Method Article

Struktur-Funktions-Studien in embryonalen Maus-Stammzellen Rekombinase-vermittelten Kassettenaustausch

DOI:

10.3791/55575

⸱

April 27th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University, 2Inflammation Research Center, VIB, 3Center for Medical Genetics, Ghent University Hospital, 4Cancer Research Institute Ghent (CRIG), 5Department of Basic Medical Sciences, Faculty of Medicine and Health Sciences, Ghent University, 6Helmholtz Center for Infection Research, 7Mammalian Functional Genetics Laboratory, Division of Blood Cancers, Australian Centre for Blood Diseases, Department of Clinical Haematology, Monash University and Alfred Health Alfred Centre

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteine ​​enthalten oft mehrere Domänen, die verschiedene zelluläre Funktionen ausüben kann. Gen-Knock-outs (KO) nicht über diese funktionelle Vielfalt berücksichtigen. Hier berichten wir über eine Rekombination vermittelten Kassettenaustausch (RMCE) -basierte Struktur-Funktions-Ansatz in KO embryonalen Stammzellen, die für die molekulare Präparation von verschiedenen funktionellen Domänen oder Varianten eines Proteins ermöglicht.

Abstract

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Gentechnik in Maus-Embryonen oder embryonale Stammzellen (mESCs) ermöglicht die Untersuchung der Funktion eines bestimmten Proteins. Proteine ​​sind die Arbeitspferde der Zelle und bestehen oft aus mehreren funktionellen Domänen, die durch posttranslationale Modifikationen beeinflusst werden kann. Die Verarmung des gesamten Proteins in bedingten oder konstitutiv Knock-out (KO) Mäusen nimmt nicht berücksichtigt diese funktionale Vielfalt und Regulierung. Eine MESC Linie und ein abgeleitetes Mausmodell, in dem eine Andockstelle für FLPe Rekombination vermittelten Kassettenaustausch (RMCE) innerhalb des ROSA26 (R26) Locus eingefügt wurde, wurde bereits berichtet. Hier berichten wir über eine Struktur-Funktions-Ansatz, der für die molekulare Zerlegung der verschiedenen Funktionalitäten eines Multi-Domain Protein ermöglicht. Zu diesem Zweck RMCE-kompatible Mäuse müssen mit KO-Mäusen gekreuzt werden und dann RMCE-kompatibel KO mESCs isoliert werden müssen. Als nächstes kann ein Panel von putativen rescue-Konstrukten in die R26-Locus über RMCE targeti eingeführt werdenng. Die Kandidaten rescue cDNAs kann leicht zwischen RMCE Seiten des Targeting-Vektors unter Verwendung von Rekombinations-Klonierung eingefügt werden. Als nächstes wird KO mESCs mit dem Targeting-Vektor in Kombination transfiziert mit einer FLPe Rekombinase Expressionsplasmid. RMCE reaktiviert die promotorlose Neomycin-Resistenz-Gene in den ROSA26 Andockstellen und ermöglicht die Auswahl des korrekten Targeting-Ereignisses. Auf diese Weise werden hohe Wirkungsgrad Targeting von nahezu 100% erzielt, so dass zum Einsetzen mehrerer putativen rescue Konstrukte in eine halb-hohen Durchsatz Weise. Schließlich kann eine Vielzahl von R26 getriebenen Rettungs Konstrukte auf ihre Fähigkeit getestet werden, um den Phänotyp zu retten, die in Eltern KO mESCs beobachtet wurde. Wir präsentieren eine Proof-of-Principle-Struktur-Wirkungs-Studie in p120 Catenin (p120ctn) KO mESCs mit endoderm Differenzierung in Embryoidkörpern (EVG) als phänotypische Anzeige. Dieser Ansatz ermöglicht die Identifizierung von wichtigen Domänen, putative nachgeschaltete Wege und krankheitsrelevanten PunktMutationen, die KO-Phänotypen für ein bestimmtes Protein zu Grunde liegt.

Introduction

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Es wird geschätzt, dass etwa 20.000 Säugergenomen Protein-kodierenden Gene enthalten. Alternatives Spleißen und posttranslationale Modifikationen erhöhen die Proteinrepertoires. Proteine haben einen modularen Aufbau 1 und häufig mehrere Wechselwirkungsdomänen enthalten, die ihre Einstellung 2 in verschiedene Proteinkomplexe und ihre Beteiligung an mehreren zellulären Prozesse ermöglichen. Ein Beispiel dafür ist das multifunktionale Protein namens p120ctn. p120ctn wird durch das CTNND1 Gen codiert und besteht aus einer großen zentralen Domäne Armadillo - Repeat flankiert von einem N-terminalen und C-terminalen R....

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Protocol

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Alle Versuche an Mäusen wurden nach institutionellen, nationalen und europäischen Tiere Vorschriften durchgeführt.

1. Isolierung von RMCE-kompatibel KO mESCs

  1. Breed heterozygot KO - Mäuse mit RMCE-kompatible Mäuse, wie ROSALUC Mäuse 10 oder ROSA26-iPS - Mäuse 21. Beide RMCE-kompatible Mäuse wurden auf einem Misch 129 / C57BL6 / Swiss Hintergrund gehalten.
    HINWEIS: Kreuzung mit heterozygot KO-Mäusen wird empfohlen, embryonale Letalität in homozygot KO-Mäusen zu überwinden.
  2. Verwenden PCR heterozygot KO - Mäuse wählen 12 eine RMCE Kassette im R26 - Locus enthält.

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Results

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Das Verfahren RMCE-kompatiblen KO MESC Linien zu isolieren , ist in Abbildung 2 dargestellt. Zwei aufeinanderfolgende Züchtungen sind erforderlich RMCE-kompatibel KO Blastozysten zu erhalten. Zunächst werden heterozygot KO-Mäuse mit RMCE-kompatibelen Mäusen gekreuzt RMCE-kompatibel, heterozygot KO-Mäuse zu erhalten. Diese Mäuse werden dann für zeitlich Paarungen mit anderen heterozygot KO-Mäusen verwendet, zu erhalten, 3,5-dpc, RMCE-kompatibel, homozygot KO Blastozysten........

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Discussion

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Unsere MESC Isolationsmethode ist benutzerfreundlich und erfordert keine fortgeschrittenen Fähigkeiten oder Ausrüstung, wie Mikrochirurgie von Blastozysten. Somit ist diese Technologie zu einem großen Teil der wissenschaftlichen Gemeinschaft zugänglich. Jeder, der Grundzellkultur Erfahrung kann ICM Auswüchse propagieren und mESCs Linien etablieren. Allerdings erfordert die Spülung und die Handhabung von Blastozysten etwas Übung. Ein Mundpipette wird verwendet Blastozysten zu übertragen und besteht aus einer Mikropipette.......

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgements

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Wir danken Jinke D'Hont, Frederique Van Rockeghem, Natalie Farla, Kelly Lemeire und Riet De Rycke für ihre hervorragende technische Unterstützung. Wir danken auch Eef Parthoens, Evelien Van Hamme und Amanda Goncalves vom Bioimaging Core Facility des Inflammation Research Center für ihre Unterstützung von Experten. Wir erkennen an Mitglieder unserer Forschungsgruppe für wertvolle Diskussionen. Diese Arbeit wurde von der belgischen Wissenschaftspolitik unterstützt (BELSPO Interuniversitäre Anziehungsschwerpunkte - Preis IAP VII-07 DevRepair; https://devrepair.be), von der Königin Elisabeth-Stiftung für Medizin, Belgien (GSKE 2008-2010; http: // www .fmre-gske.be) u....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ROSALUC Mäuseaus eigenergefrorenes Sperma auf Anfrage
R26-iPSC-Mäuseaus eigenergefrorenes Sperma auf Anfrage erhältlich
GefäßsondeFine Science Tools10160-13zur Überprüfung auf Kopulationspfropfen
M2 MediumSigma-AldrichM7167Aliquots herstellen und bei -20 & deg lagern; C
Feine Pinzette (Dumont #5 Standardspitze Schülerzange)Fine Science Tools11251-10vor Gebrauch mit 70 % EtOH besprühen (nicht autoklavieren)
23 G NadelnFine-ject8697
1-ml-SpritzenSoft-ject6680
60-mm-Platten in Bakterienqualität (zum Spülen) GosselinBB60-01
Mundpipettemade in housesiehe Diskussion
embryonale Fibroblasten der Maus (MEFs, TgN (DR4)1 Jae-Stamm)ATTCSCRC-1045
TgN (DR4)1 Jae-MäuseThe Jackson Laboratory3208
Mitomycin C Sigma-AldrichM0503
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) ohne Calcium oder MagnesiumGibco14190-094
Tg(DR4)1Jae/J MäuseJAX3208Mäuse, die vier medikamentenselektierbare Gene und DR4 MEFS enthalten, verleiht Resistenz gegen Neomycin, Puromycin, Hygromycin und 6-Thioguanin
0,1 % GelatineSigma-AldrichG13930,5 g in 500 mL destilliertem Wasser auflösen, autoklavieren und bei 4 °C lagern.
Trypsin (0,25%) Gibco25200-056
2 Zoll M pluripotinCayman Chemical10009557
pRMCE-DV1BCCM/LMBP Sammlung LMBP 08870öffentlich verfügbar in der BCCM/LMBP-Sammlung (http://bccm.belspo.be) 
cre-excised pRMCE-DV1BCCM/LMBP Sammlung LMBP 08195öffentlich verfügbar in der BCCM/LMBP-Sammlung (http://bccm.belspo.be) 
pCAG-FlpE-IRES-Puro-pA Addgen20733
Hitzeschock kompetent DH5&alpha&Bakterien hausgemachter
Gateway pDONR221 VektorThermo Fisher12536-017enthält Kanamycin-Resistenz-Gen
BP Klonase II MixThermo Fisher11789-020
LR Klonase II MixThermo Fisher11791-020 
Luria Bouillon (LB) 
Ampicillin 
Applied Biosystems 3730XL DNA-AnalysatorThermo Fisher3730XL
G418Thermo Fisher11811-023
Lipofectamine 2000 TransfektionsreagenzThermo Fisher11668027
Lipofectamine LTX TransfektionsreagenzThermo Fisher15338100
Effectene TransfektionsreagenzQiagen301425
GATEWAY pENTR 1A VektorThermo FisherA10462rekombinationskompatibler
Anti-p120ctn-AntikörperBD Transduction Laboratories610134
monoklonaler Maus-Anti-Ecadherin-AntikörperBD Transduction Laboratories610181
Allgemeine Ausrüstung
Sterile Sezierwerkzeugefeine Schere und Pinzette zum Präparieren der Gebärmutter
Sterile Pipetten: 5 mL, 10 mL und 25 mL
Konische Zentrifugenröhrchen 15 mL und 50 mL Konische Zentrifugenröhrchen
96-Well-Kulturplatten V-förmiger Boden und flacher Boden)  
Kulturschalen: 24 Wells, 12 Wells und 6 Wells
Mehrkanalpipetten (zum Pipettieren von 30, 50, 100 und 200 μ L) 
Sterile Mehrkanal-Reservoire
Zugang zu einer laminaren Luftströmung
Zugang zu einem Inkubator bei 37°; C mit 5% CO2
Zugang zu einem inversen Mikroskop
Zugang zu einer Tischzentrifuge
Zugang zu einem Stereomikroskop mit Durchlicht 
Culture media
MEF Mediumgelagert bei 4 ° C; 30 min warm bei 37 °; C vor Gebrauch
Dulbecco' s modifizierter Eagle" s Medium (DMEM)Gibco41965-062
10% fötales Rinderserum (FBS)Sigma-AldrichF-7524
L-Glutamin (2 mM)Gibco25030-024 
Natriumpyruvat  (0,4 mM)Gibco11360-039 
Penicillin (100 U/ml)Gibco15140-122 
Streptomycin (100 &Mikro; g/mL)Gibco15140-122 
SR-basiertes mESC>Medium<stronggelagert bei 4 > C; 30 min warm bei 37 °; C vor Gebrauch
DMEM/F12Gibco31330-038gemischt im Verhältnis 1:1
Knock-out-Serumersatz (SR)Gibco10828– 028
L-Glutamin (2 mM)Gibco25030-024 
0,1 mM nicht-essentielle Aminosäuren Gibco11140-050
Penicillin (100 U/ml)Gibco15140-122 
Streptomycin (100 &Mikro; g/mL)Gibco15140-122 
β-Mercaptoethanol (0,1 mM) Sigma-AldrichM 3148 
2.000 U/ml rekombinante Maus LIF (IRC/VIB Protein Service Facility)
FBS-basiertes mESC-Medium (ähnlich wie SR-basiertes mESC-Medium)gelagert bei 4°; C; 30 min warm bei 37°; C vor Gebrauch
Knockout DMEMGibco10829-018 
15% FBSHycloneSH30070.03E
Differenzierung Mediumgelagert bei 4 ° C; 30 min warm bei 37 °; C vor dem Gebrauch
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)Gibco21980-032 
15% FBSHycloneSH30070.03E
5% CD Hybridoma Medium (1x) flüssig  Gibco11279-023 
2 mM L-GlutaminGibco25030-024 
0,4 mM 1-ThioglycerinSigma-AldrichM-6145
50 μmu; g/mL AscorbinsäureSigma-AldrichA-4544 
Penicillin (100 U/ml)Gibco15140-122 
Streptomycin (100 &Mikro; g/mL)Gibco15140-122 
2i
1 μ M Erk-Inhibitor PD0325901 Axon MedchemAxon 1408
3 μ M Gsk3-Inhibitor CHIR99021Axon MedchemAxon 1386
Herstellung Herstellung Maus-Monoklonaler/ 15%

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gul, I. S., Hulpiau, P., Saeys, Y., van Roy, F. Metazoan evolution of the armadillo repeat superfamily. Cell Mol Life Sci. , (2016).
  2. Valenta, T., Hausmann, G., Basler, K. The many faces and functions of beta-catenin. EMBO J. 31, 2714-2736 (2012).
  3. Pieters, T., van Hengel, J., van Roy, F.

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Recombination mediated Cassette ExchangeMouse Embryonic Stem CellsRosa26 Locus TargetingRescue Construct InsertionFLPe Recombinase ExpressionNeomycin Resistance SelectionEndoderm Differentiation Assayp120 Catenin KnockoutEmbryoid Body FormationGenetic Rescue Screening

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