Methodenartikel

Protokolle für die Visualisierung Steroidogenic Organe und deren Interactive Organe mit Immunostaining in der Fruchtfliege Drosophila melanogaster

DOI:

10.3791/55519

⸱

14. April 2017

 ,  ,  , 
1Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, 2Life Science Center of Tsukuba Advanced Research Alliance, University of Tsukuba, 3Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir beschreiben ein Protokoll für die Präparation, Fixierung und Immunfärbung von steroidogenen Organen in Drosophila - Larven und erwachsenen Frauen Steroidhormon - Biosynthese und ihren Regulationsmechanismus zu studieren. Neben steroidogenen Organe visualisieren wir die Innervation steroidogenen Organe sowie steroidogenen Zielzellen wie Keimbahn-Stammzellen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In mehrzelligen Organismen wird eine kleine Gruppe von Zellen mit einer spezialisierten Funktion in ihrer biogenen Aktivität ausgestattet ist, um eine systemische Reaktion auf Wachstum und Vermehrung zu induzieren. Bei den Insekten, die Larven Prothoraxdrüse (PG) und die erwachsenen weiblichen Ovar wesentliche Rollen spielen in die Biosynthese der Hauptsteroidhormone genannt ecdysteroids. Diese ecdysteroidogenic Organe werden aus dem Nervensystem innerviert, durch welche der Zeitpunkt der Biosynthese durch Umweltreize beeinflusst wird. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Visualisierung ecdysteroidogenic Organe und deren interaktive Organe in Larven und Erwachsene der Fruchtfliege Drosophila melanogaster, die für das Studium Steroidhormon - Biosynthese und ihrer Regulationsmechanismus ein geeignetes Modellsystem zur Verfügung stellt. Geschickte Dissektion ermöglicht es uns, die Positionen der ecdysteroidogenic Organe und deren interaktive Organe einschließlich des Gehirns, der Bauchmark und andere Gewebe zu halten. Immunostaining mit einemntibodies gegen ecdysteroidogenic Enzyme, zusammen mit transgenen Fluoreszenzproteine ​​durch gewebespezifische Promotoren angetrieben wird, stehen zur Verfügung ecdysteroidogenic Zellen zu markieren. Darüber hinaus kann die Innervation der ecdysteroidogenic Organe auch durch spezifische Antikörper oder eine Sammlung von GAL4-Treiber in verschiedenen Arten von Neuronen markiert werden. Daher können die ecdysteroidogenic Organe und die neuronale Verbindungen gleichzeitig durch Immunfärbung und transgene Techniken sichtbar gemacht werden. Schließlich beschreiben wir, wie Keimbahn-Stammzellen zu visualisieren, Proliferation und Wartung dessen werden durch ecdysteroids gesteuert. Dieses Verfahren trägt zum umfassenden Verständnis von Steroidhormon-Biosynthese und ihrem neuronalen Regulationsmechanismus.

Einleitung

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In mehrzelligen Organismen wird eine Gruppe von Zellen mit einer spezialisierten Funktion in ihrer biogenen Aktivität ausgestattet ist, die für den ganzen Körper wesentlich ist. Um ihre Aufgaben zu erfüllen, jedes Gewebe oder Organ zum Ausdruck bringt eine Reihe von Genen, die Funktionen im Zusammenhang und kommuniziert mit anderen Geweben, ihre Aktivitäten im Zusammenhang mit der Entwicklung orchestrieren. Um solche spezialisierten Zellfunktionen und Interorgan Wechselwirkungen zu charakterisieren, müssen wir zusammen mit anderen Arten von Zellen, die eine Gruppe von Zellen angeben, wobei in der vielzelligen Architektur intakt gehalten.

Ein Beispiel einer solchen spezialisierten Organe ist ein steroidogenen Organ, in dem viele Biosyntheseenzyme die Umwandlungsschritte von Cholesterin zu aktiven Steroidhormone 1 vermitteln. Die meisten dieser Gene werden in Enzym steroidogenen Organen spezifisch exprimiert wird, und die Biosyntheseweg wird eng durch viele äußere Reize über humorale Eingänge und neuronalen Eingänge geregelt. Einmalsynthetisiert, sind Steroidhormone , in die Hämolymphe sezerniert und werden in vielen Geweben und Organen gezielt für die Expression einer Vielzahl von Genen 2 zu regulieren. Daher induziert die Wirkung eines Steroidhormons eine systemische Reaktion Homöostase, Wachstum und Reproduktion zu erhalten.

Um die Funktionen von Steroidhormon - Biosynthese und die pleiotrope Wirkungen von Steroidhormonen, Drosophila melanogaster zu untersuchen kann als geeignetes Modellsystem verwendet werden. Während der Larvenstadien, das Insektensteroidhormon, Ecdysteroid, wird in einem spezialisierten endokrinen Organe biosynthetisiert genannt Prothoraxdrüse (PG) 3. In der PG, katalysieren ecdysteroidogenic mehr Enzyme spezifisch die mehrere Umwandlungsschritte von Cholesterin zu Ecdyson, die an den entsprechenden Entwicklungsstadien 4 Häutung und Metamorphose steuert. Daher wird eine dynamische Änderung der Ecdysteroid Titer geregeltviele Signalwege in Reaktion auf Umweltreize. Auf der anderen Seite, im Erwachsenenstadium spielt ecdysteroid wesentliche Rolle in der Physiologie, einschließlich der Reproduktion, Schlaf, Gedächtnis, und die Lebensdauer 5, 6, 7, 8. Es ist bekannt , dass Ecdysteroid aktiv im Ovar biosynthetisiert wird, um das Fortschreiten der Oogenese regulierende 6, 7, 8, 9, 10, 11. Vor kurzem haben wir berichtet , dass die Anzahl von Keimbahn - Stammzellen (GSCs) durch Ecdysteroid und Geschlecht Peptid Signalisierung in Reaktion auf Paarungs 12 Reize beeinflußt wird.

Mächtige Werkzeuge von D. melanogaster Genetik und Zellbiologie, einschließlich gut kommentierten Genominformationen, binary GenExpressionssysteme, und transgene RNAi - Techniken haben es uns ermöglicht , Gene wesentlich für Ecdysteroid - Biosynthese in der PG und Ovar 13, 14, 15 zu identifizieren. Sobald die ecdysteroidogenic Gene identifiziert werden, kann die Transkriptionsregulation dieser Gene und die dynamischen Lokalisierungen von Genprodukten in dem Biosyntheseweg 16 untersucht werden. Zu diesem Zweck quantitative reverse Transkription-PCR-RNA in situ Hybridisierung und immunhistologische Analysen durchgeführt. Die Anwendung dieser Techniken beinhaltet eine anspruchsvolle Aufgabe; Die aufwendige Präparation des PG oder des Ovars. Insbesondere relativ kleiner die PG des Fruchtfliege ist als die von anderen Insekten (zB die Seidenraupe und die Schmeißfliege), so muss man die lebenswichtige Fähigkeit der Fruchtfliege Präparation für die Probenahme üben. Darüber hinaus erhalten beide ecdysteroidogenic Organe Innervations aus dem zentralen Nervensystem (ZNS) , 17, 18, 19, 20. So kann eine genaue anatomische Analysen sollten die ecdysteroidogenic Organe intakt zusammen mit dem ZNS und anderen Organen gehalten werden, nicht ihre neuronalen Verbindungen zu stören.

Hier bieten wir Protokolle für die Präparation und Visualisierung von steroidogenen Organe in D. melanogaster. die Dissektionstechnik Lernen ist der Schlüssel Ausgangspunkt für diese Experimente. Darüber hinaus kann man erfolgreich die steroidogenen Organe sowie deren interaktive Organe mit mehreren Antikörpern und GAL4 Treiberleitungen beschriften. Unter Ausnutzung dieser Techniken, Materialien und Genetik kann man die umfassenden Mechanismen der Steroidhormon-Biosynthese studieren.

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Protokoll

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HINWEIS: Die allgemeine Systematik der Protokolle ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Die Dissektion der Larval Ring Gland (RG)

HINWEIS: In D. melanogaster, die cyclorrhaphous Diptera gehört, wird die PG in einem zusammengesetztes endokrinen Organe der Ring Drüse (RG, 2D) genannt. Da es nicht durchführbar ist, dass die PG chirurgisch aus anderen Arten von Zellen (später diskutiert) getrennt ist, ist ein praktisches Ziel eine intakte, unbeschädigte RG durch Dissektion zu isolieren.

  1. Herstellung von Larven an den entsprechenden Entwicklungsstadien
    HINWEIS: Um die Entwicklungsstadien von D. melanogaster Larven zu synchronisieren, ist es notwendig , Eier innerhalb eines engen Zeitfensters zu sammeln und Larven zu den entsprechenden Zeiten zu sammeln.
    1. Sammeln Eier für 2 h auf einem Traubensaft Agarplatte bei 25 ° C.
    2. Sammeln Sie frisch geschlüpften 1 st Larvenstadium mit einer Pinzette und sie auf ein kleines Fläschchen püriert Standard Hefe / cornmeal fly Lebensmittel enthält.
      HINWEIS: Das Alter der Larven wird von „Stunden nach der Eiablage (hael)“, „Stunden nach dem Schlüpfen (HAH)“ oder „Stunden nach L3 Häutung (hAL3E)“ dargestellt.
    3. Zu gegebenem Zeitpunkt, sammeln die inszenierten Larven mit einer Einweg-Plastikschleife unerwünschte Verletzungen zu vermeiden. Um einen Unterschied in der Entwicklungsfortschreiten des 3. Larvenstadium, sammeln die 2. Larvenstadium bei 70 hael (48 HAH) zu minimieren und es ihnen ermöglichen, in 2 Stunden - Intervallen häuten. Dann sammeln die 3. Larvenstadium innerhalb von 2 h nach der L3 Häutung; Dieses Verfahren gibt 0-2 hAL3E Larven.
    4. Übertragen der Szene gesetzt Larven in einer Schale gefüllt mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS).
    5. Spülen Sie die Larven mit PBS Rest Nahrung aus dem Körper zu entfernen.
  2. Grobe Dissektion von Larven unter aBinokular
    1. Halten Sie den Mund Haken einer Larve mit einer Pinzette. Sever die Larvenkörper an dem vorderen ein Drittel der Körperlänge unter Verwendung von Mikro Schere.
    2. Halten Sie das abgeschnittene Ende des vorderen Larvenkörper mit einer Pinzette. Unter Verwendung der anderen Zange, drücken Sie vorsichtig die Spitze des Kopfes in Richtung der Innenseite des Körpers; Dieses Verfahren macht den Larvenkörper von innen nach außen.
      HINWEIS: Dieser Schritt kann für die Präparation von 1. Larvenstadium übersprungen werden.
    3. Wiederholen Sie die Schritte 1.2.1-1.2.2 mit zusätzlichen Larven für 5-10 min.
      HINWEIS: Die Anzahl der Larven sollte gleich oder weniger als 20 Mal für die Präparation zu speichern.
  3. Fillet Dissektion von Larven
    HINWEIS: Diese Methode, die Position von Geweben ermöglicht hält intakt zu bleiben.
    1. Lassen Larven in Wasser nur 1 Stunde. Die Larven werden wegen Erstickung immobilisiert.
    2. Legen Sie eine Seite Larve dorsal in einem Tropfen PBS auf einer Silizium-beschichteten upSchale mit ihrer dorsalen Seite nach oben.
      HINWEIS: Die dorsale Seite hat 2 Trachealtuben laufen in Längsrichtung.
    3. Unter einem Binokular, legt einen Insektenstift in die vordere Spitze der Larven mit einer Pinzette. Stretch den Larvenkörper auf die hinteren Seite und legt einen zweiten Stift in die hinteren Spitze der Larve.
      HINWEIS: Zusätzlich zu den insekten Pins, eine Nadel aus einem Wolframdraht hergestellt sein kann 21 nützlich. Eine Nadel kann als Präpariernadel in einer Pipettenspitze durch Erhitzen zur Verwendung eingebettet werden.
    4. Unter einem Binokular, macht einen kleinen Schnitt in der Nähe des Schwanzes mit Mikro-Schere. Aus dem Einschnitt, geschnitten in Längsrichtung des dorsal Kutikula entlang der dorsalen Mittellinie in Richtung des Kopfes. Seien Sie vorsichtig, nicht Gewebe unter der Oberhaut zu beschädigen.
    5. Stretch den Wandkörper Kutikula auf jeder Seite und legt 4 Stifte an jeder Ecke des Wandkörpers seziert.
    6. Entfernen eines Teils des anterioren Fettkörper mit einer Pinzette, die Gehirn-RG c zu belichtenomplex auf der Oberfläche freigelegt werden. Entfernen Sie ein Paar Speicheldrüsen, falls erforderlich.
  4. Fixierung und Färbung des Gewebes mit Immunhistochemie
    1. Setzen Sie den anterioren ein Drittel der Larvenkörper (Schritt 1.2.2) in ein 1,5 ml Mikroröhrchen gefüllt mit 500 & mgr; l der Fixierlösung (4% Paraformaldehyd in PBS). Fix weniger als 20 Proben auf einmal, sonst PBS an die festen Proben angebracht ist, kann eine ungünstige Verdünnung des Fixiermittels verursachen. Bei Kehl Dissektion einen Tropfen PBS entfernen und dann einen Tropfen Fixier-Lösung hinzufügen.
      HINWEIS: Für Fixier-Lösung, entweder 3,7% Formaldehyd oder 4% Paraformaldehyd verwendet werden kann.
    2. Inkubiere die sezierten Gewebe in der Fixier-Lösung für 30 min bei Raumtemperatur (RT), oder alternativ für 2 Stunden bei 4 ° C.
    3. Ersetzen der Fixier-Lösung mit 500 & mgr; l PBS und schnell den Proben 3-mal gespült. Waschen Sie die Proben mit 500 ul 0,3% PBT (PBS + 0,3% Octylphenolethoxylat) für 15 min auf einem Schüttler bei RT. Für fillet Dissektion, entfernen die Insektenstifte und übertragen Sie die Proben in ein 1,5 ml Mikroröhrchen.
      HINWEIS: Die für die Durchlässigkeit von Antikörpern in das Gewebe zu erhöhen, werden die Proben mit 500 ul 2,0% PBT für 1-2 h auf einem Schüttler bei RT behandelt.
    4. Ersetzen PBT mit 500 & mgr; l Blockierlösung (2% Rinderserumalbumin in PBT). Inkubieren Sie die Proben für 1,5 h auf einer Wippe bei RT.
    5. Ersetzen die Blockierungslösung mit 50 & mgr; l der primären Antikörperlösung, dh Antikörper in der Blockierungslösung verdünnt.
    6. Inkubiere die Proben über Nacht auf einem Schüttler bei 4 ° C.
    7. Ersetzen der primären Antikörperlösung mit 500 & mgr; L 0,3% PBT und schnell die Proben 5 Mal spülen. Waschen Sie die Proben 3-mal mit 500 & mgr; l 0,3% PBT für jeweils 15 Minuten auf einem Schüttler bei RT.
    8. Ersetzen 0,3% PBT mit 50 ul der sekundäre Antikörper-Lösung (Farbstoff-konjugierten Antikörper in der Blockierungslösung verdünnt). Für die Kernfärbung, 0,5 & mgr; l 4' , 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI, 0,1 mg / ml Stammlösung) wird zu 50 & mgr; l Lösung. Inkubiere die Proben auf einem Schüttler für 2 h bei RT oder bei 4 ° C über Nacht.
      HINWEIS: Bewahren Sie die Proben im Dunkeln.
    9. Ersetzen der Antikörperlösung mit 500 & mgr; L 0,3% PBT und spülen Sie 5-mal. Waschen Sie die Proben 3-mal mit 500 & mgr; l 0,3% PBT für jeweils 15 min bei RT.
  5. Fein Dissektion des Gehirns-RG - Komplexes mit dem PG und Befestigungs
    1. Verwenden, um eine Einweg-Pipette, die immunogefärbten Proben auf eine Schale mit 0,3% PBT gefüllt zu übertragen.
      HINWEIS: Um unbequeme Blasen während der Präparation zu vermeiden und Montage kann 0,3% PBT mit PBS ersetzt werden.
    2. Unter einem Binokular, hält die Kutikula oder Mundhaken mit einer Pinzette. Unter Verwendung einer 27 G-Nadel an einer 1 ml-Spritze als „Messer“, schneiden die vordere Spitze der Speiseröhre und Augenscheiben das Gehirn-RG-eye-Disc-Komplex aus Körper Kutikula zu entfernen.
    3. Sepabewertet die Speiseröhre und Darm aus dem Gehirn-RG-Augen-Disc-Komplex mit einer Pinzette. Da die Speiseröhre oberhalb des Bauchmark (VNC) durch das Gehirn gelangt, ziehen gut auf der hinteren Seite heraus.
      HINWEIS: Zum Entfernen von zusätzlichen Imaginalscheibe aus den Proben, schneiden Sie die Verbindungen zwischen dem Gehirn, Auge Scheiben und Beinscheiben mit einem Nadelmesser.
    4. Wiederholen Sie die Schritte 1.5.1-1.5.4 für andere Proben.
      ANMERKUNG: Um Gewebstrümmer vom Kleben an die Proben, überträgt jede abgeschlossene Probe in einer anderen sauberen Schüssel gefüllt mit 0,3% PBS PBT oder zu verhindern.
    5. Übertragen Sie die Proben in die Mitte eines sauberen Glasobjektträger mit einer Mikropipette.
      HINWEIS: 2. oder 3. Larvenstadium, sollte das Ende einer Mikropipettenspitze mit einer Rasierklinge abgeschnitten.
    6. Unter einem Binokular, richten einzelne Proben mit ihrer dorsalen Seite nach oben durch die Zange verwendet wird.
      HINWEIS: Die RG an der dorsalen Seite des Gehirns befindet (2A). Diese Ausrichtung erleichtert die Spezifikation der einzelnen Proben während der Bildgebung.
    7. Kippen Sie einen Objektträger aus Glas und wischen Sie so viele überschüssigen PBT wie möglich. Bringe einen Tropfen Befestigungs Reagenz auf einer Seite der Folie. Platzieren Sie den Rand eines Deckglas von der anderen Seite des Tropfens und setzt das Deckglas auf den Proben langsam mit einer Pinzette.
      Hinweis: Dieses Verfahren verhindert, dass außerhalb des Deckglases der Proben bewegen.
    8. Lagern Sie die Proben bei 4 ° C. Halten Sie die Proben im Dunkeln.

2. Die Dissektion der Ovar in Erwachsener Weibliche Person

  1. Herstellung von erwachsenen Weibchen
    1. Feed weibliche Fliegen mit Standard-Hefe / cornmeal Fliegenfutter für 3-4 Tage, um den Eierstock mästen. Pflegen bei 25 ° C.
  2. Dissektion der erwachsenen weiblichen Ovar
    1. Anesthetize Weibchen mit CO 2 -Gas fliegen und abgeschnitten ihre Köpfe.
    2. Übertragen Fliegenkörper in eine 3-cm-Schalemit PBS gefüllt.
    3. Unter einem Binokular, halten Sie den Thorax auf der Seite dorsal mit einer Pinzette. Fasst das Abdominalsegment A5 oder A6 mit den anderen Zangen und schält die abdominale Kutikula in Richtung der hinteren Seite entfernt. Wischen Sie die klebrige Kutikula von der Spitze der Zange ab.
    4. Klemmen Sie einen Eileiter und nehmen Sie den Eierstock aus dem Körper.
    5. Kamm und verbreiten die Spitzen der Ovarien mit einer Pinzette.
      HINWEIS: Dieser Vorgang verbessert die Effizienz der Immunfärbung.
  3. Dissektion der erwachsenen weiblichen Gehirn, VNC und Fortpflanzungsorgane.
    HINWEIS: Diese Methode ermöglicht die Innervation des Ovar intakt gehalten werden.
    1. Anesthetize Weibchen mit CO 2 -Gas fliegen und sich auf eine Silizium-beschichtete Schal mit PBS gefüllt.
    2. Unter einem Binokular, halten Sie die Rüssel und ziehen den Kopf Kutikula entfernt das Gehirn mit einer Pinzette zu belichten. Entfernen Sie die Luftröhre an das Gehirn gebunden.
      HINWEIS: Die brain ist eine weiße und gerundete Struktur. Das Gehirn verbindet sich mit dem VNC im Thorax.
    3. Halten Sie den Thorax auf der dorsalen Seite und geschnitten, um die Beine und Flügel mit einer Pinzette aus. Unter Verwendung der anderen Zange, schälen die ventralen Thorax Cuticula von den Basen der Beine weg. Sobald das VNC ausgesetzt ist, entfernen, die Rest dorsalen Kutikula und die VNC mit einer Pinzette befestigt Muskeln. Achten Sie darauf, nicht die Verbindung zwischen dem Gehirn und dem VNC zu beschädigen.
    4. Verwenden einer Pinzette, um die Bauch Kutikula abzulösen und setzen die Ovar und ihre interaktive Organe, einschließlich Neuronen, die Ernte, dem Darm, der Eileiter, der Gebärmutter und der Mithelfer Drüse.
    5. Entfernen Sie die Restgewebe einschließlich Luft- und Fettkörper mit einer Pinzette.
  4. Fixierung und Färbung des Gewebes mit Immunhistochemie
    1. Übertragung von ca. 8-10 Paare der Ovarien in ein 1,5 ml Mikroröhrchen gefüllt mit 250 & mgr; l der Fixierlösung (4% paraformaldehyde in PBS), und die Proben für 30 min bei RT inkubiert.
    2. Ersetzen der Fixier-Lösung mit 500 & mgr; l PBS und schnell den Proben 3-mal gespült.
    3. Waschen Sie die Proben 2 mal mit 500 & mgr; l 0,1% PBT für jeweils 5 Minuten bei RT.
    4. Ersetzen PBT mit 50 & mgr; l Blockierungslösung. Inkubiere die Proben für 1 h auf einem Schüttler bei RT.
    5. Ersetzen der Blockierungslösung mit 50 & mgr; l der primären Antikörperlösung.
    6. Inkubiere die Proben über Nacht auf einem Schüttler bei 4 ° C.
    7. Ersetzen der primären Antikörperlösung mit 500 & mgr; l 0,1% PBT. Waschen Sie die Proben 3-mal mit 500 & mgr; l 0,1% PBT für jeweils 15 Minuten auf einem Schüttler bei RT.
    8. Ersetzen 0,1% PBT mit 50 ul sekundärer Antikörperlösung. Für die Kernfärbung, mit 0,5 & mgr; l DAPI bis 50 & mgr; l der Lösung. Inkubieren Sie die Proben für 2 h auf einer Wippe bei RT.
    9. Ersetzen der sekundäre Antikörperlösung mit 500 & mgr; l 0,1% PBT. Waschen Sie die Proben 3-mal mit 500 & mgr; l 0,1% PBT für jeweils 15 Minuten auf einem Schüttler bei RT.
      HINWEIS: Der Waschvorgang kann über Nacht bei 4 ° C durchgeführt werden. Halten Sie die Proben im Dunkeln.
  5. Montage der Proben auf Glasobjektträger
    1. Übertragen Sie die Proben auf einen Glasobjektträger mit 0,1% PBT mit einer Mikropipette.
      HINWEIS: Um unbequeme Blasen während der Präparation zu vermeiden und Montage kann 0,1% PBT mit PBS ersetzt werden.
    2. Für die Ovarien, trennen die Saiten der Ovariolen voneinander mit einer Pinzette unter einem Binokular. Sie nicht die Spitzen der Ovariolen verletzen die germaria enthält. Für den Gehirn-VNC-Fortpflanzungsorgan Komplex, den Rest Kutikula entfernen und die Position auf einem Glasobjektträger anordnen.
    3. Wischen so viel überschüssiges PBT wie möglich ab und einen Tropfen Befestigungs Reagenz in der Mitte der Proben gelegt. Legen Sie ein Deckglas langsam mit einer Pinzette.
    4. Lagern Sie die Proben bei 4 ° C. Halten Sie die Proben im Dunkeln.
„> 3. Imaging mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop

  1. Beachten Sie die Proben unter dem Mikroskop und bringen die steroidogenen Organe im Blickfeld. Sobald die Ansicht festgelegt ist, schaltet das Abbildungssystem auf den Bildaufnahme-Modus.
    HINWEIS: Die 10-20x Objektivlinsen verwendet werden, um die Bilder des Gehirns-RG-Komplex oder das gesamte Ovar zu erhalten. Alternativ werden die 40-63X Objektivlinsen (Wasser oder Eintauchen in Öl) zur Sichtbarmachung der subzellulären Lokalisierung von Proteinen in GSCs oder der neuronalen Innervation des PG und die Ovarien eingesetzt.
  2. Stellen Sie die Parameter der Bildaufnahme auf der beiliegenden Software auf. Wählen Sie die Kombination aus Fluoreszenz (zB GFP und RFP). Durch die schnelle Scan-Verfahren, stellen Sie die Laserleistung, die Empfindlichkeit der Detektoren (Gain / Offset) und die Größe der Lochblende.
    HINWEIS: Zum Erwerb von Bildern mit hohen Qualität, die Scan-Laserleistung und die Empfindlichkeit des Detektors (Gain) sollten für jede Probe optimiert werden. Umreißen die Formdas Gewebes, ein übertragenes Lichtbild kann zusätzlich zu einem Fluoreszenzbild aufgenommen werden.
  3. Nehmen Z Stapel der Bilder. Während einer kontinuierlichen Schnellabtastrichtung, bewegen, um die Brennebene mit dem Fokusantrieb des Mikroskops und stellen die Ausgangsposition und die Endposition. Die Anzahl der Scheiben und der Intervallabstand zwischen den Scheiben werden entsprechend angepasst.
  4. Wählen Sie die Scan-Geschwindigkeit, die Scan-Methode und die bidirektionale Scan-Modus.
  5. „Starten Sie die wirklichen Prüfungen“ für die Bildaufnahme.
  6. Speichern Sie das Bild mit dem Format der beigefügten Software.
    HINWEIS: Die Original-Bilddateien enthalten die Informationen der Bildaufnahmeparameter und Skalen. Exportierte Bilder können 22 unter Verwendung einer Bildverarbeitungssoftware auf dem Computer verarbeitet werden.

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Ergebnisse

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Wir haben die oben genannten Protokolle zu steroidogenen Organe und deren interaktive Organe in D. melanogaster Larven und erwachsenen Frauen sichtbar zu machen. Das Gesamtschema der Protokolle ist in Abbildung 1 dargestellt.

Die RG, einschließlich des PG (Figur 2D), ist kleiner und transparenter als das Gehirn und wird an der anterior-dorsalen Seite des Gehirns (2A-C und 3A-E) angeordnet sind . Um die PG - Zellen haben mehrere Gruppen erzeugen verschiedene...

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Diskussion

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Wir studierten ecdysteroid Biosynthese und ihren Regulationsmechanismus in D. melanogaster, und ein Protokoll für die Präparation und Immunfärbung entwickelt. Der Zeitpunkt der Ecdysteroid - Biosynthese wird durch Umweltreize durch neuronale Eingänge 33, beeinflußt , so ist es wesentlich , die Innervation der ecdysteroidogenic Organe zusammen mit dem Gehirn, VNC und anderen Geweben während der Präparation zu erhalten.

Wie oben beschrieben, bildet die D. m...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Keine Interessenkonflikte erklärt.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Reiko Kise und Tomotsune Ameku für ihre technische Unterstützung für diese Arbeit. Wir sind auch dankbar, dass Kei Ito, Olga Alekseyenko, Akiko Koto, Masayuki Miura, Bloomington Drosophila Stock Center, KYOTO Stock Center (DGRC) und der Entwicklungsstudien Hybridoma Bank für Aktien und Reagenzien. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse zu YSN von JSPS KAKENHI Grantnummer 16K20945, The Naito-Stiftung und Inoue Wissenschaft Forschungspreis unterstützt; und durch einen Zuschuss zu RN von MEXT KAKENHI Grantnummer 16H04792.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Eizellentnahme
Gewebekulturschale (55 mm)AS ONE1-8549-02  für Traubensaft-Agar-Platten
AuffangbecherHIKARI KAGAKU
HefepasteOrientalische Trockenhefe, Tokyo
100% TraubensaftWelch Food Inc.
aufziehende Larven
kleine Fläschchen (12ml, 40-fach; 23,5 mm, PS)SARSTEDT58.487
EinwegschlaufeAS ONE6-488-01
Standard Fliegenfutter  die recepi uns auf der Website des Blooington Stock Centers.
dissektion
PräpariermikroskopCarl ZeissStemi 2000-C
PräpariermikroskopLeicaS8 AP0
Gewebekulturschale (35 x 10 mm, unbehandelt)IWAKI1000-035
SylgardTORAYCoarting Silikon in Schalen
Terumo Nadel (27G, 0,40 x 19 mm) TERUMONN-2719SEin "Messer" zum Schneiden der
Gewebezange, Inox, #5Dumont, Schweiz
Insektenstift (0,18 mm Durchmesser)Shiga Markefür Filatdissektion
MikroschereNATSUME SEISAKUSHO CO LTD. MB-50-10
fixierend
ReinstwasserMerck Millipore
phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)
FormaldehydNacalai tesque16222-65
ParaformaldehydNacalai tesque02890-45
Triton-X100Nacalai tesque35501-15
Mikroröhrchen (1,5 ml)INA OPTIKACF-0150
Inkubation
As one swist mixer TM-300 (Rocker)As oneTM-300Rocker
Bovine Serum AlbuminSIGMA9048-46-8
primary antibody
anti-Sro (Meerschweinchen), 1:1000
anti-GFP (Kaninchen), 1:1000Molecular ProbesA6455Shimada-Niwa und Niwa, 2014
anti-GFP (Maus mAb, GF200), 1:100Nakarai tesque04363-66
anti-5HT (Kaninchen), 1:500SIGMAS5545
anti-HTS 1B1 (Maus)Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)1B1
Anti-DE-Cadherin (Ratte), 1:20DSHBDCAD2
Anti-nc82 (Maus), 1:50DSHBnc82
Sekundärantikörper
Goat Anti-Kaninchen-IgG (H+L) Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488 KonjugatLife TechnologiesA-11008
Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L)-Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488-KonjugatLife TechnologiesA-11001
Ziegen-Anti-Ratten-IgG (H+L) Sekundär-Antikörper, Alexa Fluor 546-KonjugatLife TechnologiesA-11081
Ziegen-Anti-Meerschweinchen-IgG (H+L) Sekundär-Antikörper, Alexa Fluor 555-KonjugatLife TechnologiesA-21435
Alexa Fluor 546 Farbstoff-konjugiertes PhalloidinLife TechnologienA-22283
Einbettreagenzien
Mikro-ObjektträgerglasMatsunami Glass Ind., Ltd.SS7213
Quadratisches Mikroskop-DeckglasMatsunami Glass Ind., Ltd.
FluorSave Reagenz (Eindeckreagenz)Calbiochem345789
Transferpipette 1 ml (Einwegpipette)WATSON5660-222-1S
imaging
Carl Zeissinvertierter Axio Observer. Z1 SP left
image processing
LSM700 ZENCarl ZeissEs handelt sich um eine spezielle Benutzeroberfläche, die auf dem 64-Bit-Betriebssystem Microsoft Windows7 basiert
ImageJ
Fly stocks
w; GMR45C06-GAL4  aus dem Bloomington Drosophila Stock Center. Elektronikartikel (#46260)
UAS– GFP; UAS– mCD8::GFPGeschenke von K. Ito, Universität Tokio.
w[1118]
w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP
w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4siehe in Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010)
w; UAS-mCD8::GFP  aus dem Bloomington Drosophila Stock Center. Elektronikartikel (#32188)
yw;; nSyb-GAL4  aus dem Bloomington Drosophila Stock Center. Elektronikartikel (#51941)
C218181LSM700 Laser-Scanning-Mikroskopsystem

Referenzen

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