Methodenartikel

Vorbereitung und In Vitro Charakterisierung von Magnetized miR-modifizierten Endothelzellen

DOI:

10.3791/55567

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2. Mai 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, University of Rostock, 2Physikalisch-Technische Bundesanstalt, 3Department of Radiology and Neuroradiology, Ernst-Moritz-Arndt-University Greifswald, 4Electron Microscopy Center, University of Rostock

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Manuskript beschreibt die effiziente, nicht-virale Abgabe von miR-Zellen durch einen PEI / MNP-Vektor und ihre Magnetisierung an Endothelzellen. Somit kann zusätzlich zu genetischer Veränderung, ermöglicht dieser Ansatz für die magnetische Zellführung und MRI Nachweisbarkeit. Die Technik kann verwendet werden, um die Eigenschaften von therapeutischen Zellprodukten zu verbessern.

Zusammenfassung

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Bis heute sind die verfügbaren chirurgischen und pharmakologischen Behandlungen für Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD) sind begrenzt und oft palliativ. Zur gleichen Zeit, Gen- und Zelltherapien sind vielversprechende alternative Ansätze für eine CVD-Behandlung. Allerdings ist die breite klinische Anwendung der Gentherapie durch den Mangel an geeigneten Genabgabesysteme stark eingeschränkt. Die Entwicklung geeigneter Genübertragungsvektoren können, eine Lösung für die aktuellen Herausforderungen in der Zelltherapie bereitzustellen. Insbesondere bestehende Nachteile, wie begrenzte Effizienz und niedrige Zelleinlagerungen im Organe verletzt, konnte durch entsprechendes Zell - Engineering (dh genetische) vor der Transplantation überwunden werden. Das dargestellte Protokoll beschreibt die effiziente und sichere vorübergehende Modifikation von Endothelzellen ein Polyethylenimin superparamagnetischen Nanopartikel (PEI / MNP) -basierten Auslieferungsvektor verwendet wird. Außerdem werden der Algorithmus und Methoden zur Zellcharakterisierung definiert. Die erfolgreiche intracelluLAR Lieferung von microRNA (du) in menschliche Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs) hat, ohne die Lebensfähigkeit der Zellen zu beeinflussen, Funktionalität oder die interzelluläre Kommunikation erzielt worden. Darüber hinaus wurde dieser Ansatz eine starke funktionelle Wirkung in eingeführten exogen ich verursachen unter Beweis gestellt. Wichtig ist, gewährleistet die Anwendung dieser MNP-basierte Vektorzelle Magnetisierung, mit Möglichkeiten des magnetischen Ausrichtung und nicht-invasiven MRI-Tracing begleitet. Dies kann eine Grundlage für die magnetisch geführt wird, gentechnisch hergestellten Zelltherapeutika bereitzustellen, die nicht-invasiv mit MRI überwacht werden kann.

Einleitung

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Gen- und Zelltherapie sind leistungsfähige Werkzeuge, die das Potenzial haben, um die aktuellen Herausforderungen in CVD-Behandlung zu lösen. Trotz der Tatsache , dass diese beiden Ansätze derzeit in klinischen Studien getestet werden, sind sie noch nicht bereit für eine breite klinische Anwendung 1. Bemerkenswert ist, ein gemeinsames Konzept für die Herausforderungen der Gen- und Zelltherapie zu bekämpfen ist multifunktional Genabgabevektoren geeignet für die klinische Anwendung zu entwickeln. Der Mangel an sicheren und effizienten Genabgabesysteme ist das Hauptanliegen der Gentherapie. Zur gleichen Zeit, die gentechnische Veränderung von Zellprodukten vor der Transplantation konnte die schweren Herausforderungen der Zelltherapie, wie geringe Effizienz (zB im Herzfeld, nur ca. 5% der funktionellen Verbesserung erreichte nach Stammzelltransplantation überwunden 1 ) und schlechte Retention / Verpflanzung an der Stelle der Verletzung (dh fällt Zellbindung unter von 5 bis 10% innerhalb von Minuten bis Stunden post-Anwendung, unabhängig vom Applikationsweg 2, 3, 4).

Bisher überschreiten virale Vektoren stark nicht-virale Systeme in Bezug auf Effizienz, die in ihrer breiteren Anwendung in klinischen Studien (~ 67%) 5 geführt hat. Allerdings trägt virales Vehikel ernsthafte Risiken, wie Immunogenität (und die nachfolgende Entzündungsreaktion mit schweren Komplikationen), Onkogenizität und Einschränkungen in der Größe des durch genetische Material 6. Aufgrund dieser Sicherheitsbedenken und die hohen Kosten der Produktion viraler Vektor, ist die Verwendung von nicht-viralen Systemen bevorzugt in bestimmten Fällen 7, 8. Es ist besonders geeignet für Erkrankungen , die transient genetische Korrektur, wie beispielsweise die Expression von Wachstumsfaktoren erfordern Steuerung der Angiogenese (zB für die CVD - Behandlung) oder die delivery von Impfstoffen.

In unserer Gruppe wurde ein Abgabesystem durch die Kombination von verzweigtem 25 kDa-Polyethylenimin (PEI) und superparamagnetische Eisenoxid - Nanopartikel (MNP) miteinander verbunden ist durch Biotin-Streptavidin - Wechselwirkung 9 ausgelegt. Dieser Vektor ist ein mögliches Instrument für die gentechnische Veränderung von Zellen, so dass für ihre gleichzeitige Magnetisierung vor der Transplantation. Letzteres stellt eine Basis für die magnetische Orientierung / Retention, die heutzutage besonders vielversprechend, da die erweiterte Targeting Techniken erfolgreich 10 entwickelt. Zudem 12 die resultierenden magnetisch ansprechenden Zellen , die das Potential haben , nicht-invasiv durch Magnetresonanztomographie (MRI) oder Magnetic Particle Imaging 11, überwacht zu werden.

Im Fall des PEI / MNP-Vektor, stellt sicher, Polyamin-Kondensations Nukleinsäure- und somit Schutz vor abbauenden Faktor s, Vektor - Internalisierung in Zellen und endosomalen 5 entkommen. Die MNP ergänzen die Eigenschaften von PEI, nicht nur in Bezug auf die magnetische Orientierung, sondern auch durch die bekannte PEI Toxizität reduzieren 7, 13, 14. Zuvor in Bezug auf die Abgabeeffizienz (dh pDNA und miRNA) und Sicherheits PEI / MNP Vektor Eigenschaften wurden eingestellt durch Fibroblasten und humanen mesenchymalen Stammzellen , 15, 16 verwendet wird .

In diesem Manuskript wird ein ausführliches Protokoll zur Anwendung von PEI / MNP zur Erzeugung von miRNA-modifizierten Zellen wird 17 beschrieben. Zu diesem Zweck werden HUVECs verwendet und ein etabliertes Modell für die in - vitro - Angiogenese darstellen. Sie sind schwierig zu transfizieren und sind anfällig für toxische Einflüsse 18, 19,ass = "xref"> 20. Zusätzlich stellen wir einen Algorithmus solche Zellen in vitro zu bewerten, einschließlich ihrer Ausrichtung, die interzelluläre Kommunikation, und MRI - Erkennung.

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Protokoll

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Menschliche Nabelschnur zur Zellisolierung wurde nach der Geburt aus informiert, gesunden Frauen erhalten , die ihre schriftlichen Einwilligung zur Nutzung dieses Materials für die Forschung nach der Deklaration von Helsinki gab. Die Ethikkommission der Universität Rostock hat die vorliegende Studie bestätigt (Reg. Nr A 2011 06, verlängerter 23. September 2013).

1. Herstellung von Transfektionskomplexen

  1. Biotinylierung von Polyethylenimin (PEI).
    1. 400 Umdrehungen pro Minute für 24 h bei Raumtemperatur (RT) und vor Licht geschützt, um eine 0,18 mM-Lösung zu erhalten, - bei 300 auflösen PEI in ultrareinem Wasser unter magnetischem Rühren verzweigt. Lagern Sie die Lösung bei 4 ° C.
    2. Messung der Konzentration von primären Aminogruppen in der erhaltenen Lösung 21, 22.
      1. Verwendung 2% Ninhydrin Reagenzlösung als Amin Nachweisreagenz 23 um 100 & mgr; L PR Mischediluted Probe (1: 200 mit Reinstwasser) und 75 & mgr; l Ninhydrin Reagenz. bei 80 ° C für 30 min inkubieren. Abkühlen lassen und mit 100 & mgr; l 50% Ethanol zur Stabilisierung. Messung der Absorption bei 550 nm auf dem Absorptions-Spektrophotometer.
      2. Erstellen Sie eine Standardkurve mit Glycin.
        1. Bereiten 0,1 M amino-N-Stammlösung (0,75 g Glycin in 100 ml entionisiertem Wasser) und deren Verdünnungen, 1: 1, 1: 5, 1:10 1:20 1:40 1:80, 1: 100, 1: 200 und 1: 400, 1: 600. Messen, diese Lösungen, wie in Schritt 1.1.2.1 und schaffen eine Handlung mit der Konzentration und der Absorption auf den Achsen.
        2. Basierend auf der erhaltenen Handlung und die gemessenen Extinktion der Lösung PEI, definiert die Konzentration der α-Aminogruppen in PEI.
          HINWEIS: Vorsicht. Ninhydrin Reagenzlösung muß ausschließlich unter der Motorhaube verwendet werden und soll unter einer Stickstoffatmosphäre gelagert werden. Es ist nicht verwendbar, wenn die Farbe der Lösung zu Oxidation aufgrund ändert.
    3. Man löst 100 mg des Biotin-Linkers in ultrareinem Wasser unmittelbar vor der Anwendung eine 0,01 mM-Lösung zu erhalten. Berechnen der erforderlichen Menge an Biotin an PEI hinzuzufügen, indem die Konzentration von α-Aminogruppen in PEI Multiplizieren (gemessen in Schritt 1.1.2) von 20, um die erforderliche Menge zu erhalten (in Mol) Biotinylierungsreagenz.
      1. Fügen Sie die Biotin-Lösung auf die PEI-Lösung bei pH 8-9 und Inkubation für 16 h unter magnetischem Rühren bei RT.
    4. Entfernen Sie die nicht umgesetzten Biotin durch Grßenausschlußchromatographie 23. Verwenden im Handel erhältliche Säulen, die ein Gelfiltrationsmedium geeignet für die Reinigung des 25-kDA PEI enthalten, und die Anweisungen des Herstellers. Nehmen Aliquots nach der Reinigung der Aminkonzentration unter Verwendung eines Amins Nachweisreagenz (Schritt 1.1.2) zu messen und die Biotin Konjugationseffizienz (Schritt 1.2.2) zu bestimmen. Lagern Sie die erhaltene biotinylierte PEI bei 4 ° C.
  2. Charakterisierung von biotinyliertem PEI.
    1. Bestimme die Konzentration von α-Aminogruppen in PEI nach der Biotinylierung, wie es in Schritt 1.1.2 beschrieben.
    2. Bestimmen Sie den Grad der PEI Biotinylierung die Konjugationsprozedur zu überprüfen. Zur Quantifizierung Verwenden eines kommerziell erhältlichen Kits, die auf der Anwendung von HABA - Farbstoff (4'-Hydroxyazobenzol-2-carbonsäure) beruht, 24 , um die korrekte kolorimetrische Bestimmung der Biotinylierung Ebenen, 25 zu gewährleisten. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.
  3. Filtration von MNPs und deren Charakterisierung.
    1. Filter kommerziell erhältlichen Streptavidin-beschichteten MNP durch einen 0,45 & mgr; m-Spritzenfilter 16 angetrieben , um größere Aggregate toxische auszuschließen. Messen Sie die endgültige Eisenkonzentration einen Standard photometrischer Test unter Verwendung von 26.
    2. Überprüfen Sie die Qualität der gefilterten MNPs durch Aufnahmedie Magnetisierungskurve und durch TEM - Bildgebung in Übereinstimmung mit Standardprotokollen 27, 28.
      1. Verdünne die MNP-Suspension mit destilliertem Wasser und legen 3 ul der erhaltenen Suspension auf ein 300-Mesh-Kohlenstoff Formvar-beschichtete Kupfergitter für die TEM-Analyse. Anschließend legt dieses Gitter auf einem Glasobjektträger auf einer Heizplatte und trocknen lassen.
      2. Analysieren der Probe mit einem Transmissions - Elektronenmikroskop bei 120 kV und überprüfen den Inhalt elementar einen Röntgendetektor 27 verwendet wird .
  4. 3-farbige Kennzeichnung von Transfektionskomplexen für superauflösende Mikroskopie.
    1. Beschriften 0,5% der gemessenen primären Aminogruppen in PEI mit NHS-Ester-Farbstoff Atto 488 gemäß der Anweisungen des Herstellers. Entfernen des überschüssigen ungebundenen Farbstoff durch Grßenausschlußchromatographie, wie oben (Schritt 1.1.4) beschrieben. Messen Sie die resultierende Konzentration von Aminogruppen unter Verwendung eines Ninhydrin ASSAy (Schritt 1.1.2).
    2. Beschriften im Handel erhältlich verschlüsselten sie (scr-du) mit Cyanine5 Farbstoff mit einem geeigneten Markierungssatz 15 mit (in der Materialliste). Messen Sie die resultierende Fluorophor-Konzentration spektralphotometrisch ich.
    3. Frisch Etikett des MNP jedesmal mit Biotin-konjugierten Farbstoff (zB ATTO 565-Biotin) in einem 1: 1000 w / w - Verhältnis. Direkt um den Farbstoff auftragen , nachdem er während der Bildung der Transfektionskomplexe die MNP zum miR / PEI Zugabe, nach den Angaben in Delyangina et al. 16.

2. Zellpräparation

  1. HUVEC Isolation.
    1. Isolat aus den Zellen der Nabelschnur direkt nach der Korde unter Verwendung Kollagenaseverdau aus dem Inneren des Kords vein erhalten; folgt einem zuvor entwickelten Protokoll 29.
      1. Inkubieren jeder Schnur mit ~ 60 Einheiten / ml Kollagenase Typ IV-Lösung in Puffer - geladen ter Nabelschnurvenen - bei 37 ° C für 13 min.
    2. Für alle Versuche, bündelt die HUVECs von einem Minimum von 5 Patienten.
      HINWEIS: Der Anbau soll nicht mehr als 4-5 Passagen. Verwenden Sie keine Zellen mit Mycoplasmen kontaminiert, da dies eine Verringerung der Transfektionseffizienz verursacht. Mykoplasmen-Kontaminationen sollen getestet werden, bevor das Protokoll unter Verwendung eines PCR-Kits für den hochempfindlichen Nachweis von Mycoplasmen zu starten.
      1. Test auf Mykoplasmen Präsenz.
        1. Zentrifuge 1 ml Zellkulturüberstand für 10 min (13.000 xg). Suspendiere das Pellet in 17 & mgr; l dH 2 O und Sieden (93 ° C) für 3 min. Verwendung 2 ul der Suspension des DNA-Bereich, das für hochkonservierte ribosomalen RNAs (16S-rRNA) verschiedener Mycoplasma Spezies zu amplifizieren.
        2. Durchführen der PCR 10 pmol eines jeden Primers unter Verwendung von (Vorwärtsprimer: 5'-CTGACGACAACCATGCACCATCTGTC-3 '; Rückwärtsprimer: 5'-GAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAG-3') in kammination mit einem handelsüblichen PCR-Kit unter den folgenden Bedingungen: 94 ° C für 3 min; 45 Zyklen von 94 ° C für 30 s, 50 ° C für 30 s und 72 ° C für 30 s; und eine abschließende Extension bei 72 ° C für 10 min.
        3. Analysieren des PCR-Produkts (292 bp) unter Verwendung von Agarose-Gelelektrophorese.
    3. Entweder speichert die erhaltenen Zellen langfristig in flüssigem Stickstoff oder Kultur sie in der endothelialen Wachstumsmedium , ergänzt mit 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre , enthaltend ed 5% CO 2.
  2. HUVEC Charakterisierung.
    1. Charakterisieren isoliert HUVECs im Hinblick auf ihre Funktionsfähigkeit Röhren in der Basalmembran - Matrix zu bauen ( zum Beispiel Matrigel) und deren Expression des endothelialen Marker CD31 (platelet endothelial cell adhesion molecule, PECAM-1) nach Standardprotokollen 30, 31.

3. Transfection

  1. Trypsiniere den Bestand HUVEC Kultur (siehe Schritt 4.1.2.) Und die Zellen manuell eine Haemocytometerzählung verwenden. Saatgut die HUVECs auf Kunststoff - Zellkulturplatten gut geeigneter Größe, mit einer Ausgangszelldichte von etwa 13.000 Zellen / cm 2 von Wachstumsoberfläche, 48 h vor der Transfektion , bis 70-80% Konfluenz erreicht wird.
  2. Bereiten Sie frische miR / PEI / MNP-Komplexe jedes Mal.
    HINWEIS: Zuerst ich / PEI-Komplexe sollen (3.2.1 Schritte - 3.2.3) erhalten werden; Anschließend MNP sollte den ihn / PEI-Lösung (Schritt 3.2.4), um die endgültige ich / PEI / MNP-Formulierung zur Transfektion (Schritt 3.3) verwendet, erhalten zugesetzt werden.
    1. Berechnen die Menge der entsprechend im Handel erhältlich ich (verwürfelt, getaggt oder funktionelle, siehe Schritt 4), um die Konzentration der vom Hersteller gelieferten Lager verwenden. Verwenden von 2,5 pmol ich / cm 2 der Zellwachstumsoberfläche. Verdünnen Sie die ich in 5% Glucose-Lösung obtain eine Endkonzentration von 0,125 pmol von miR / & mgr; L.
    2. Basierend auf der Menge von miR Schritt 3.2.1 und dem optimalen Verhältnis von 25 NP 32, die Berechnung der erforderlichen Menge an PEI - Konzentration unter Verwendung seiner gemessenen (Schritt 1.1.2). Verdünne das PEI (je die berechnete erforderliche Volumen) in einem gleichen Volumen von 5% iger Glucoselösung. Fügen Sie die erhaltenen vorverdünnt PEI auf die miR-Lösung (aus Schritt 3.2.1) und Vortex der erhaltenen Mischung für 30 s.
    3. Inkubieren des erhaltenen miR / PEI-Gemisch für 30 min bei RT.
    4. Beschallen der MNP bei 35 kHz für mindestens 20 min in dem Beschallen Wasserbad (siehe die Materialliste) bei RT, fügt die entsprechende Menge an MNP Lösung des ich / PEI (5-25 & mgr; g Eisen / ml hergestellt ich / PEI / MNP Mischung 16), Vortex für 30 s und 30 min bei RT , bis sie bereit inkubiert.
  3. Fügen Sie die vorbereiten ich / PEI / MNP Mischung tropfenweise direkt zu dem Kulturmedium auf den Zellen. Verwenden der resultierenden Mischung von Zell culture Medium mit miR / PEI / MNP in Glucose als Transfektionslösung verdünnt. Ersetzen Sie diese Mischung mit frischem Kulturmedium 6 h nach der Transfektion.

4. Analyse von Vector Sicherheit

  1. Prüfung der Lebensfähigkeit der Zellen.
    1. Transfizieren der HUVECs ausgesät in einer 24-Well-Kulturplatte (Schritte 3.1 und 3.2); verwenden Cy3-mich wie die Testsonden und verwürfelte mich (scr-dich) als die Steuer Gating-Sonden für die Durchflusszytometrie. Bei 37 ° C inkubieren in einer befeuchteten Atmosphäre , enthaltend ed 5% CO 2 für 24 h.
    2. Sammeln Sie den Überstand und die transfizierten Zellen durch Trypsinisierung unter Verwendung von 1x Trypsin-EDTA verdünnt in PBS bei 37 ° C zu den Zellen für 4 min hinzugegeben. Zentrifuge bei 300 × g für 10 min und die Verwendung für die Analyse.
    3. Untersuchen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen und ich Aufnahmeeffizienz von 24 Stunden nach der Transfektion unter Verwendung von Durchflusszytometrie mit einem handelsüblichen Fleck Anwendung zwischen Wohn- / toten Zellen zu unterscheiden; Verwendung von Standardprotokollen 15 . Bewerben untransfizierten Zellen als positive Kontrolle für die Lebensfähigkeit.
  2. Untersuche die Sicherheit der ich / PEI / MNP-Komplexe für Zellen in funktionellen Assays.
    1. Bewerten Sie die Proliferationsaktivität von transfizierten Zellen.
      1. Transfizieren HUVECs ausgesät in einer 12-Well - Kulturplatte (Schritte 3.1 und 3.2) mit funktioneller Antisense ich (zB anti-miR92a für HUVECs 31) und Inkubation bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre fi ed , die 5% CO 2 für 24 h.
      2. Verwenden eines kommerziell erhältlichen Kits, die Anzahl der proliferierenden Zellen zu definieren, indem sie mit EdU Anfärben (5-ethinyl-2'-desoxyuridin) und das Scannen mit laserbasierten konfokalen Mikroskopie. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen Mikroskopie: 40X-Objektiv mit Ölkapselung; 633-nm-Anregungslaser (für einen 647-nm-Farbstoff); 5 Zufallsfelder in jeder Probe aufgezeichnet werden. Berechnen der Rate der proliferierenden Zellen durch die Anzahl der EDU-gefärbten Zellkernen durch die Gesamtkeimzahl dividiert (Hoechst-gefärbt).
    2. Evaluieren der Fähigkeit der transfizierten Zellen schlauchartige Strukturen zu bilden, wie zuvor beschrieben , 17, 31.
      1. Transfizieren die HUVECs ausgesät in einer 24-Well - Kulturplatte (Schritte 3.1 und 3.2) mit scr-ich und Inkubation für 48 h bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre , enthaltend ed 5% CO 2. Sammelt die transfizierten Zellen (wie in Schritt 4.1.1).
      2. Seed 3,5 x 10 4 von modifizierten HUVECs in 24-Well - Platten , beschichtet mit 140 & mgr; l von Basalmembran - Matrix. Bei 37 ° C für 18 h Inkubieren in einer befeuchteten Atmosphäre , enthaltend ed 5% CO 2.
      3. mit ImageJ Software mit dem „Angiogenesis Analyzer“ Plugin Record Bilder von 10 zufälligen Feldern in jeder Vertiefung unter Verwendung von Laser-Scanning-Konfokalmikroskopie (Differential-Interferenz-Kontrast) und analysieren. Umfassen solche Parameter wie die Gesamtlänge der Äste, die Anzahl der Verzweigungen und die Anzahl der junctions in der Auswertung. Vergleichen Sie dies mit der unbehandelten Kontrolle.
  3. Untersuche den möglichen toxischen Einflusses von Transfektionskomplexen auf gap junction (GJ) -vermittelten interzelluläre Kommunikation (GJIC) durch Testen 3D fluorescence recovery nach (FRAP) 33 in 3D Photobleaching.
    1. Pflanzensamen, die Zellen auf mit Gelatine beschichteten Glasobjektträgern mit einem dünnen Boden geeignet für Bildgebung lebender Zellen (Ölkapselung). Transfizieren der Zellen wie in Schritt 3.2 mit nicht-markierte, nicht-funktional ich (scr-ich) und Inkubation für 24 h oben beschrieben.
    2. Bereiten Sie die Zellen für die Abbildung, indem sie mit Calcein unmittelbar vor der Mikroskopie zu laden. Insbesondere ersetzt das Kulturmedium durch frisches Medium, 5 & mgr; M Calcein enthält, Inkubieren für 20 Minuten, Waschen mit PBS und frischem Kulturmedium hinzuzufügen. Vorwärmen des Inkubators des Mikroskops auf 37 ° C und die CO 2 -Konzentration auf 5% einzustellen.
      HINWEIS: Alle Reagenzien sollten warm Zelle contrac zu vermeidention vor der Messung.
    3. Verwenden, um einen 561-nm-Anregungslaser für Zell Visualisierung und das FRAP Experiment. Zuerst manuell auswählen Zellen für die Messung als Bereiche von Interesse (ROI); Prüfzellen sollte mindestens 3 benachbarte Zellen haben. Definieren eine Referenzzelle mit heller, stabiler Fluoreszenz, die nicht gebleicht werden. Definieren die Grenzen eines z-Stack. Aufzeichnung der Fluoreszenz von der Oberseite der Zellen auf dem Boden 10 umfassen - 15 Schichten.
    4. Bleichmittel Bleichmittel, die Testzellen mit 100% Laserleistung und die anschließenden Aufzeichnung fluorescence recovery (aufgrund GJ spezifische Farbstoffübertragung von benachbarten Zellen) während der folgenden 15 min. Notieren Sie die Rohdaten in den z-Stapel alle 60 s. Insgesamt führt die FRAP Messungen mit nicht weniger als von 5 bis 10 Testzellen pro Experiment. Vergleichen Sie die Ergebnisse auf untransfizierten Zellen.

5. Prüfung von Transfektionseffizienz

  1. Prüfung von miR-Aufnahme.
    1. Bereiten Sie die Sonden wie in Ste beschriebenp 4.1 und nutzen sie gleichzeitig ich-Aufnahme mit Durchflusszytometrie zu definieren.
  2. Bestätigen und beschreiben, um die intrazelluläre Lokalisation von Transfektionskomplexen durch konfokale und Hochauflösungs-strukturierte Beleuchtung Mikroskopie (SIM).
    1. Saatgut die HUVECs auf mit Gelatine beschichteten Glasplättchen gelegt in den Vertiefungen von 24-Well-Kulturplatten, wie zuvor beschrieben (Schritt 3.1). Transfizieren der Zellen mit 3-Farben beschriftet miR / PEI / MNP (Schritt 1.4) und Inkubation für 24 h bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre , enthaltend ed 5% CO 2.
    2. Waschen Sie die Deckgläser zuerst mit 2% Rinderserumalbumin (BSA) in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) und dann mit nur PBS. Fix - Zellen durch 16 in 4% Paraformaldehyd (PFA) bei 37 ° C für 15 min und Fleckenkerne mit DAPI nach Standardprotokollen inkubierte. 3 x waschen auf dem Schüttler (jeweils 15 min) überschüssigen Farbstoff zu entfernen.
      HINWEIS: PFA ist krebserregend und müssen sorgfältig behandelt werden.
    3. Legen Sie die prepared Deckgläser auf Objektträger unter Verwendung von geeigneten Befestigungsmedien, trocknen lassen für mindestens 1 h, und verwenden sie für die Mikroskopie, wie unten beschrieben.
    4. Acquire Bilder eines 63X Ölimmersionsobjektiv und die folgenden SIM-Einstellungen: 405-, 488-, 561- und 633-nm-Laserlinien für die Anregung; Z-Stapel-Modus mit einer 32-Bit-Tiefe bei 5 Winkeln, 5 Phasen, mit Mitteln von 4; G2-Gitter 405 mit einer Laserlinie, G3 mit 488, G4 mit einem 561 und G5 mit einem 633.
  3. Bewerten Sie die Funktionalität des gelieferten ich von RT-qPCR in ich / PEI / MNP-HUVECs im Vergleich zu unbehandelten.
    1. Transfizieren die HUVECs ausgesät in einem 12-Well - Kulturplatte Schritten (3.1 und 3.2) mit funktioneller Antisense mich (zB anti-miR92a für HUVECs 31) und Inkubation für 48 h bei 37 ° C in einer befeuchteten ed Atmosphäre mit 5% CO 2.
    2. Bewerten Sie die anti-miR92a Lieferung und Verarbeitung mit RT-qPCR im Handel erhältlichen Kits (die Materialien sehen); folgen ter Anweisungen des Herstellers, wie an anderer Stelle 17, 31 beschrieben. Parallel dazu untersucht , die Expression des Zielgens (zB ITGA5 31).
      HINWEIS: Antagomir Lieferung gegen endogen ich ist ahmt bevorzugt über, da sie die Messung der tatsächlichen Ergebnisse des ich gewährleistet und nicht nur seine intrazelluläre Akkumulation.

6. Zellbeurteilung und Targeting-Magnetzellseparation

  1. Zelle unter statischen Bedingungen in vitro - Targeting.
    1. Transfizieren den HUVECs in einer 24-Well - Platte (2,5 pmol / cm 2 scr-ich, NP 25 und 15-25 & mgr; g / mL MNP), inkubiere für 24 h, waschen und sammeln , wie oben (Schritt 4) beschrieben.
    2. Mischen Sie die erhaltene Zellpellet aus 1 und mit 1 ml frischem Kulturmedium und sie in den Vertiefungen einer 12-Well-Platte. Fix einen kleinen Magnet vor Ort (an der Seite) an der Unterseite der Platte mit Klebeband.
    3. Inkubieren die Zellsuspension für 24 h und die Zellanheftung und das Wachstum in dem Bereich über den Magneten beobachten und in der Umgebung ohne einen Magneten. Für eine qualitative Bewertung, die ein herkömmliches inverses Mikroskop verwenden.
  2. Zelle in simulierten dynamischen Bedingungen in vitro - Targeting.
    1. Transfizieren den HUVECs in einer 24-Well - Platte pro Schritte 3.1 und 3.2 (2,5 pmol / cm 2 Cy3-ich, 25 NP, und 15 bis 25 & mgr; g / mL MNP), inkubiere für 24 h, Waschen, und sammelt durch Trypsinisierung unter Verwendung von 1x Trypsin-EDTA in PBS verdünnt, hinzugefügt, um die Zellen für 4 min bei 37 ° C. Zentrifuge bei 300 × g für 10 min.
    2. Mischen Sie die erhaltene Zellpellet aus 1 und mit 1 ml frischem Kulturmedium und es in der Vertiefung einer 12-Well-Platte. Fix einen kleinen Magnet lokal (auf der Seite eines gut) unter Verwendung von Klebeband. Platzieren der Kulturplatte auf dem Schüttler und Inkubieren der Zellsuspension für 12 h bei 150 Umdrehungen pro Minute 34 dynamischen Bedingungen zu simulieren.
    3. Waschen Sie die Zellen und behebensie mit 4% PFA. Beflecken die Kerne mit DAPI 16. Zeichnen Sie die Zellanheftung mittels Laser-Scanning-konfokale Mikroskopie mit einem 514-nm-Anregungslaser, z-Stapelmodus (5-12 slices) Rohdaten zu erhalten, und die maximale Projektionsbildintensitätsverarbeitung, um Bilder für die Analyse zu erstellen.
  3. Quantitative Analyse von magnetisch ansprechenden und nicht-ansprechenden Zellen.
    1. Transfizieren den HUVECs in einer 24-Well - Platte (2,5 pmol / cm 2 scr-du, NP 25 und 15-25 & mgr; g / mL MNP), inkubiere für 24 h, waschen und sammeln , wie zuvor beschrieben (Schritt 6.2.1) . Vorwärmen PBS und Zellsortierungspuffer (sterilfiltriert, siehe die Materialliste) bis 37 ° C. Resuspendieren des Zellpellets aus jeder Vertiefung mit 500 ul Zellsortierungspuffer erhalten.
    2. Anwenden dieser Zellsuspension auf ein magnetisches Sortierspalten durch die zugeführte Magneten befestigt, wäscht die Säulen auf den Magneten 3-mal mit frischem Zellsortierungspuffer und Sammeln des Durchflusses als magnetinisch nicht reagierenden Fraktion (MAG-).
    3. Entfernen Sie die Spalten aus dem Magneten und sofort sammeln, um die magnetisch ansprechenden Zellfraktion (MAG +) durch Drücken frischen Zellsortierungspuffer durch die Säule unter Verwendung eines Kolbens.
    4. Zentrifuge sowohl MAG- und MAG + bei 300 xg für 10 min. Das Zellpellet in PBS resuspendieren, zähle die Zellen und die Lebensfähigkeit der Zellen mit einem blauen Trypan Ausschluss - Assay 35 auszuwerten. Verwenden des erhaltenen Zellpellet entweder zur Langzeitanalyse (dh Wieder Samen und bewerten nach 24, 48 und 72 h in Kultur 17) oder direkt für die Durchflusszytometrie (Schritt 4.1.).
  4. Definiert die Eisenbeladung der transfizierten Zellen.
    HINWEIS: Während der Vorbereitung, jeder Kontakt der Zellsonden mit Eisenoxidmaterialien und Instrumenten muss vermieden werden.
    1. Sammle die transfizierte HUVECs und untransfizierten Kontrolle (wie in Schritt 4.1.1). Waschen Sie die gesammelten Zellen zweimal in 2% BSA in PBS 36 b y sorgfältig die Zellen mit 1 ml dieser Waschpuffer gemischt und dann bei 300 xg für 10 min zentrifugiert. Re-suspendieren des erhaltenen Zellpellet in 250 uL PBS, 100 ul 4% PFA, und inkubiere für 20 min Zellen zu fixieren. Waschen 3 mal mit PBS, wie oben beschrieben.
    2. die resultierende feste Zellpellet in 110 ul PBS und überträgt es auf 100 & mgr; l-PCR-Röhrchen resuspendieren.
      1. Nimm 10 & mgr; l-Aliquote für die Zellzählung und verwenden, um die restliche Probe für die Magnetpulverspektroskopie (MPS).
    3. Führen Sie die Messung auf einem handelsüblichen MPS-Gerät. Während der Messung gelten die folgenden Einstellungen: Magnetfeld B = 25 mT Antrieb und Frequenz f 0 = 25 kHz. Für Eisen Quantifizierung der Proben, normalisieren die dritten Harmonischen A 3 des MPS-Spektrums zu der entsprechenden A 3, ref eines MNP Referenzprobe mit einer bekannten Eisenmenge von 2,1 & mgr; gxref "> 37. Verwenden unbehandelte Zellen als Kontrolle.

7. Definieren von MRI Nachweisgrenzen

  1. Zellpräparation.
    1. Seed HUVECs in einer 6-Well - Platte und transfizieren (2,5 pmol / cm 2 scr-dich, NP 25 und 15 bis 25 & mgr; g / mL MNP) in Duplikaten oder Triplikaten in Übereinstimmung mit der erforderlichen Menge an Zellen (für Phantom Vorbereitung). Inkubieren der Zellen für 24 h und waschen, sammeln, und fixieren sie mit 4% PFA, wie zuvor beschrieben (Schritt 4).
    2. Zählen Sie die Zellen erhalten, bereiten Aliquots mit entsprechender Zellzahl (beispielsweise 10 3, 10 4, 10 5, etc.) und stellen ihr Volumen auf 50 & mgr; l.
  2. Agarose phantom Vorbereitung
    1. Vorbereiten mehrere Schichten von 2% Agarose in 50-ml - Röhrchen mit unterschiedlichen Mengen an transfizierter zwischen den Schichten 38 eingebetteten Zellen. Während der Zubereitung, beschallte Material und die heiße Agarose Zentrifuge 38Luftblasen zerstören, die Artefakte verursachen.
      HINWEIS: Wichtig ist , Phantome 5,5 x 10 5 HUVECs , behandelten mit nicht-magnetisch ich / PEI - Komplexen enthalten , sollten in der gleichen Weise hergestellt werden , um als Kontrollen zu dienen.
  3. Abtastung , die die in vitro erhaltenen Phantomen mit einem 7,1 T Tiere MRI System nach der Phantom zentral in der Spule platziert, parallel zur z-Achse des Magnetfeldes.
    1. Gelten die folgenden Sequenzparameter für einen Gradienten-Echo-Sequenz Erfassung: TR = 66 ms; TE1 / 2 TE / TE 3/4 TE / TE 5 / TE = 1.44 6 / 2,88 / 4,51 / 6,11 / 7,60 / 9,01 ms; Flipwinkel = 3º; Matrix = 128 × 128, interpoliert auf 256 x 256; Sichtfeld = 42 mm; 100%; Mittelwert = 1, Echozuglänge = 1; Schichtdicke = 1,5 mm; und 16 Scheiben.
    2. Beurteilung der Signalabfall aller vier Echozeiten berechnen und R2 * Karten (R2 * = 1 / T2 *) unter Verwendung geeigneter Software, wie an anderer Stelle beschrieben 39.

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Ergebnisse

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Der Hauptzweck des vorgeschlagenen Protokolls ist magnetisch ansprechende ich-modifizierten Zellen zu erzeugen , und ihre genaue Charakterisierung (Figur 1) zu leiten. Als Ergebnis sollten effizient transfizierten Zellen, die auf magnetische Auswahl und Führung und nachweisbar mit MRI, erhalten werden.

Zunächst wird die Identitäten von isolierten HUVECs wurden durch typische Färbung mit dem endothelialen Marke...

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Diskussion

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Die Herstellung von gentechnisch veränderten Zellen, beladen mit superparamagnetische Nanopartikel für ihre weiteren magnetisch gesteuerte Führung wird in dem aktuellen Protokoll dargestellt. Die erfolgreiche Anwendung dieser Strategie ermöglicht die Auflösung einiger Schwierigkeiten der Zelltherapie, wie geringe Retention und schlechte Einpflanzung in dem verletzten Bereich 2, 3, 4, durch ein anzielbare Zellprodukt zur Transpl...

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Offenlegungen

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Wir haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen offen zu legen.

Danksagungen

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Wir möchten, dass beim Erwerb von TEM-Aufnahmen von gefilterten superparamagnetische Nanopartikel und bei der Durchführung ihrer Röntgenanalyse G. Fulda (Elektronenmikroskopie Zentrum, Universität Rostock, Deutschland) für die technische Unterstützung. Die Arbeit an der RTC Rostock durchgeführt wurde vom Bundesministerium für Bildung und Forschung Deutschland (FKZ 0312138A, FKZ 316159 und VIP + 03VP00241) und dem Staat Mecklenburg-Vorpommern mit EU-Strukturfonds (ESF / IV-WM-B34- unterstützt 0030/10 und ESF / IV-BM-B35-0010 / 12) und von der DFG (DA 1296-1), die Damp-Foundation und der deutschen Herz Foundation (F / 01/12). Frank Wiekhorst wurde von dem EU FP7 Forschungsprogramm "Nanomag" FP7-NMP-2013-LARGE-7 unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
PEI 25 kDaSigma Aldrich408727
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-BiotinThermo Scientific21335
PD-10 EntsalzungssäulenGE Healthcare17085101mit Sephadex G-25 Medium
Ninhydrin Reagenzlösung 2%Sigma Aldrich7285
GlycinSigma Aldrich410225
Pierce Biotin Quantitation KitThermo Scientific28005
Mikroplatten-Reader Modell 680Bio-Rad
Streptavidin MagneSphere Paramagnetische PartikelPromegaZ5481
Millex-HV PVDF FilterMerckSLHV013SL0,45 µ m
Libra 120 TransmissionselektronenmikroskopZeissBeschleunigungsspannung 120  kV
Saphir-RöntgendetektorEDAX-Amatek
Zellkultur-KunststoffTPP
NHS-Esther Atto 565ATTO-TEC GmbHAD 565-31
NHS-Esther Atto 488 ATTO-TEC GmbHAD 488-31
Cy5 miRNA Label IT KitMirus BioMIR 9650
Biotin Atto 565ATTO-TEC GmbHAD 565-71
Kollagen Typ IV GibcoThermo Scientific17104019
Endotheliales Wachstumsmedium, EGM-2LonzaCC-3156 & CC-4176
Penicillin/StreptomycinThermo Scientific15140122100 U/ml, 100 & Mikro; g/mL
MatrigelBD Biosciences356234
Anti-PECAM-1 AntikörperSanta Cruzsc-1506
MS MACS SäulenMiltenyi Biotec  130-042-201
Nahinfrarot-Färbekit für lebende/tote ZellenThermoScientific L10119
Cy3 Farbstoffmarkierte Pre-miR-NegativkontrolleThermo ScientificAM17120"Cy3-miR" oder "Cyanin-miR3" im Manuskript
Pre-miR miRNA-Vorläufermoleküle - Negative Kontrolle Thermo ScientificAM17110"scr-miR" im Manuskript
Anti-has-miR92a-3p synthetischer Inhibitor Thermo ScientificAM10916
LSM 780 ELYRA PS.1-SystemZeiss
ParaformaldehydSigma Aldrich1581274%ige Lösung in PBS
DAPI-KernfärbungThermo ScientificD1306
NucleoSpin RNA-IsolationskitMachery-Nagel740955
mirVana miRNA-IsolationskitThermo ScientificAM1560
TaqMan MicroRNA Reverse TranskriptionskitThermoScientific 4366596
StepOnePlus Real-Time PCR SystemApplied Biosystems
Hochkapazität cDNA Reverse TranskriptionskitThermo Scientific4368814
has-miR-92a TaqMan AssayThermo Scientific000431ausgereifte miRNA-Sequenz: UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU
FastGene Taq FertigmischungNippon GeneticsLS27
ITGA5 TaqMan AssayThermo ScientificHs01547673_m1
RNU6B TaqMan AssayThermo Scientific001093
18S rRNA Endogene KontrolleThermo Scientific4333760F
GelatineSigma AldrichG7041
CellTrace Calcein Red-OrangeThermo ScientificC34851
PBSPan BiotechP04-53500
BSASigma Aldrich
MACS PufferMiltenyi Biotec  130-091-221
AgaroseSigma AldrichA9539
7,1 Tesla MRT-System für TiereBruker CorporationA7906
ImageJ-SoftwareNational Institutes of Healthaufgerüstet mit einem AngiogenesisAnalyzer (NIH)
MPS-GerätBruker Biospin
Matlab-SoftwareMathworks
Ring Neodym Magnet magnets4you GmbHRM-10x04x05-Gø 10 mm; Remaneszenz beträgt ~ 1,3  T, Koerzitivfeldstärke ≥ 955 kA/m
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging KitThermo ScientificC10340
FluorSave ReagenzMerck345789
UltraschallbadBandelin electronicTyp: RK 100 SH

Referenzen

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