Assessment of Spontane Alternation, neuartige Objekterkennung und Gliedmaßenverkürzung in transgenen Mausmodellen der Amyloid-β- und Tau-Neuropathologie

Zusammenfassung

Hier beschrieben handelt es sich um einen inszenierten, Verhaltens-Screening-Ansatz, der verwendet werden kann, um Verbindungen zu sehen, die in vivo Wirksamkeit auf kognitiven und funktionellen motorischen Verhaltensweisen in transgenen Mausmodellen von β-Amyloidose und Tauopathie zeigen. Diese Methoden sind optimiert, um Verbindungen für die Aktivität in kurzfristigen und Arbeitsspeicheraufgaben zu screenen.

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir einen inszenierten, Verhaltenstestansatz, der zum Screening von Verbindungen verwendet werden kann, die in vivo Wirksamkeit auf kognitiven und funktionellen motorischen Verhaltensweisen in transgenen Mausmodellen von β-Amyloidose und Tauopathie zeigen. Das Paradigma beinhaltet Tests für spontane Wechsel in einem Y-Labyrinth, neuartige Objekterkennung und Gliedmaßenklammerung. Diese Tests wurden ausgewählt, weil sie: 1) die Funktion der kognitiven oder motorischen Domänen und der korrelierenden neuronalen Schaltkreise, die für den menschlichen Krankheitszustand relevant sind, abfragen, 2) klar definierte Endpunkte haben, 3) leicht umsetzbare Qualitätskontrollen, 4) Ein moderates Durchsatzformat und 5) erfordern wenig Intervention durch den Ermittler. Diese Methoden sind für Forscher, die auf der Suche nach Bildschirm für die Aktivität in kurzfristigen und Arbeitsspeicher Aufgaben oder funktionale motorischen Verhaltensweisen mit Alzheimer-Krankheit Maus Modelle verbunden sind. Die hier beschriebenen Methoden verwenden VerhaltenstestsAlter eine Reihe von verschiedenen Hirnregionen einschließlich Hippocampus und verschiedenen kortikalen Bereichen. Ermittler, die kognitive Tests wünschen, die spezifisch die von einer einzelnen Hirnregion vermittelte Kognition beurteilen, könnten diese Techniken verwenden, um andere Verhaltenstests zu ergänzen.

Einleitung

Alzheimer-Krankheit (AD) ist eine progressive neurodegenerative Erkrankung, die zu schwächenden kognitiven Rückgang führt, der etwa 44 Millionen Menschen weltweit betrifft. Derzeit gibt es keine verfügbaren Behandlungen für AD, die krankheitsmodifiziert sind und betonen die dringende Notwendigkeit für präklinische Entdeckung von neuartigen therapeutischen Strategien für diese Krankheit. Es wurden eine Reihe von verschiedenen transgenen Mausmodellen erstellt, die verschiedene Aspekte von AD ^{1 , 2} zusammenfassen, einschließlich Defizite in kognitiven Domänen, die bei Patienten unterbrochen wurden ³ . Diese Mausmodelle stellen ein nützliches Werkzeug dar, um ein effizientes Screening in vivo zu ermöglichen.

Bei der Beurteilung einer Verbindung zur potenziellen In-vivo- Wirksamkeit muss ein inszeniertes Vorgehen getroffen werden, dass Bildschirme für die Wirksamkeit in geeigneten kognitiven Domänen und überwacht auch Verhaltensweisen, die die spezifischen Endpunkte beeinflussen könnten, die zu einem verwendet wurdenSsess kognition Viele transgene Mausmodelle von AD zeigen Hyperaktivität und andere Verhaltensweisen, die einen bestimmten kognitiven Test beeinträchtigen können, und verbieten ihre Verwendung in der Arzneimittel-Screening ⁴ . Darüber hinaus sollten für einen Ansatz, der in einer Arzneimittel-Screening-Umgebung umgesetzt werden soll, die jeweiligen Tests mindestens einen moderaten Durchsatz aufrechterhalten, klar definierte Endpunkte aufweisen und eine Prozedur, die einen minimalen Eingriff durch die Ermittler erfordert. Mit diesen Kriterien können Verhaltensbildschirme implementiert werden, die die Reproduzierbarkeit, die niedrige Intra- und Inter-Assay-Varianz und die Effektgrößen für das Compound-Screening aufweisen. Detaillierte hier sind die Methoden, die wir eingesetzt haben, um Verbindungen aufzusetzen, die wirksam sind, um die in transgenen Mausmodellen der β-Amyloidose und Tauopathie ^{5 , 6} vorhandenen kognitiven und motorischen Phänotypen zu mildern. Die beschriebenen Methoden werden aus häufig verwendeten Verhaltens-Paradigmen, die in der lIteratur ⁷ , mit spezifischen optimierungen und qualitätskontrolle, so dass sie in transgenen mausmodellen verwendet werden können, die für AD relevant sind. Dieses Protokoll kann mit einer Vielzahl von Datenerfassungs- und Analysesystemen verwendet werden und geht davon aus, dass der Ermittler über Kenntnisse der zugehörigen Software verfügt.

Protokoll

Die in dieser Publikation aufgelisteten Methoden wurden von dem institutionellen Tierpflege- und Verwendungsausschuss (IACUC) bei Hilltop Laboratory Animals überprüft, um die ordnungsgemäße Pflege, Nutzung und humane Behandlung von Tieren in Übereinstimmung mit den geltenden Bundes-, Landes- und lokalen Gesetzen und Vorschriften zu gewährleisten Wie die föderalen Tierschutzverordnungen oder AWRs (CFR 1985) und Public Health Service Policy für Humane Care und Use of Labortiere oder PHS Policy (PHS 1996).

1. Allgemeine Richtlinien für alle Verhaltensanalyse

1. Vor jeder Tierhandhabung decken Sie vorhandene Käfigkarten mit einer neuen Käfigkarte ab, die nur die eindeutige, blinde Tierkennung anzeigt.
   HINWEIS: Ermittler, die Mäuse während der Routine-Compound / Placebo-Dosierung behandeln, sind nicht berechtigt, Mäuse für die Verhaltensanalyse zu behandeln.
2. Dimmen oder schalten Sie die Lichter aus und stellen Sie die Beleuchtung so ein, dass die Beleuchtung am Boden der Arena oder des Labyrinths 30-35 Lux beträgt.
3. FOder Studien, die mehrere Wochen überspannen, die Körpergewichte wöchentlich als indirekte Maßnahme der Gesamtgesundheit aufzeichnen.
   HINWEIS: Zusätzliche Käfig-seitige Kontrollen für Mantelqualität, Haltung, Gang und spontane Fortbewegung können aufgenommen werden, wenn robustere Gesundheitsüberprüfungen gerechtfertigt sind.

2. Habituating Mäuse zur Handhabung durch Ermittler

1. Zwei Tage vor jedem Verhaltenstest, gewöhnen die Mäuse zur Handhabung. Entfernen Sie den Käfig aus dem Käfiggestell und legen Sie ihn auf eine ebene Fläche.
2. Entfernen Sie den Deckel aus dem Käfig. Behandle die Maus genau so, wie es bei der Durchführung des bevorstehenden Verhaltenstests gehandhabt würde. Lege die Maus in eine hohle Hand über den Hauskäfig.
3. Messen Sie die Latenz, um von der Hand des Forschers zurück in den Hauskäfig zu springen. Halten Sie Mäuse für maximal 5 s.
   HINWEIS: Mäuse, die Latenzen von ≥2 s aufweisen, gelten als "gewohnt". Mäuse, die Latenzen <2 s während der ersten Studie zeigen, unterliegen 2 zusätzliche habituatioN Sitzungen an diesem Tag.
4. Lassen Sie die Mäuse 2 aufeinanderfolgende Tage der Handhabung der Gewöhnung unterziehen. Beachten Sie jede Maus, die nicht am Ende des ^2. Tages gewohnt ist.

3. Bewertung des räumlichen Arbeitsspeichers durch Messung der spontanen Wechsel in einem Y-Labyrinth ⁸

1. Vor dem ersten Gebrauch gründlich das Y-Labyrinth mit einem unscented Bleichmittel-Keimtuch, 70% EtOH, gefolgt von dH ₂ O ⁹ reinigen. Deutlich bezeichnen die Arme des Labyrinths als 'A', 'B' & 'C' oder andere vergleichbare eindeutige Identifikatoren.
2. Vor dem Beginn einer Testsitzung legen Sie das Datenerfassungssystem oder Videokameras fest und stellen die korrekte Verfolgung von Mäusen im Labyrinth ein. Kalibrieren Sie den Abstand im Labyrinth unter Verwendung von aufgenommenen Videobildern eines Lineals oder eines anderen Objekts mit bekannter Länge.
   HINWEIS: Die Verhaltensmethoden in diesem Verfahren werden mit einer Vielzahl von Datenerfassungssystemen funktionieren und die Autoren gehen davon ausNe, das dieses Verfahren durchführt, beherrscht die Verwendung ihres gewählten Datenerfassungssystems. Leistungsanalysen zeigen an, dass Probengrößen von 10-15 Mäusen pro Gruppe für ein β ≤0.2 erforderlich sind.
3. Entfernen Sie den Käfig aus dem Rack und legen Sie ihn vorsichtig auf einen Tisch in unmittelbarer Nähe des Y-Labyrinths. Entfernen Sie die Maus aus dem Hauskäfig und legen Sie sie sanft in einen Arm des Y-Labyrinths, der dem Zentrum zugewandt ist. Habe den Ermittler weit genug weg vom Labyrinth, damit die Maus den Forscher nicht sehen kann.
4. Aktiviere das Daten- / Video-Erfassungssystem sofort nach dem Einsetzen der Maus in das Labyrinth.
5. Drücken Sie die Wiedergabe und notieren Sie das spontane Verhalten für jede Maus für einen Zeitraum von 10 min. Sobald eine Sitzung abgeschlossen ist, legen Sie die Maus vorsichtig wieder in den Hauskäfig und bringen den Käfig zum Rack zurück.
6. Reinigen Sie das Labyrinth gründlich zwischen jeder Sitzung mit einem unscented Bleichmittel keimtötende Wischtuch, 70% EtOH, gefolgt von dH ₂ O. Wiederholen Sie aus Schritt 3.4, um alle Mikrofone zu beurteilenE.
7. Sobald alle Mäuse die Erforschung des Y-Labyrinths abgeschlossen haben, analysieren sie die Daten aus dem Akquisitionssystem oder manuell die Videos der Sessions. Ein Armeintrag tritt ein, wenn alle 4 Pfoten der Maus die Schwelle der zentralen Zone und in den Arm kreuzen und die Schnauze des Tieres auf das Ende des Arms ausgerichtet ist.
   HINWEIS: Endpunkte, die analysiert werden, umfassen: Gesamtstrecke, die in dem Labyrinth zurückgelegt wird, Gesamtstrecke, die innerhalb jedes Armes (einschließlich der zentralen Zone) zurückgelegt wird, Gesamtzeit in jedem Arm (einschließlich der zentralen Zone), Gesamtzahl der Armeinträge, Anzahl der Einträge, die in jeden Arm eingefügt wurden, und eine sequentielle Liste von Waffen, die eingegeben wurden, um die Anzahl der vorgenommenen Änderungen zu beurteilen.
8. Ein spontaner Wechsel tritt auf, wenn eine Maus in einen anderen Arm des Labyrinths in jedem von 3 aufeinanderfolgenden Armeinträgen eintritt. Der spontane Wechsel% wird dann mit folgender Formel berechnet.
   
   HINWEIS: Zum Beispiel iDie Reihenfolge des Armeintrags war: ABCCBABCABC, der Ermittler würde insgesamt 6 spontane Alternationen (in Reihenfolge: ABC, CBA, ABC, BCA, CAB, ABC) erzielen. Mit insgesamt 11 Arm-Einträgen wäre der spontane Wechsel% 67%.
9. Machen Sie die folgenden Qualitätskontrollen, um sicherzustellen, dass die Daten eine unvoreingenommene Beurteilung des spontanen Wechsels darstellen.
   1. Führen Sie eine Pearson-Korrelation von spontanem Wechsel% zu beides Gesamtstrecke und Anzahl der Arm-Einträge gemacht.
      HINWEIS: Wenn es eine signifikante Korrelation des spontanen Wechseles% zu jedem Parameter gibt, dann sollten die Daten aufgrund des potenziellen Einflusses der hyperdynamischen Fortbewegung auf den scheinbaren kognitiven Endpunkt ¹⁰ weiter untersucht werden.
   2. Analysieren Sie die Anzahl der Einträge, die in jedem Arm mit einem 1-Wege-ANOVA-Test gemacht wurden.
      HINWEIS: Wenn diese Analyse signifikant ist, dann würde dies auf die Anwesenheit von Cues in der Umgebung hindeuten, die Mäuse zu einem bestimmten Regi anzogEinmal des Labyrinths

4. Bewertung des Zwischenerkennungsgedächtnisses durch Messung der neuartigen Objekterkennung ^{11 , 12 , 13}

1. Für jede Phase dieses Tests gründlich reinigen Sie die offene Feld Arena mit einem unscented Bleichmittel keimtötende Wischtuch, 70% EtOH gefolgt von dH ₂ O vor der ersten Verwendung.
2. Ein Tag vor der Objektbelichtung gewohnt die Mäuse auf die offene Feldarena.
   1. Vor dem Beginn der Gewöhnung Sitzung, die Einrichtung der Datenerfassung System oder Videokameras und bestätigen ordnungsgemäße Verfolgung von Mäusen im Labyrinth. Kalibrieren Sie den Abstand in der Arena mit aufgenommenen Videobildern eines Lineals oder eines anderen Objekts von bekannter Länge. Markiere die Ecken der Arena in der Software, um das Scoring von Positionsvorspannungen zu ermöglichen.
      HINWEIS: Die Verhaltensmethoden in diesem Verfahren werden mit einer Vielzahl von Datenerfassung sy arbeitenStämme und die Autoren davon ausgehen, dass jemand, der dieses Verfahren durchführt, die Verwendung ihres gewählten Datenerfassungssystems beherrscht. Leistungsanalysen zeigen an, dass Probengrößen von 15-20 Mäusen pro Gruppe für ein β ≤0.2 erforderlich sind.
   2. Entfernen Sie den Käfig aus dem Gestell und legen Sie sich vorsichtig auf einen Tisch in unmittelbarer Nähe der Arena.
   3. Entfernen Sie die Maus aus dem Hauskäfig und legen Sie die Maus vorsichtig in die Mitte der Arena. Schalten Sie die Tracking-Software und / oder Video-Aufnahme-System sofort nach dem Platzieren der Maus in die Arena.
   4. Erlaube Mäusen, die Arena für 30 min frei zu erkunden.
      HINWEIS: Während dieser Zeit werden die Mäuse die Mäuse nicht stören.
   5. Nach der Gewöhnung stelle die Mäuse wieder in ihren Hauskäfig und reinige die Arena gründlich mit einem unscented Bleichmittel keimtötende Wischtuch, 70% EtOH gefolgt von dH ₂ O.
   6. Wiederholen Sie ab Schritt 4.2.2, bis alle Mäuse in die Arena gewohnt sind.
   7. Nachdem alle Mäuse gewohnt warenIn die Arena gegangen, das Video analysieren.
      HINWEIS: Die zu analysierenden Endpunkte beinhalten die Gesamtstrecke, die in der Arena zurückgelegt wird, und die Zeit, die in der Nähe der Ecke verbracht wird. Wenn es für das Mausmodell relevant ist, werden in diesen Analysen stereotype Verhaltensweisen ( dh myoklonisches Ecksprung, Kreisen usw. ) berücksichtigt. Mäuse, die in bestimmten Regionen der Arena Zeit verbringen, werden von weiteren Experimenten ausgeschlossen, da dies die Objekt-Exploration beeinflussen wird.
      ANMERKUNG: Die erste Phase der neuartigen Objekterkennung beinhaltet die Einarbeitung von Mäusen zu einem Objekt. Hierin wird dieser Teil des neuartigen Objekterkennungsverfahrens als die Abtastphase bezeichnet.
   8. Vor dem Beginn einer Probephase Session, legen Sie Objekte in die Arena und fixieren sie auf den Boden mit einem Montagekitt, so dass Tiere können nicht bewegen die Objekte. Richten Sie zwei identische Objekte an eine bestimmte Wand mit genügend Abstand zwischen den Wänden und Objekten, so dass die Mäuse die Objekte von allen ang frei erforschen könnenLes.
   9. Richten Sie das Datenerfassungssystem oder Videokameras ein und bestätigen Sie die korrekte Verfolgung von Mäusen und Objekten im Labyrinth. Kalibrieren Sie die Distanzen in der Arena mit aufgenommenen Videobildern eines Lineals oder eines anderen Objekts von bekannter Länge.
   10. Markiere die Ecken der Arena in der Software, um das Scoring von Positionsvorspannungen zu ermöglichen. Markieren Sie Objekte in Software und verfolgen Sie ihr Explorationsverhalten separat für jedes Objekt ( dh "Objekt A" und "Objekt B").
   11. Entfernen Sie den Käfig aus dem Gestell und legen Sie ihn vorsichtig auf einen Tisch in unmittelbarer Nähe der Arena.
   12. Entfernen Sie die Maus aus dem Hauskäfig und legen Sie sie sanft in die Mitte der Arena, mit Blick auf die Objekte.
   13. Lassen Sie die Maus die Objekte für 15 min frei erkunden. Während dieser Zeit stören die Mäuse nicht.
   14. Am Ende der Sitzung legen Sie die Maus vorsichtig wieder in den Hauskäfig. Reinigen Sie die Arena und die Objekte mit 70% EtOH und dH ₂ O. Legen Sie diese Objekte wieder in thE arena
   15. Wiederholen Sie Schritt 4.2.11, bis alle Mäuse einem Objekt vertraut sind.
   16. Sobald alle Mäuse auf ein Objekt vertraut sind, analysieren Sie die Videos.
       HINWEIS: Objekt-Explorationen werden gezählt, sobald die folgenden Kriterien erfüllt sind: Die Maus orientiert sich an dem Objekt, die Schnauze ist innerhalb von 2 cm des Objekts, der Mittelpunkt des Tieres Körper ist über 2 cm vom Objekt und die vorherigen Kriterien Für mindestens 1 s erfüllt worden Darüber hinaus, wenn ein Tier die Erkundungskriterien erfüllt hat, aber Unbeweglichkeit für> 10 s zeigt, wird der Erkundungs-Kampf als abgeschlossen erachtet.
   17. Berechnen Sie eine Objekt-Bias-Punktzahl für jede Maus wie folgt.
       
       HINWEIS: Mäuse, die eine Objekt-Bias-Punktzahl unter 20% oder über 80% aufweisen, werden von weiteren Experimenten ausgeschlossen.
3. Die letzte Phase der neuartigen Objekterkennung beinhaltet die Beurteilung des ErkundungsverhaltensGerichtet auf ein neuartiges und vertrautes Objekt in der Umgebung, das hier als Testphase bezeichnet wird. Diese Phase wird 2-3 h nach Beendigung der Probenphase durchgeführt.
   1. Vor dem Beginn einer Testphasen-Session legen Sie Objekte in die Arena und fixieren sie auf den Boden, damit die Tiere die Objekte nicht bewegen können.
      1. Legen Sie die Objekte in die gleiche Position in der Arena relativ zur Probenphase ¹³ .
      2. Gleichgewicht der relativen Position der neuartigen und vertrauten Gegenstände über Genotypen und Behandlungsgruppen.
      3. Stellen Sie sicher, dass genügend Abstand zwischen den Wänden und Objekten vorhanden ist, damit die Mäuse die Objekte aus allen Winkeln frei erforschen können.
   2. Einrichten des Datenerfassungssystems und / oder Videokameras. Bestätigen Sie die korrekte Verfolgung von Mäusen und Objekten im Labyrinth. Kalibrieren Sie Distanzen in der Arena mit aufgenommenen Videobildern eines Lineals oder eines anderen Objekts mit bekannter Länge.
   3. Markiere Ecken der Arena in der SoftwSind die Bewertung von Positionsvorspannungen zu ermöglichen. Markieren Sie Objekte in Software und verfolgen Sie das Sondierungsverhalten für jedes Objekt einzeln ( dh "Novel" und "Vertraut").
   4. Entfernen Sie den Käfig aus dem Gestell und legen Sie ihn vorsichtig auf einen Tisch in unmittelbarer Nähe der Arena.
   5. Legen Sie die Tiere vorsichtig in die Mitte der Arena, mit Blick auf die Objekte. Mäuse für 10 Minuten frei erforschen.
   6. Am Ende der Test-Session entfernen Sie Mäuse aus der Arena und legen Mäuse wieder in ihren Hauskäfig. Die Arena und Gegenstände mit einem unscented Bleichmittel keimtöten, 70% EtOH und dH ₂ O nach jeder Sitzung sorgfältig reinigen.
   7. Wiederholen Sie ab Schritt 4.4.3, bis alle Tiere beurteilt wurden.
   8. Sobald die Objekt-Exploration für alle Mäuse gemessen wird, werden Videos analysiert.
      HINWEIS: Objekt-Explorationen werden gezählt, sobald die folgenden Kriterien erfüllt sind: Die Maus ist auf das Objekt ausgerichtet, die Schnauze ist innerhalb von 2 cm des Objekts, der Mittelpunkt vonDer Körper des Tieres ist über 2 cm vom Objekt entfernt, und die vorherigen Kriterien wurden für mindestens 1 s erfüllt. Darüber hinaus, wenn ein Tier die Erkundungskriterien erfüllt hat, aber Unbeweglichkeit für> 10 s zeigt, wird der Erkundungs-Kampf als abgeschlossen erachtet.
   9. Beurteilen Sie die neuartige Objekterkennung, indem Sie die Zeit verglichen haben, die den Roman mit dem bekannten Objekt erforscht. Drei Methoden werden in der Literatur häufig berichtet.
      1. Analysieren Sie die Rohzeit, die die Erforschung von neuartigen und vertrauten Objekten mit einem wiederholten Maßtest untersucht hat. Diese Methode wird am besten verwendet, wenn Genotyp und / oder Behandlung nicht die gesamte Explorationszeit beeinflussen.
      2. Berechnen Sie Neuheit Präferenz, mit der Gleichung:
         
         HINWEIS: Dies ergibt den prozentualen Zeitaufwand für die Erforschung des neuartigen Objekts relativ zum Gesamtzeit-Erkundungsobjekt. Die Werte reichen von 0% (keine Erforschung des neuartigen Objekts) bis 100% (Erkundung nur des neuartigen obMit einem Wert von 50%, der die gleiche Zeit für die Erforschung von neuartigen und vertrauten Objekten anzeigt.
      3. Berechnen Sie den Diskriminierungsindex ¹¹ mit der Gleichung:
         
         HINWEIS: Dies ergibt den zeitlichen Unterschied, der die neuartigen und vertrauten Gegenstände in Bezug auf die Gesamtzeit der Erkundungsobjekte erforscht. Werte reichen von -1 (Erkundung nur des vertrauten Objekts) bis +1 (Erforschung nur des neuartigen Objekts, mit einem Wert von 0, der die gleiche Zeit für die Erforschung neuartiger und vertrauter Gegenstände anzeigt.
   10. Entfernen von Tieren, die aufgrund der hyperdynamischen Fortbewegung oder anderer Stereotypen nicht an der Test-Session teilnehmen, aus Betrachtung ¹¹ .
       HINWEIS: Kriterien, die für die Entfernung verwendet werden, müssen objektiv sein und a priori für das Mausmodell bestimmt werden ( dh <5 ^th Perzentil für die gesamte Explorationszeit und entweder> 100 DurchschnittDrehwinkel während der Test-Session oder> 50. Perzentil Zeit zeigt myoklonischen Ecksprung).

5. Beurteilung der kortikospinalen Funktion bei Mäusen mit Gliedmaßenverschluss ¹⁴

1. Videodokument die gesamte Sitzung. Notieren Sie das Video mit einem tragbaren Handgerät ( zB Smartphone oder gleichwertig).
   HINWEIS: Leistungsanalysen zeigen an, dass Probengrößen von 10-15 Mäusen pro Gruppe für ein β ≤0.2 erforderlich sind.
2. Entfernen Sie den Hauskäfig aus dem Rack und legen Sie ihn auf einen Tisch. Dokumentieren Sie die Tier-ID im Video vor dem nächsten Schritt.
3. Entfernen Sie die Maus vorsichtig aus dem Käfig und hängen Sie den Schwanz für 5-10 s. Das Video muss die Hinter- und Hinterpfoten des Tieres aufzeichnen, während es suspendiert ist.
4. Nach der Aufnahme von mindestens 5 s Video, legen Sie die Maus wieder in den Hauskäfig, und bringen Sie den Käfig in das Rack.
5. Den Tisch wischen; Wisch den Tisch. Wiederholen Sie von Schritt 5.2, bis alle Mäuse recorde wurden D.
6. Score Gliedmaßenklammern von Videos von Mäusen, die durch ihren Schwanz auf einer Skala von 0-4 aufgehängt sind (siehe Tabelle 1 zur Beschreibung der Bewertung). Überprüfe Videos von suspendierten Mäusen und ordne dann eine Punktzahl nach folgenden Kriterien zu.
   1. Keine Gliedmaßenklammern Normale Fluchtverlängerung Ein hinteres Glied zeigt unvollständige Spuren und Verlust der Mobilität. Zehen zeigen normales Spiel.
   2. Beide Hinterbeine zeigen unvollständige Spuren und Verlust der Mobilität. Zehen zeigen normales Spiel.
   3. Beide Hinterbeine zeigen sich mit gewellten Zehen und Unbeweglichkeit.
   4. Forelimbs und Hinterbeine zeigen Klammern und sind gekreuzt, gekrümmte Zehen und Unbeweglichkeit.
7. Alle Mäuse werden von 2 unabhängigen Forschern bewertet. Jede Maus, bei der sich die 2 Punkte um mehr als 1 Punkt unterscheiden, wird noch einmal wiederholt.
   1. Noten, die sich unterscheiden, werden gemittelt.

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Tabelle 1: Beschreibung der Gliedmaßenklammern.

Ergebnisse

Aged Tg2576 Mäuse zeigen robuste Defizite in spontanen Wechsel in einem Y-Labyrinth ^{15 , 16} , einem Phänotyp, der mit den hier beschriebenen Methoden repliziert werden kann (Abbildung 1A ). Während bei diesen Mäusen ein Trend für erhöhte Armeinträge beobachtet wird (Abbildung 1B ), beeinflusste die in dieser Mäuse beobachtete Hyperaktivität die spontane Wechselrate nicht (Abbildung 1C ). Im Gegensatz dazu scheinen gealterte rTg4510-Mäuse einen erhöhten spontanen Wechsel zu zeigen, wenn sie in ein Y-Labyrinth platziert wurden ( 1D ). Dies ist auf die extreme Hyperaktivität (Abbildung 1E ) und die Stereotypie ¹⁰ zurückzuführen, die die Messung des spontanen Wechseles erheblich beeinträchtigen (Abbildung 1F ). Bei der anfänglichen Beurteilung von Mäusen in dieser Aufgabe ist es entscheidend, sicherzustellen, dass Armeinträge und / oder zurückgelegte Strecke nicht sindSignifikant korreliert mit der spontanen Wechselrate.

Vor der Beurteilung der neuartigen Objekterkennung sind Mäuse in der Arena gewohnt, in der der Test durchgeführt wird. Während der Gewöhnung können Hyperaktivität (Abbildung 2A ) und andere stereotype Verhaltensweisen, die für das Mausmodell relevant sind, beurteilt werden. Während der Probenphase ist es entscheidend, die Exploration jedes Objekts separat zu messen, so dass Mäuse, die signifikante Vorurteile im explorativen Verhalten aufweisen, von einer weiteren Beurteilung ausgeschlossen werden können (Abbildung 2B , offene Kreise). Die neuartige Objekterkennung wird durch Vergleich der Erforschung eines vertrauten und neuartigen Objekts beurteilt und wird häufig auf drei verschiedene Arten analysiert. Wenn die totale Erkundungszeit über Genotypen und / oder Behandlungsgruppen vergleichbar ist, dann kann die rohe Zeit, die jedes Objekt erforscht, und eine entsprechende wiederholte Messversuche verwendet werden, um festzustellen, ob es Unterschiede im neuartigen Objekt r gabErkenntnis (Abbildung 2C ). Wenn ein bestimmter Mausstamm Unterschiede in der Gesamt-Explorationszeit aufweist, kann die neuartige Objekterkennung entweder mit der Neuheit-Präferenz (Abbildung 2D ) oder dem Diskriminierungsindex (Abbildung 2E ) beurteilt werden.

Gliedmaßenklammerung ist ein funktioneller Motor Test, der Defizite in der kortikospinalen Funktion quantifiziert. Die Gliedmaßenklammerung, die kein kognitives Maß ist, wird in mehreren transgenen Tau-Mausmodellen ^{6 , 17 , 18 , 19} beobachtet und einige der funktionellen motorischen Defizite, die bei Patienten mit Endstadium beobachtet wurden, zusammengefasst. Die Suspension von Mäusen durch den Schwanz löst eine Fluchtreaktion aus ( Fig. 3A , "0"). Defizite in der Fähigkeit, die Hinterbeine zu spucken und die Zehen zu verlängern, werden auf der Grundlage ihrer Schwere auf einer Skala von 0-4 bewertet ( Abbildung 3A). Unter Verwendung des hierin beschriebenen Verfahrens kann man in rTg4510-Mäusen signifikante Schenkelklammern beobachten (Abbildung 3B ).

Abbildung 1: Spontane Veränderung im Y-Labyrinth ( A ) Wenn sie in ein Y-Labyrinth gebracht werden, nehmen Mäuse eine Lose-Shift-Suchstrategie ein, die zu einem Explorationsmuster führt, wobei jeder Arm nur einmal für alle 3-armigen Einträge erforscht wird. Aged Tg2576 Mäuse zeigen ein signifikantes Defizit im spontanen Wechsel. Unter Verwendung der in dieser Methode beschriebenen Verfahren wurde eine signifikante Wiederherstellung des spontanen Wechsels nach Behandlung mit einer proprietären Verbindung beobachtet. Die Daten wurden unter Verwendung von 1-Wege-ANOVA analysiert und Post-hoc-Vergleiche mit Tg-PBS wurden unter Verwendung von Dunnett-Test durchgeführt. ** p <0,01. Fehlerbalken zeigen SEM an. ( B ) Die Anzahl der Armeinträge war nicht signifikant unterschiedlichDer Gruppen, die in diesem Experiment überwacht wurden. Die Daten wurden mittels 1-Wege-ANOVA-Test analysiert. Fehlerbalken zeigen SEM an. ( C ) Es gab keine Korrelation zwischen spontanem Wechsel und der Anzahl der ausgeübten Armeinträge, was darauf hinweist, dass irgendwelche Unterschiede in der spontanen Bewegungsaktivität die Quantifizierung des spontanen Wechseles nicht beeinflussen. Der Korrelationstest wurde unter Verwendung der Pearson-Korrelationsanalyse durchgeführt. ( D ) Wenn sie in ein Y-Labyrinth platziert werden, zeigen rTg4510-Mäuse (6 Monate) einen signifikant spontaneren Wechsel im Vergleich zu Wurfmutter-WT-Mäusen. Die Daten wurden durch 1-Wege-ANOVA analysiert und Post-hoc-Vergleiche zu Tg-PBS wurden unter Verwendung von Dunnett-Test durchgeführt. ** p <0,01. Fehlerbalken zeigen SEM an. ( E ) rTg4510 Mäuse machten aufgrund ihrer extremen hyperdynamischen Fortbewegung deutlich mehr Armeinträge. Die Daten wurden durch 1-Wege-ANOVA analysiert und Post-hoc-Vergleiche zu Tg-PBS wurden unter Verwendung von Dunnett-Test durchgeführt. P <0,001. Fehlerbalken zeigen SE anM. ( F ) Das spontane Wechselverhalten korrelierte signifikant mit den Armeinträgen, was darauf hinweist, dass der hyperdynamische Lokomotor-Phänotyp einen wahren spontanen Wechsel verfälscht hat. Der Korrelationstest wurde unter Verwendung der Pearson-Korrelationsanalyse durchgeführt (r = 0,7, p <0,0001). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2: Neue Objekterkennung. ( A ) Die Arena-Gewöhnung erlaubt die Messung von spontaner Fortbewegung und anderen stereotypen Verhaltensweisen, die für ein bestimmtes Mausmodell relevant sind. Hier zeigen im Alter von Tg2576-Mäusen (22 Monate) signifikant mehr spontane Fortbewegung im Vergleich zu Wurfmutter-WT-Mäusen. Die Daten wurden durch 1-Wege-ANOVA analysiert und Post-hoc-Vergleiche mit Tg-Veh wurden mit Dunnett 'S Test ** p <0,01. Fehlerbalken zeigen SEM an. ( B ) Während der Probenphase wurde die Erkundung zweier identischer Objekte separat verfolgt. Mäuse, die große Vorurteile zur Erforschung eines der beiden Objekte (offene Kreise) aufweisen, wurden von der Testphase ausgeschlossen. ( C - E ) Die neuartige Objekterkennung wurde durch Messung der Erforschung eines neuartigen und vertrauten Gegenstandes beurteilt. Die neuartige Objekterkennung wurde anhand der ( C ) rohen Explorationszeit, ( D ) Neuheitpräferenz oder ( E ) Diskriminierungsindex bewertet. Die Daten im Panel C wurden mit einer 2-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen analysiert und paarweise Vergleiche wurden mit Sidak-Test durchgeführt. Die Daten in den Panels DE wurden mit einem 1-Wege-ANOVA analysiert und Post-hoc-Vergleiche mit Tg-Veh wurden mit dem Test von Dunnett durchgeführt. * P <0,05, ** p <0,01. Fehlerbalken zeigen SEM an. bitte klickenHier eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3: Gliedmaßenverschluss. ( A ) Repräsentative Bilder von Mäusen, die verschiedene Grade der Gliedmaßenklammer aufweisen, wie in Tabelle 1 beschrieben. ( B ) rTg4510-Mäuse (6 Monate) zeigen eine signifikante Schenkelklammer in Bezug auf Wurfmatten-WT-Mäuse, die mit diesen Verfahren bewertet wurden. Die Daten wurden unter Verwendung eines 1-Wege-ANOVA- und Post-hoc-Vergleichs zu Tg-PBS analysiert, wurden unter Verwendung von Dunnett-Test durchgeführt. P <0,001, **** p <0,0001. Fehlerbalken zeigen SEM an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Diskussion

Bedeutung der Technik im Hinblick auf bestehende Methoden
Dieses Verfahren wurde entwickelt, um die in vivo- Aktivität von Verbindungen in transgenen Mausmodellen von & bgr; -Amyloidose und Tauopathie zu screenen. Der hier verwendete Stufenansatz sorgt für den Nachweis von wirksamen Verbindungen in kognitiven Domänen, die für AD ³ relevant sind. Darüber hinaus verwendet der hier beschriebene Ansatz Verhaltenstests, die klar definierte Endpunkte, leicht umsetzbare Qualitätskontrollen, können in einem moderaten Durchsatzformat durchgeführt werden und erfordern wenig Intervention vom Ermittler. Diese Eigenschaften führen zu Assays, die eine gute Reproduzierbarkeit innerhalb von Tieren und über Kohorten aufweisen, was zu niedrigen Intra- und Inter-Assay-Varianzen und Effektgrößen (2 ≤ f ≤ 6) führt, die robust genug sind, um die Verhaltensprofilierung in einer Wirkstoffforschungsumgebung zu unterstützen.

Kritische Schritte innerhalb der PrOtocol
Viele Mausmodelle im Einsatz für AD-Arzneimittel-Entdeckung zeigen Verhaltensweisen im Einklang mit erhöhter Angst und Aggression. Dies macht die Handhabungsgewohnheit für die Durchführung der hier beschriebenen Verhaltenstests wesentlich. Da diese Tests auf unmotivierte Verhaltensweisen beruhen, kann die grobe Behandlung durch den Ermittler aufgrund einer hyperaktiven und ängstlichen oder aggressiven Maus die Leistung erheblich beeinflussen. Eine erhöhte Angst könnte dazu führen, dass die Aufgabe nicht erfüllt wird, wodurch die Gesamtleistung des Tests reduziert wird. Darüber hinaus sind Lichtniveaus in der Arena wesentlich für die Erleichterung der spontanen Fortbewegung, die für jeden Test benötigt wird. Helles Licht neigt dazu, die Angst zu erhöhen und die Fortbewegung bei Nagetieren zu unterdrücken, daher ist darauf zu achten, dass die Umgebungslichtpegel auf 30-35 Lux in der Arena eingestellt werden.

Ein weiterer kritischer Aspekt des Verfahrens ist die Minimierung von starken Umwelteinflüssen, die die Fähigkeit eines Tieres, die Aufgaben zu erfüllen, beeinträchtigen würden. Reinigung derArena und Gegenstände zwischen den Läufen ist wichtig, da Mäuse auf neuartige Düfte in der Umgebung angezogen sind. Das Versagen, die Arena gründlich zu reinigen, und Gegenstände könnten dazu führen, dass die spontane Aktivität der Maus verschoben und die wahren kognitiven Fähigkeiten maskiert wird. Die Ermittler sollten auch die Verwendung von Hygieneprodukten und Colognes / Parfums bei der Durchführung dieser Verfahren minimieren. Schließlich zeigen Nagetiere robuste tägliche und zirkadiane Veränderungen in vielen offenen Verhaltensweisen ²⁰ einschließlich Lernen und Gedächtnis ²¹ . Deshalb, um die Abweichung aufgrund der täglichen Rhythmen in basalen Verhaltensweisen und kognitiven Leistungen zu minimieren, sollten alle Tests zur gleichen Zeit des Tages über Kohorten und Studien durchgeführt werden.

Weiterhin sind insbesondere im Hinblick auf die neuartige Objekterkennung das Verzögerungsintervall zwischen Abtast- und Testphase und die Auswahl und Platzierung von Objekten in der Umgebung kritische Parameter. Gedächtnis existiert in 3 verschiedenen Formen: kurzfristig memOry (STM), Zwischenspeicher (ITM) und Langzeitspeicher (LTM) ^{22 , 23} . Das Ändern des Intervalls zwischen Probe und Testphasen von Minuten (STM) bis Stunden (ITM) oder Tage (LTM) ändert die Art des durch die Prozedur getesteten Speichers ¹² . Darüber hinaus sollten vor dem Ausführen des neuartigen Objekterkennungstests viele Objekte in einer Testkohorte von Mäusen auf potenzielle Vorspannungen bei der Exploration untersucht werden. Ein Objekt, das übermäßig attraktiv oder abstoßend für die Testkohorte ist, kann bei der Beurteilung der neuartigen Objekterkennung nicht verwendet werden. Idealerweise werden alle Objekte, die im Test eingesetzt werden, wenn sie in eine Arena gelegt werden, gleiche Erkundungszeiten aus einer naiven Mündungskohorte auslösen. Unzureichende Prüfung und Optimierung von Objekten können die Kraft der neuartigen Objekterkennung erheblich reduzieren.

Änderungen und Fehlersuche
Es gibt mehrere Faktoren, die dieScheinbare Variabilität in den hier beschriebenen kognitiven Tests. Viele Mausmodelle von AD zeigen eine hyperdynamische Fortbewegung ³ , die das Verhalten als kognitiver Endpunkt maskieren oder verändern kann. Darüber hinaus gibt es wachsende Belege dafür, dass Sex ^{24 , 25 , 26} und sogar mütterlicher Genotyp ²⁷ die Entwicklung und Progression von Neuropathologie und kognitiven Phänotypen in AD-Mausmodellen beeinflussen können. Unerwartete Variabilität oder Misserfolg, eine Verhaltensaufgabe zu implementieren, könnte auf einen dieser Faktoren zurückzuführen sein. Bei der ersten Durchführung eines bestimmten Verhaltenstests sollten die Ergebnisse immer nach Geschlecht, Alter und ggf. mütterlichem Genotyp geschichtet werden. Darüber hinaus sollten die in diesem Verfahren beschriebenen Qualitätskontrollen stets durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass Hyperaktivität oder andere stereotype Verhaltensweisen die Quantifizierung kognitiver Endpunkte nicht beeinträchtigen.

EnvBügeleisen kann auch das spontane explorative Verhalten von Nagetieren beeinflussen. Duftstoffe oder Töne, die für Forscher nicht nachweisbar sind, könnten Mäuse anziehen oder abstoßen, die Ergebnisse von kognitiven Tests, die auf spontanes Verhalten beruhen, schiefen. Bei der anfänglichen Erstellung von Y-Labyrinth oder neuartiger Objekterkennung ist die Durchführung der Kontrollmaßnahmen, um sicherzustellen, dass keine Positionsvorspannungen bei der Erforschung von Objekten und / oder der Umwelt vorliegen, unerlässlich. Wenn Positionsvorspannungen beobachtet werden, müssen die Ermittler die Umwelt gründlich untersuchen und die Beleuchtung, die Arena-Platzierung, den Standort des Prüfraums im Vergleich zu anderen Räumen in der Anlage ( dh nicht in der Nähe eines hohen Traffick-Bereichs oder schwerer Ausrüstung) und Arena-Reinigungsverfahren anpassen.

Die Habituation in der Testumgebung ist der Schlüssel zur Erreichung einer optimalen Leistung im neuartigen Objekterkennungstest. Zum Beispiel können niedrige Gesamt-Explorationszeiten auf unzureichende Gewöhnung zurückzuführen sein. Als Alternative zum Proc(Abschnitt 2) und Arena (Abschnitt 4.2) Gewöhnung, Gewöhnung an Handhabung und die Testumgebung können als 3, 5 min Sitzungen pro Tag für 2 aufeinanderfolgende Tage durchgeführt werden.

Einschränkungen der Technik
Wie bei jedem Verfahren haben diese Verhaltenstests Einschränkungen. Diese Verfahren wurden eingesetzt, weil sie die Funktion verschiedener kortikaler Regionen und Hippocampus testen. Wenn das Mausmodell keine funktionalen Defizite in Hirnregionen aufweist, die durch diese Tests untersucht werden, dann sind diese Techniken nicht sinnvoll. Darüber hinaus haben wir kognitive Tests gewählt, die kurzfristiges Gedächtnis untersuchen. Wenn der Wirkmechanismus der Verbindung unter präklinischer Beurteilung nicht mit dem Kurzzeitgedächtnis behaftet wird, dann sollten diese Verfahren entsprechend modifiziert werden ( dh das Abtastprobenphasenintervall erhöhen, um den Langzeitspeicher zu testen). Schließlich verwenden diese Tests unmotivierte Verhaltensweisen. Deshalb, wenn ein Mausmodell exces istSehr hyperaktiv oder zeigt andere stereotype Verhaltensweisen, die die Erforschung der Umwelt verhindern, dann sind diese Verfahren möglicherweise nicht optimal. Als Alternative könnte man Angstkonditionierung für Tg2576 oder andere β-Amyloidose-Mausmodelle oder das räumliche Wasser-Labyrinth für rTg4510 oder andere Mausmodelle der Tauopathie verwenden ³ verwenden.

Zukünftige Anwendungen
Sobald diese Verfahren erfolgreich im Labor verabschiedet wurden, können mehrere Modifikationen oder Erweiterungen vorgenommen werden, um zusätzliche kognitive und funktionelle motorische Maßnahmen zu beurteilen. Um beispielsweise die neuartige Objekterkennungsaufgabe zu ändern, um festzustellen, ob eine Maus eine Änderung der Platzierung eines Objekts ¹³ erkennen kann. Alternativ könnte man statt der Verwendung von Objekten auch andere Mäuse benutzen und einen Test der gesellschaftlichen Anerkennung umsetzen. In Bezug auf die Gliedmaßenklammer und die motorische Funktion könnte man diesen Test mit den Drahtaufhängung und / oder Grifffestigkeitstests ergänzen. Die TestsDetailliert in dieser Methode bilden eine feste Basis, um für Verbindungen, die in vivo Wirksamkeit in translationalen Mausmodellen für AD haben, zu screenen und können in vielerlei Hinsicht angepasst oder modifiziert werden, um ein bestimmtes Mausmodell am besten abzufragen oder die Bedürfnisse eines einzigartigen Arzneimittelforschungsprogramms zu erfüllen .

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Topscan Lite-High Throughput	Cleversys		Automatisierte Verhaltensanalyse. Inklusive Kameras und Videoerfassungssystem, Laptop.
ObjectScan	Cleversys		Software-Modul für die genaue Quantifizierung der Objekterkundung
Offenes Feld für Maus	Cleversys	CSI-OF-M	Arena für neuartige Objekterkennung
Y-Labyrinth für Maus	Benutzerdefinierte		Arme: 30 cm lang, 10 cm breit, 20 cm hohe Wände, 120 Grad voneinander entfernt.
Kamerahalterung für offenes Feld	Custom	Custom	76 cm hoch, 115 cm breit, Kameras @ 30 cm von beiden Seiten montiert.  Zwei Halterungen, die jeweils zwei Boxen abdecken.
Kamerahalterung für Y-maze	Custom	Custom	76 cm hoch, 115 cm breit, Kameras montiert @ 30cm in von beiden Seiten.  Ein Reittier bedeckt zwei Labyrinthe.
Murmeln	Inperial Toy	8565	Standard (15,5 mm Durchmesser) Glasmurmeln.
Würfel	Cardinal Industries	770	Standard (0.650 inch) weiße Würfel mit schwarzen Punkten.
LOCTITE Fun-Tak	Henkel	B018A3AG0W	Standard blue sticky
tak EtOH	Nexeo Solutions	82452	100% Ethanol Verdünnt auf 70% mit destilliertem Wasser
dH2O	Tulpenhocken Spring Water Co.	-	PA D.E.P. #31, NJ D.O.H. #0049, NYSHD Cert. #320
Papierhandtücher	Procter & Gamble	B019DM86LA	Bounty, weiße
Handheld-Videokamera	Apple, Inc.	MKV92LL/A	Erfassung eines Videos zum Umklammern von Gliedmaßen, Iphone 6S Plus (oder funktionales Äquivalent).
Handschuhe	SafePOINT, L.L.C.	GL640-2	Standard, puderfreie Latexhandschuhe, Medium
Belichtungsmesser	Dr. Meter	LX1330B	Beleuchtung @ Unterseite des Open Field = 35 LUX, Beleuchtung @ Unterseite des Y-Labyrinths = 32 LUX
Keimtötende Bleichtücher	Clorox		Sterilisation von Geräten während und nach dem Gebrauch