In - vitro - Bildgebung und Quantifizierung des Drug Targeting Efficiency von fluoreszierend markierten GnRH - Analoga

Summary

Selektiv markierte fluoreszierende GnRH-I, -II und -III - Derivate sind zuverlässige Werkzeuge für die Verfolgung und ihre zelluläre Aufnahme zu quantifizieren. Diese Handschrift stellt Experimente zu visualisieren, zu quantifizieren und die Aufnahmeeffizienz dieser GnRH-Konjugate in verschiedenen Zelllinien zu vergleichen.

Abstract

GnRH-Analoga sind effektive Targeting-Einheiten und in der Lage Anti-Krebs-Mittel, die hoch express GnRH-Rezeptoren selektiv in malignen Tumorzellen zu liefern. Allerdings sind die quantitative Analyse der GnRH-Analoga "zelluläre Aufnahme und die untersuchten Zelltypen in GnRH-basierten Wirkstoffabgabesysteme derzeit begrenzt. Zuvor eingeführt, selektiv markierte fluoreszierende GnRH-I, -II und -III-Derivate bieten große Nachweisbarkeit, und sie haben geeignete chemische Eigenschaften für reproduzierbare und robuste Experimente. Wir fanden auch, dass die entsprechenden up-to-date Methoden mit dieser markierten GnRH-Analoga neue Informationen über die GnRH-basierte Drug-Delivery-Systeme bieten konnte. Dieses Manuskript stellt einige einfache und schnelle Experimente in Bezug auf die zelluläre Aufnahme von [D-Lys ⁶ (FITC)] - GnRH-I, [D-Lys ⁶ (FITC)] - GnRH-II und [Lys ⁸ (FITC)] - GnRH -III auf der EBC-1 (Lunge), die BxPC-3 (Pankreas) und auf der Detroit-562- (Pharynx) maligne tumor Zellen. Parallel zu diesen GnRH-FITC-Konjugate wurde die Zelloberflächenpegel von GnRH-I-Rezeptoren auch auf diese Zelllinien untersucht vor und nach der Behandlung durch GnRH konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie. Die zelluläre Aufnahme von GnRH-FITC-Konjugate wurde durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung quantifiziert. In diesen Experimenten geringfügige Unterschiede zwischen den GnRH-Analoga und die wichtigsten Unterschiede zwischen den Zelltypen beobachtet. Die signifikanten Unterschiede zwischen den Zelllinien sind mit ihrer ausgeprägten Maß an Zelloberflächen-GnRH-I-Rezeptoren korreliert. Die vorgestellten Experimente enthalten praktische Methoden zu visualisieren, zu quantifizieren und die Aufnahmeeffizienz von GnRH-FITC-Konjugate in einer zeit- und konzentrationsabhängigen Art und Weise auf verschiedenen adhärenten Zellkulturen vergleichen. Diese Ergebnisse könnten die Drug-Targeting-Effizienz von GnRH-Konjugate auf der gegebenen Zellkultur vorhersagen, und bieten eine gute Grundlage für weitere Experimente bei der Untersuchung von GnRH-basierte Drug-Delivery-Systeme.

Introduction

Peptid - basierten gezielten Wirkstoffabgabesysteme haben eine schnelle Entwicklung und vielversprechender Bereich in der Krebstherapie in den letzten Jahren zu ^{1, 2.} Menschliche Gonadotropin - Releasing - Hormon - Rezeptor Typ I (GnRH-IR) wird in erster Linie in der Hypophyse befindet , sondern auch in verschiedenen anderen Geweben , die für die Selbstreproduktion ³ verantwortlich sind. GnRH-IR ist auch in einer Reihe von Krebsgewebe, im Zusammenhang oder in keinem Zusammenhang mit dem Fortpflanzungssystem ^{4, 5} ausgedrückt. Die hohe Expression von GnRH-IR bei verschiedenen malignen Tumorzellen im Vergleich zu gesunden Geweben bietet die Möglichkeit für eine zielgerichtete Therapie ^{5, 6.}

Viele Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH) Analoga wurden in den letzten Jahrzehnten entwickelt, die als Targeting-Einheiten verwendet werden könnte,f "> ^{7, 8, 9.} Diese Peptide sind in der Lage Antikrebsmittel mit hoher Selektivität in maligne Tumorzellen zu liefern , die überexprimieren GnRH-IR ^6. Mehrere GnRH konjugierten anti-Tumor - Arzneimittel mit höherer Selektivität und eine bessere Wirksamkeit als das entsprechende nicht - konjugiertem freie Arzneimittel wurden ^{7 berichtet, 8, 9.}

Zurück Publikationen zu GnRH - Peptide und deren Rezeptoren berichtet , dass die GnRH-IR verschiedene Konformationen annehmen kann , die unterschiedliche Selektivität für GnRH - Analoga ^10. Die hochvariable GnRH-IR ist komplex und verschiedene Signalwege mit unterschiedlichen Aktivität gegen ihre natürlichen und künstlichen Liganden ¹¹ dotiert. Diese Tatsachen machen Untersuchung von GnRH-basierte Systeme eine Herausforderung. Auf der anderen Seite, die y besitzen vielversprechendes therapeutisches Potential. Mehrere Experimente mit radioaktiv markierten GnRH - Peptide zuvor ¹² gemeldet ^{wurden, 13, 14, 15,} aber Versuche , bei denen fluoreszenzmarkierte wurden GnRH - Analoga verwendet werden , sind noch begrenzt. Während die radioaktive Markierung eine hohe Empfindlichkeit bietet, hat die Fluoreszenzmarkierung einige andere Vorteile, beispielsweise die einfachere Handhabung und die Möglichkeit, mit unterschiedlichen Fluorophoren Gegenfärbung. Drei gemeinsame GnRH - Analoga , die erfolgreich für die Arzneimittelzufuhr verwendet wurden , sind die [D-Lys ^6] -GnRH-I, [D-Lys ^6] -GnRH-II und GnRH-III, aber die Wirksamkeit dieser Peptide als Targeting - Einheiten ist , selten ¹⁶ verglichen wird ^{, 17.} Auf der anderen Seite ergibt sich aus verschiedenen Experimenten, in denen verschiedene Krebszellen und GnRH-Analoga verwendet wurden, ist vielfältig.

ntent "> Basierend auf diesen Überlegungen konzentrierten wir uns auf die Tumor - Targeting und Arzneimittelabgabepotential dieser GnRH - Peptiden und dadurch synthetisiert und charakterisiert den [D-Lys ⁶ (FITC)] - GnRH-I, [D-Lys ⁶ (FITC )] - GnRH-II und [Lys ⁸ (FITC)] - GnRH-III ¹⁸ - Peptid - Konjugate dieser Analoga sind mit FITC an der Seitenkette ihrer Lys oder D-Lys (Peptid-FITC Verhältnis 1 selektiv markiert: 1 bei jedem. Konjugat). die Idee war, dass die selektive Fluoreszenzmarkierung neue Informationen über diese Peptide bieten können, und ermöglicht ihre gute Tracking und zuverlässige Quantifizierung. Diese Konjugate haben eine sichere Handhabung und zuverlässige Erkennbarkeit, die es einfacher machen, ihre Tumor-Targeting die Effizienz zu vergleichen, und die Screening von zahlreichen Arten von bösartigen Tumorzellen. Wir hoffen, dass auf dem neuesten Stand Experimente mit diesen Peptid-Konjugate auf die Entwicklung neuer Krebs beitragen könnten, GnRH-Wirkstoff-Konjugate Targeting und dazu beitragen, neue therapeutische Teer zu identifizierenals auch bekommt.

Die vorliegende Manuskript zeigt einige gut reproduzierbare und schnelle Experimente mit GnRH-FITC-Konjugate. Die Zelloberflächenexpression von GnRH-R ist eine bestimmend Bedingung hinsichtlich GnRH-Aufnahme, daher gleichzeitig wir die Zelloberflächenniveau GnRH-IR auf den getesteten Zelllinien untersucht. Wir visualisiert die GnRH-IR und GnRH-FITC-Konjugate durch konfokale Laserrastermikroskopie (CLSM) und quantifiziert die zelluläre Aufnahme von GnRH-FITC-Konjugate unter Verwendung von fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS).

Protocol

1. Herstellung von Zellkulturen und Reagenzien

1. Pflegen Sie die Zellkulturen in dem vom Hersteller empfohlenen Medium, ergänzt mit 10% (v / v) fötalem Rinderserum und Antibiotika (genannt komplettes Medium). Halten der Zellkulturkolben in einer befeuchteten, 5% CO ₂ -Atmosphäre Inkubator bei 37 ° C. Folgen Sie der Proliferation und Konfluenz der Zellen durch inverses Mikroskop (mit 10X Phasenkontrastobjektiv).
2. Wenn Zellen ausreichende Konfluenz erreichen, entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Kultur mit 2-3 ml, sterile phosphatgepufferte Salzlösung (PBS). Entfernen Sie die PBS und 0,5 mL, sterile 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung zur Zellkultur und Inkubation bei 37 ° C, bis die Zellen lösen (ca. 10 min).
3. Die Zellen in 3-4 ml sterile Komplettmedium Trypsin zu stoppen und sie in ein steriles Zentrifugenröhrchen übertragen. Zentrifugieren der Zellen bei 150 g für 4 min bei Raumtemperatur (RT). Überstand vorsichtig verwerfen und die Aussetzung der pEllet in 2-3 ml sterile Komplettmedium.
4. Nehmen Sie 100 ul der Zellsuspension und mischen sich mit 100 ul 0,4% (m / V) Trypanblaulösung, die toten Zellen zu färben. Last 10 ul dieser Mischung in einem Hämozytometer und bestimmen die Anzahl der lebensfähigen Zellen durch inverses Mikroskop.
5. Verdünne die erforderliche Menge an Zellsuspension hergestellt in Schritt 1,3 bis 10 ml mit sterilem Komplettmedium, enthaltend 4 x 10 ⁴ Zellen / mL.
6. Nach Eintragen von 250 & mgr; l Zellsuspension (hergestellt in Schritt 1.5) pro Vertiefung (10 ⁴ Zellen / Vertiefung) in sieben Vertiefungen der ersten Glasboden 8-well Objektträger. Verwenden Sie diese Folie in der GnRH-Aufnahme-Methode.
7. In 250 ul der Zellsuspension (hergestellt in Schritt 1.5) pro Vertiefung (10 ⁴ Zellen / Vertiefung) in fünf Vertiefungen der zweiten 8-Well - Objektträger. Diese Folie wird in der GnRH-IR Expressionsverfahren verwendet werden.
8. 1 ml Zellsuspension (hergestellt in Schritt 1.5) pro Mulde (4 x 10 ⁴ Zellen / Vertiefung) in sieben wells einer 12-Well-Platte. Diese Platte wird in der GnRH Quantifizierungsverfahren eingesetzt werden.
9. Lassen Sie die Zellen auf den beiden Objektträger und der Platte haften. Inkubieren sie in einer befeuchteten, 5% CO ₂ -Atmosphäre Inkubator bei 37 ° C für 48 h.
10. Nach der Inkubation überprüfen Sie die Zellen durch inverses Mikroskop (10fach Phasenkontrastobjektiv verwendet wird). Wenn die Zellen gesund und befestigt sind, mit den folgenden Schritten fort.
11. Herstellung von 10 mM GnRH-FITC - Stammlösung in Dimethylsulfoxid (DMSO) von jedem der drei Konjugate ^18. (Verwenden Sie diese Verdünnung Konzentrationen: 16,43 ug / ul [D-Lys ⁶ (FITC)] - GnRH-I, 16,97 ug / ul [D-Lys ⁶ (FITC)] - GnRH-II und 16.47 ug / ul [Lys ⁸ ( FITC)] - GnRH-III) Bewahren sie diese Stammlösungen in einem dunklen Ort bei RT und innerhalb von ein paar Wochen.
12. Verdünnen Sie 1,7 ul jeder der drei 10 mM GnRH-FITC-Stammlösungen in 1,7 ml Vollmedium. Schütteln Sie diese Lösungen. (These sind die 10 uM GnRH-FITC Medien zu behandeln.) verdünnt 150 & mgr; l jeder der drei 10 uM GnRH-FITC Behandlungsmedium in 1,35 ml vollständigem Medium. Schütteln diese Lösungen als auch (dies sind die 1 uM GnRH-FITC Behandlungsmedium).
    HINWEIS: Alle GnRH-FITC Behandlungsmedium enthalten, sollten vor Licht und innerhalb von wenigen Stunden geschützt werden.
13. Vorwärmen der sechs GnRH-FITC Behandlungsmedium (hergestellt in Schritt 1.12) und 4 ml vollständigem Medium bis 37 ° C.
14. Verdünnte 3 ul 5 mM fluoreszierenden Sondenlösung (nuclear Gegenfärbemittel in der Materialliste angegeben) in 3 ml PBS auf 5 & mgr; M. Diese Lösung sollte vor Licht geschützt werden, ist es bei RT halten und es innerhalb weniger Stunden verbrauchen.

2. konfokale Laser Scanning Mikroskopie (CLSM)

1. GnRH - Aufnahme - Methode
   1. Nehmen Sie die erste in Schritt hergestellten Objektträger 1.6 und Pipette aus dem vollständigen Medium aus jedem der sieben gut. In 250 ul vorgewärmte komplett medium in die erste gut. Verwenden Sie diese als negative Kontrolle. Nach Eintragen von 250 & mgr; l des vorgewärmten GnRH-FITC Behandlungsmedien (von 1,13) zu jedem der nächsten sechs Vertiefungen (3 Vertiefungen mit 1 & mgr; M und 3 mit 10 & mgr; M). Inkubieren des Objektträgers in einer befeuchteten, 5% CO ₂ -Atmosphäre Inkubator bei 37 ° C für 5 h.
   2. Pipette aus dem Medium aus jeder Vertiefung und waschen Sie die Zellen mit 250 ul PBS. Fügen Sie 250 ul der Fixier-Lösung (10% neutral gepuffertem Formalin) in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Folie bei RT für 10 min.
   3. Pipette aus der Fixier-Lösung aus jeder Vertiefung und waschen Sie die Zellen mit 250 ul PBS. In 250 ul PBS, das 5 uM Fluoreszenzsonde Lösung, hergestellt in Schritt 1.14 in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Folie bei RT für 10 min.
   4. Pipette aus der Fluoreszenzsonde Lösung aus jeder Vertiefung und waschen Sie die zweimal Zellen mit 250 & mgr; l PBS vorsichtig. 3-4 Tropfen Eindeckmedium in jede Vertiefung, endlich. Halten Sie die Folie in Dunkeln bei RT bis zur Bildgebung.
2. GnRH-IR - Expressionsverfahren
   1. Nehmen Sie die zweite 8-Well-Dia mikroskopisch in Stufe 1.7 und Pipette aus dem vollständigen Medium aus jedem der fünf Brunnen.
   2. In 250 ul vorgewärmte Komplettmedium in den ersten gut, verwenden Sie diese als negative Kontrolle. In 250 ul vorgewärmte Komplettmedium in die zweite gut zu, und verwenden Sie diese GnRH-IR-Expression vor der GnRH-Behandlung zu untersuchen.
   3. In 250 ul jeder der drei vorgeheizten 10 uM GnRH-FITC Behandlung von Medien in den nächsten drei Brunnen. Verwenden Sie diese Vertiefungen, die die Zellen mit GnRH-FITC-Konjugate vorzubehandeln, bevor der GnRH-IR-Expression zu untersuchen. Inkubieren des Objektträgers in einer befeuchteten, 5% CO ₂ -Atmosphäre Inkubator bei 37 ° C für 1 h.
   4. Pipette über das Behandlungsmedium aus jeder der drei Vertiefungen, die verwendet wird, GnRH-IR-Expression nach der GnRH-Behandlung zu untersuchen und zu waschen, diese Vertiefungen mit 250 & mgr; l vorgewärmtem komplettem Medium. In 250uL vorerhitzt Komplettmedium in jede der drei Vertiefungen. Inkubieren des Objektträgers in einer befeuchteten, 5% CO ₂ -Atmosphäre Inkubator bei 37 ° C für 1 h.
   5. Pipette über das Medium aus jedem der fünf Vertiefungen und wasche die Zellen mit 250 & mgr; l PBS. Fügen Sie 250 ul der Fixier-Lösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Folie bei RT für 10 min.
   6. Pipette aus der Fixier-Lösung aus jeder Vertiefung und waschen Sie die Zellen mit 250 & mgr; l PBS. In 250 ul PBS, das 5% Rinderserumalbumin (BSA) Blocking-Lösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Folie bei RT für 1 h.
   7. Verdünne 10 & mgr; l von GnRH-IR primären Antikörper in 1 ml PBS (1: 100-Verhältnis). Halten Sie es bei RT und verwenden Sie es innerhalb von wenigen Stunden.
   8. Pipette aus der BSA Blocking-Lösung aus jeder Vertiefung mit Ausnahme der Negativkontrolle (erste gut). Waschen Sie die Zellen mit 250 & mgr; l PBS (mit Ausnahme der negativen Kontrollvertiefung). In 250 ul PBS, die GnRH-IR primäre in Schritt 2.2.7 in eac vorbereitet Antikörperh gut (mit Ausnahme der Negativkontrolle). Inkubieren Sie die Folie bei RT für 1 h in einem dunklen Ort.
   9. Verdünne 2,5 & mgr; l Alexa 546 markierten sekundären Antikörper in 1,25 ml PBS (1: 500-Verhältnis).
      HINWEIS: Diese Lösung sollte vor Licht geschützt werden, ist es bei RT halten und es innerhalb weniger Stunden verbrauchen.
   10. Pipette aus Lösungen von jedem der fünf Brunnen und waschen Sie die Zellen mit 250 ul PBS. In 250 ul PBS, das AF-546 markierten Sekundär in Schritt hergestellten Antikörper 2.2.9 in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Folie bei RT für 1 h in Dunkelheit.
   11. Pipette aus der Lösung aus jeder Vertiefung und waschen Sie die Zellen mit 250 ul PBS. In 250 ul PBS, das 5 uM Fluoreszenzsonde Lösung, hergestellt in Schritt 1.14 in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Folie für 10 min bei RT.
   12. Pipette aus der Fluoreszenzsonde Lösung aus jeder Vertiefung und waschen Sie die zweimal Zellen mit 250 & mgr; l PBS vorsichtig. 3-4 Tropfen Eindeckmittel in jede Vertiefung, danach. Halten Sie die Folie in dunklenbei RT bis zur mikroskopischen Abbildung.
3. Imaging
   1. Bild die Zellen durch invertierten konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (mit 63X -Ölimmersionsobjektiv)
      1. Verwenden Sie die folgenden Anregungs- / Emissionswellenlängen. GnRH-Konjugate: 488/514 nm, Alexa 546 markierte Antikörper: 488/546 nm (Verwendung nur für die GnRH-IR-Expression-Methode), DRAQ5 Fluoreszenzsonde: 633/680 nm.
      2. Stellen Sie die Bildparameter, die negativen Kontrollzellen verwendet wird. Verwenden Sie diese Parameter zu Bild behandelten Zellen (Abbildung 3). Nachjustieren Abbildungsparameter auf jedem Objektträger zu Beginn der Analyse. Feinabstimmung und Export von Bildern mit der Software, die vom Hersteller zur Verfügung gestellt, wenn nötig.

3. Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)

1. GnRH Quantifizierungsmethode
   1. Nehmen Sie die Platte in Stufe 1.8 und Pipette aus dem vollständigen Medium von each der sieben Brunnen. 1 ml vorgewärmten Komplettmedium in den ersten gut. Verwenden Sie diese als negative Kontrolle. 1 ml jeder der sechs vorgewärmten Medien (3 Vertiefungen mit 1 & mgr; M und 3 Vertiefungen mit 10 & mgr; M) in den nächsten sechs Vertiefungen behandeln. Inkubieren der Platte in einer befeuchteten, 5% CO ₂ -Atmosphäre Inkubator bei 37 ° C für 5 h.
   2. Pipettieren Sie das Medium aus jedem Well. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 2 ml PBS vorsichtig. Fügen Sie 500 ul von Trypsin-EDTA-Lösung in den einzelnen Wells. Inkubieren der Platte bei 37 ° C, bis die Zellen zu lösen (etwa 10 min).
   3. 1 ml komplettes Medium in jedem Well Trypsin zu stoppen. Schütteln Sie die Platte. Suspend die Zellen vorsichtig mit einer Pipette, und übertragen Sie die Suspension aus jeder Vertiefung in FACS-Röhrchen. Zentrifugiere die Röhrchen bei 150 xg für 4 min, bei 4 ° C.
   4. Gießen Sie die Überstände vorsichtig heraus, mit einem Zug. In 500 ul eiskaltem PBS in jedes Röhrchen FACS und die Zellen vorsichtig wieder auszusetzen. Halten Sie die Röhrchen auf Eis bis zum Endedes Experiments.
2. Analyse und Berechnung
   1. Analysieren Sie die Zellen mittels Durchflusszytometrie. Zur Anregung verwenden 488 nm Argon-Laser-Wellenlänge und für die Detektion 530 nm Wellenlänge verwenden. Stellen Sie den Durchflusszytometer Parameter nach oben durch die negativen Kontrollzellen ausgeführt wird. Verwenden Sie diese Parameter zu behandelten Zellen (4A) zu analysieren. Werten Sie die Daten mit der Software des Herstellers bestimmen mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) Werte und berechnen die relativen MFI-Werte.

Results

Bilder von konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) bieten spektakuläre Informationen über die Aufnahme von GnRH-FITC-Konjugate auf der gegebenen Zellkultur in einer Zeit und konzentrationsabhängig. Parallel zu diesen GnRH-FITC-Konjugaten ist die Anwesenheit des GnRH-IR von der Zelloberfläche auch überprüfbare durch die CLSM Experiment. Weiterhin kann durch eine weit rote Färbung DNA Fluoreszenzsonde verwendet wird, ist es möglich, die Kerne von Zellen neben GnRH und GnRH-IR zur Gege...

Discussion

Hierin beschriebenen Experimente selektiv markierten GnRH-Analoga für das Screening adhärenten verwenden Zellkulturen in vitro. Konfokaler Mikroskopie und Durchflusszytometrie Methoden geeignet sind zum Verfolgen und Quantifizierung der zellulären Aufnahme dieser GnRH-FITC-Konjugate in einer zeit- und konzentrationsabhängigen Art und Weise. Diese Experimente haben die folgenden kritischen Schritte: 1) halten eine sterile, gesunde Zellkultur; 2) GnRH Peptide müssen von hoher Qualität sein; 3) angemess...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
EBC-1	JCRB Cell Bank	JCRB0820	Plattenepithelkarzinom der menschlichen Lunge
BxPC-3	ATCC	CRL-1687	Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse
Detroit-562	ATCC	CCL-138	Pharynxkarzinom beim Menschen
RPMI-1640 Medium mit L-Glutamin	Lonza	BE12-702F	Kulturmedium für BxPC-3-Zellen
Eagle's Minimum Essential Medium	Lonza	BE12-611F	Kulturmedium für EBC-1-Zellen und ergänzt mit 0,1 % Natriumpyruvat für Detroit-562-Zellen
Fötales Rinderserum	Euro Klon	ECS0180L	Ergänzt das Kulturmedium
MycoZap Plus-CL	Lonza	VZA-2012	Ergänzt das Kulturmedium (Antibiotika)
Standardlinien-Zellkulturflaschen	VWR	10062-872	Bieten eine konsistente, sterile Wachstumsumgebung für Zellen
Trypsin-EDTA-Mischung	Lonza	BE17-161E	Anhaftende Zellen entfernen
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Lonza	BE17-516F	Lösungsmittel
Dimethylsulfoxid	Sigma-Aldrich	D8418-100ML	Lösungsmittel
Trypanblau-Lösung, 0,4	Thermo Fisher Scientific	15250061	Wird zum Zählen von Zellen
verwendet[D-Lys6(FITC)]-GnRH-I	von uns	-	Reinheit ≥ 98% (HPLC)
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-II	aus		uns-Reinheit ≥ 98% (HPLC)
[Lys8(FITC)]-GnRH-III	hergestellt von		uns-Reinheit ≥ 98% (HPLC)
Glasboden 8-Well-Objektträger	Ibidi	80826	Verwendung im CLSM-Experiment
Corning Costar Zellkulturplatte, 12 Well	Sigma-Aldrich	CLS3513-50EA	Verwendung im FACS-Experiment
Fixierlösung (10% neutral gepuffertes Formalin)	Bio-Optica	01V60P	Fixieren adhärente Zellen
Rinderserumalbumin	Sigma-Aldrich	A7906-10G	Verhindern Sie die unspezifische Bindung der Antikörper
GnRHR-Antikörper	Proteintech	19950-1-AP	Immunzytochemie-Reagenz, binden Sie an die menschlichen Typ-I-GnRH-Rezeptoren
Sekundärer Antikörper, Alexa Fluor 546-Konjugat	Thermo Fisher Scientific	A11035	Immunzytochemisches Reagenz, binden Sie an den primären Antikörper
Fluoreszenzsondenlösung (Draq5)	Thermo Fisher Scientific	62254	Gegenfärbung von Zellkernen
Fluoromount Wässriges Eindeckmedium	Sigma-Aldrich	F4680-25ML	Verwendung im CLSM-Experiment, Erhaltung der Fluoreszenz
Inverses Mikroskop	Elektro-Optika Ltd.	Alpha XDS-2T	Überprüfung des Phänotyps und der Konfluenz von Zellkulturen
Inverses konfokales Laser-Scanning-Mikroskop	Zeiss	LSM-710	Verwendung im CLSM-Experiment
Durchflusszytometer	BD Biosciences	BD FACSCalibur	Verwendung im FACS-Experiment