoreszenzproteine ​​durch gewebespezifische Promotoren angetrieben wird, stehen zur Verfügung ecdysteroidogenic Zellen zu markieren. Darüber hinaus kann die Innervation der ecdysteroidogenic Organe auch durch spezifische Antikörper oder eine Sammlung von GAL4-Treiber in verschiedenen Arten von Neuronen markiert werden. Daher können die ecdysteroidogenic Organe und die neuronale Verbindungen gleichzeitig durch Immunfärbung und transgene Techniken sichtbar gemacht werden. Schließlich beschreiben wir, wie Keimbahn-Stammzellen zu visualisieren, Proliferation und Wartung dessen werden durch ecdysteroids gesteuert. Dieses Verfahren trägt zum umfassenden Verständnis von Steroidhormon-Biosynthese und ihrem neuronalen Regulationsmechanismus.

Introduction

In mehrzelligen Organismen wird eine Gruppe von Zellen mit einer spezialisierten Funktion in ihrer biogenen Aktivität ausgestattet ist, die für den ganzen Körper wesentlich ist. Um ihre Aufgaben zu erfüllen, jedes Gewebe oder Organ zum Ausdruck bringt eine Reihe von Genen, die Funktionen im Zusammenhang und kommuniziert mit anderen Geweben, ihre Aktivitäten im Zusammenhang mit der Entwicklung orchestrieren. Um solche spezialisierten Zellfunktionen und Interorgan Wechselwirkungen zu charakterisieren, müssen wir zusammen mit anderen Arten von Zellen, die eine Gruppe von Zellen angeben, wobei in der vielzelligen Architektur intakt gehalten.

....

Protocol

HINWEIS: Die allgemeine Systematik der Protokolle ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Die Dissektion der Larval Ring Gland (RG)

HINWEIS: In D. melanogaster, die cyclorrhaphous Diptera gehört, wird die PG in einem zusammengesetztes endokrinen Organe der Ring Drüse (RG, 2D) genannt. Da es nicht durchführbar ist, dass die PG chirurgisch aus anderen Arten von Zellen (später diskutiert) getrennt ist, ist ein praktisches Ziel eine intakte, unbeschädigte RG durch Dissektion zu isolieren.

1. Herstellung von Larven an den entsp....

Results

Wir haben die oben genannten Protokolle zu steroidogenen Organe und deren interaktive Organe in D. melanogaster Larven und erwachsenen Frauen sichtbar zu machen. Das Gesamtschema der Protokolle ist in Abbildung 1 dargestellt.

Die RG, einschließlich des PG (Figur 2D), ist kleiner und transparenter als das Gehirn und wird an der anterior-dorsalen Seite des Gehirns (2A-C und 3A-E) angeordnet sind . Um die PG - Zellen haben mehrere Gruppen erzeugen verschiedene.......

Discussion

Wir studierten ecdysteroid Biosynthese und ihren Regulationsmechanismus in D. melanogaster, und ein Protokoll für die Präparation und Immunfärbung entwickelt. Der Zeitpunkt der Ecdysteroid - Biosynthese wird durch Umweltreize durch neuronale Eingänge ^33, beeinflußt , so ist es wesentlich , die Innervation der ecdysteroidogenic Organe zusammen mit dem Gehirn, VNC und anderen Geweben während der Präparation zu erhalten.

Wie oben beschrieben, bildet die D. m.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Eizellentnahme
Gewebekulturschale (55 mm)	AS ONE	1-8549-02	für Traubensaft-Agar-Platten
Auffangbecher	HIKARI KAGAKU
Hefepaste	Orientalische Trockenhefe, Tokyo
100% Traubensaft	Welch Food Inc.
aufziehende Larven
kleine Fläschchen (12ml, 40-fach; 23,5 mm, PS)	SARSTEDT	58.487
Einwegschlaufe	AS ONE	6-488-01
Standard Fliegenfutter			die recepi uns auf der Website des Blooington Stock Centers.
dissektion
Präpariermikroskop	Carl Zeiss	Stemi 2000-C
Präpariermikroskop	Leica	S8 AP0
Gewebekulturschale (35 x 10 mm, unbehandelt)	IWAKI	1000-035
Sylgard	TORAY		Coarting Silikon in Schalen
Terumo Nadel (27G, 0,40 x 19 mm)	TERUMO	NN-2719S	Ein "Messer" zum Schneiden der
Gewebezange, Inox, #5	Dumont, Schweiz
Insektenstift (0,18 mm Durchmesser)	Shiga Marke		für Filatdissektion
Mikroschere	NATSUME SEISAKUSHO CO LTD.	MB-50-10
fixierend
Reinstwasser	Merck Millipore
phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)
Formaldehyd	Nacalai tesque	16222-65
Paraformaldehyd	Nacalai tesque	02890-45
Triton-X100	Nacalai tesque	35501-15
Mikroröhrchen (1,5 ml)	INA OPTIKA	CF-0150
Inkubation
As one swist mixer TM-300 (Rocker)	As one	TM-300	Rocker
Bovine Serum Albumin	SIGMA	9048-46-8
primary antibody
anti-Sro (Meerschweinchen), 1:1000
anti-GFP (Kaninchen), 1:1000	Molecular Probes	A6455	Shimada-Niwa und Niwa, 2014
anti-GFP (Maus mAb, GF200), 1:100	Nakarai tesque	04363-66
anti-5HT (Kaninchen), 1:500	SIGMA	S5545
anti-HTS 1B1 (Maus)	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	1B1
Anti-DE-Cadherin (Ratte), 1:20	DSHB	DCAD2
Anti-nc82 (Maus), 1:50	DSHB	nc82
Sekundärantikörper
Goat Anti-Kaninchen-IgG (H+L) Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488 Konjugat	Life Technologies	A-11008
Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L)-Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488-Konjugat	Life Technologies	A-11001
Ziegen-Anti-Ratten-IgG (H+L) Sekundär-Antikörper, Alexa Fluor 546-Konjugat	Life Technologies	A-11081
Ziegen-Anti-Meerschweinchen-IgG (H+L) Sekundär-Antikörper, Alexa Fluor 555-Konjugat	Life Technologies	A-21435
Alexa Fluor 546 Farbstoff-konjugiertes Phalloidin	Life Technologien	A-22283
Einbettreagenzien
Mikro-Objektträgerglas	Matsunami Glass Ind., Ltd.	SS7213
Quadratisches Mikroskop-Deckglas	Matsunami Glass Ind., Ltd.
FluorSave Reagenz (Eindeckreagenz)	Calbiochem	345789
Transferpipette 1 ml (Einwegpipette)	WATSON	5660-222-1S
imaging
	Carl Zeiss		invertierter Axio Observer. Z1 SP left
image processing
LSM700 ZEN	Carl Zeiss		Es handelt sich um eine spezielle Benutzeroberfläche, die auf dem 64-Bit-Betriebssystem Microsoft Windows7 basiert
ImageJ
Fly stocks
w; GMR45C06-GAL4			aus dem Bloomington Drosophila Stock Center. Elektronikartikel (#46260)
UAS– GFP; UAS– mCD8::GFP			Geschenke von K. Ito, Universität Tokio.
w[1118]
w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP
w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4			siehe in Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010)
w; UAS-mCD8::GFP			aus dem Bloomington Drosophila Stock Center. Elektronikartikel (#32188)
yw;; nSyb-GAL4			aus dem Bloomington Drosophila Stock Center. Elektronikartikel (#51941)