Analyse von Zellsuspensionen isoliert von festen Geweben von Spectral Flow Cytometry

Summary

Dieser Artikel beschreibt, spektrale Zytometrie, einen neuen Ansatz in der Durchflusszytometrie, die die Formen von Emissionsspektren verwendet Fluorochromen zu unterscheiden. Ein Algorithmus ersetzt Kompensationen und kann Auto-Fluoreszenz als unabhängigen Parameter behandeln. Dieser neue Ansatz ermöglicht die korrekte Analyse von soliden Organen isolierten Zellen.

Abstract

Die Durchflusszytometrie wurde in den letzten 40 Jahre zu definieren und den Phänotyp der lymphatischen und anderen hämatopoetischen Zellen zu analysieren. Zunächst beschränkt sich auf die Analyse einiger Fluorochrome, derzeit gibt es Dutzende von unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen und bis zu 14 bis 18 verschiedene Farbstoffe können zu einer Zeit kombiniert werden. Beeinträchtigen jedoch mehrere Einschränkungen noch die analytischen Fähigkeiten. Aufgrund der Vielzahl von Fluoreszenzsonden, hat die Datenanalyse immer komplexer geworden aufgrund der Notwendigkeit von großen, multiparametrisches Kompensations Matrices. Außerdem mutierten Maus-Modelle fluoreszierende Proteine ​​tragen zu detektieren und zu spezifischen Zelltypen in verschiedenen Geweben Spuren verfügbar worden, so dass die Analyse (durch Durchflusszytometrie) von Auto-Fluoreszenz-Zellsuspensionen von festen Organen erhielten erforderlich ist. Durchflusszytometrie Spektral-, welche die Formen von Emissionsspektren entlang einer Vielzahl von kontinuierlichen Wellenlängen unterscheidet, werden einige dieser Probleme. Die Daten werden analysiert, with einen Algorithmus, die Kompensations Matrizen und behandelt Autofluoreszenz als unabhängigen Parameter ersetzt. Somit sollte spektraler Durchflusszytometrie Fluorochrome fähig sein mit ähnlichen Emissionspeaks des Unterscheidens und kann eine Multiparameteranalyse ohne Kompensations Anforderungen.

Dieses Protokoll beschreibt die spektrale Analyse der Durchflusszytometrie, so dass für eine 21-Parameter (19 Fluoreszenzsonden) Charakterisierung und die Verwaltung eines Autofluoreszenzsignals, eine hohe Auflösung in kleinere Population Detektion bereitstellt. Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass die spektralen Durchflusszytometrie Vorteile bei der Analyse von Zellpopulationen aus Geweben schwierig präsentiert in herkömmlicher Durchflusszytometrie, wie Herz und Darm zu charakterisieren. Spectral Durchflusszytometrie so zeigt die Multiparameteranalysekapazität von hochleistungsfähigen Zytometrie herkömmlicher Strömung ohne das Erfordernis für Ausgleichs- und ermöglicht Autofluoreszenz-Management.

Introduction

In den letzten Jahrzehnten, Durchflusszytometrie (FCM) wurde Studien ein verbreitetes Analysemethode essentiell für Zell Phänotypisierung. Es wurde eine wesentliche Erhöhung der verfügbaren Fluoreszenzfarbstoffe waren, insbesondere durch den violetten Laser angeregt Fluorochrome (405 nm) (zB Brilliant Violet und neue Q-Punkt - Farbstoffe). Allerdings erhöht das Wachstum der verfügbaren Fluoreszenzfarbstoffe das Risiko von überlappenden Emissionen und erfordert arbeitsintensive Kompensations Matrizen. FCM wurde weit verbreitet Zellsuspensionen aus festem Gewebe zu analysieren, aber die Anwesenheit von auto-fluoreszierenden Zellen begrenzt die Diskriminierung von spezifisch markierten Populationen.

Die Grundprinzipien der spektralen FCM werden ausführlich in Futamura et al. ^{1, 2.} Kurz gesagt, hier verwendet, um die spektrale FCM (die Tabelle von Materialien sehen) ist mit 405, 488, und 638 nm-Laser ausgestattet. Die spektrale FCM erfasst alle emittierten fluorescence als Spektren in einem 32-Kanal-Linear-Array PMT (32CH PMT) für 500 nm bis 800 nm und 2 unabhängigen PMTs für 420 nm bis 440 nm und 450 nm bis 469 nm bzw. die die herkömmlichen Bandpassfilter ersetzt werden. Die 488 und die 405/638-nm-Laserspots sind räumlich voneinander getrennt, während die 405 nm und 638 nm Laserspots co-linear ist. Für jeden einzelnen Partikel, die spektralen FCM Maßnahmen bis zu 66 Kanäle von Fluoreszenzdaten angeregt durch die 405 nm und 488 nm Laser. Wenn Zellen durch den 638-nm-Laser angeregt werden, misst die spektrale FCM 58 Kanäle von Fluoreszenzdaten, da eine Maske, um den 638-nm-Laser von glänzenden in die PMT zu verhindern, eingeführt wird. Spectral FCM analysiert die erfassten Vollspektrumdaten mit einem Algorithmus auf der Grundlage der gewichteten Methode der kleinsten Quadrate (WLSM), die die Trennung von überlappenden Spektren Fluoreszenz ermöglicht. Spektren abgeleitet von single-gefärbten und ungefärbten Proben werden als Basisreferenzspektren erkannt. Multi-gefärbten Proben werden eine mathematisch ausgestattetUngemischt, und das Spektrum einer Probe mit gemischten fluoreszierenden Markierungen wird in eine Sammlung ihrer konstituierenden Spektren zerlegt. Die Entmischung in der Spektraltechnologie ^{3 , 4} ersetzt die Kompensation, die das Signal von allen Detektoren entfernt, mit Ausnahme derjenigen, die einen gegebenen Farbstoff mißt.

In dieser Studie kombinierten und testeten wir 19 Fluorochrome in einer einzigen, 21-Parameter-Analyse, die die wichtigsten hämatopoetischen Teilmengen in der Maus Milz charakterisiert charakterisiert. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass die spektrale Zytometrie das Auto-Fluoreszenz-Signal steuern kann, wodurch die Charakterisierung der intestinalen intraepithelialen Lymphozyten und des embryonalen Herzens verbessert wird. In diesen Geweben erlaubte das Auto-Fluoreszenz-Management die Zuordnung von spezifischer Fluoreszenz zu Zellen, die aus der Analyse in herkömmlichem FCM ausgeschlossen würden.

Protocol

Alle Experimente wurden nach der Pasteur-Institut Ethic Charta und den EU-Richtlinien durchgeführt und wurden von dem Französisch Landwirtschaftsministerium genehmigt.

1. Zellsuspension Vorbereitung von erwachsenen Maus Orgeln

1. Isolierung von Splenozyten
   1. Euthanize erwachsene Mäuse durch Genickbruch. Einen Einschnitt in den Bauch Mittellinie und öffnen Sie die Haut mit einer Schere. Ernten Sie die Milz mit einer Pinzette.
   2. Crush die Milz zwischen 2 Glasobjektträgern, die Zellen zu dissoziieren, und verdünnte sie in 5 ml Hanks Balanced Salzlösung (HBSS), enthaltend 1% fötales Kälberserum (FCS).
   3. Zentrifuge für 10 min bei 120 xg und 4 ° C. Überstand verwerfen.
   4. Das Pellet in 5 ml HBSS 1% FCS. Zählen Sie die Zellen mit einer Neubauer Kammer einen Trypanblau Vitalfärbemittel verwenden.
      HINWEIS: 80 Millionen Zellen sollten von einem Erwachsenen Milz gewonnen werden.
2. isolatiauf den Zellen aus dem Dünndarm
   1. Euthanize erwachsene Mäuse durch Genickbruch. Mit einer Schere, macht einen Einschnitt in der Haut am Bauch Mittellinie. Fassen des Dünndarms mit einer Pinzette in einer Hand und mit einer Schere es an beiden Enden schneiden: erste, direkt nach dem Magen und dann am Ende des Dünndarms, kurz vor dem Dickdarm. Spülen den Dünndarm mit 1x Dulbecco phosphatgepufferte Salzlösung (DPBS) unter Verwendung einer 2 ml-Spritze mit einer Nadel.
   2. Setzen Sie den Dünndarm auf einem Papiertuch und entfernen Sie vorsichtig die Peyer-Plaques mit einer scharfen Schere.
   3. Mit einer Schere in den Darm auf seiner langen Seite zu öffnen, indem im Innern des Darms einen Zweig der Schere einsetzen. Schneiden Sie das geöffnet Darm in 1 cm-Stücke unter Verwendung einer scharfen Schere.
   4. Inkubieren für 30 min bei 37 ° C unter ständigem Rühren in 30 ml HBSS mit 10% FCS.
   5. Platzieren der Zellsuspension mit den verbleibenden nicht-dissoziierten Fragmente in einem 50 mlKunststoffrohr und Vortex für 5 min mit hohen Geschwindigkeit. HINWEIS: Es gibt keine weitere Dissoziation des Gewebes ist.
   6. Inkubieren für 10 min auf Eis, um den großen, nicht-dissoziierten Fragmente zu erlauben, zu pelletieren.
   7. Sammeln Sie den Überstand und engt sie durch Zentrifugation für 7 min bei 120 x g.
   8. Überstand verwerfen und das Pellet in 10 ml HBSS mit 1% FCS. Zählen von Zellen mit einer Neubauer Kammer eines Trypanblau Vitalfärbemittel verwenden.
      HINWEIS: ~ 60 Millionen intra-Epithelzellen (IELs) sollten von einem Erwachsenen Dünndarm erhalten werden.
3. Panel - Design - Strategie
   1. Bereiten Sie die Platten mit Antikörpern, die direkt mit Fluorochromen.
      HINWEIS: Alle Antikörper werden vorher die optimale Definition der Zellpopulationen zu erhalten, titriert (die Titration mit dem Antikörper Charge variieren kann). Die Antikörper in der Platte 19 verwendete Farbe Splenozyten zu färben , sind in Tabelle 1 aufgeführt.
   2. Konstruieren Sie Multi-color Paneele für Zytometrie. Da dies eine schwierige Aufgabe sein kann, verwenden Sie die folgenden Richtlinien, um die Platten zu optimieren:
      1. Überprüfen Sie die spektrale Konfiguration und die Fluoreszenzfarbstoffe, die auf dem Instrument verwendet werden können.
      2. Verwenden Sie die Helligkeit Index / Anfärbung Index Informationen vom Hersteller zur Verfügung gestellt.
         HINWEIS: Der Helligkeitsindex / Staining Index ist der relative Indikator der Fluoreszenzintensität gegenüber dem Hintergrund für jedes Fluorochrom.
      3. Wählen Sie die Antikörper nach den folgenden Regeln:
         1. Wählen Sie die hellsten Fluorochrome für Proteine, die schwach ausgeprägt und die dunkelste Fluorochrome für mehr stark exprimierten Proteine ​​werden.
            HINWEIS: Zum Beispiel, CD45, CD4 und CD8 stark exprimiert werden und können mit dim Fluorochrome verwendet werden.
         2. Starten Sie das Panel entwerfen, indem zuerst die Antikörper mit den wenigsten Fluoreszenzfarbstoff Möglichkeiten wählen.
         3. Wenn möglich, wählen Fluoreszenzfarbstoffe mit der kleinsten Überlappung der Emissionsspektren foder Markierungen auf den gleichen Zelltypen exprimiert.
            HINWEIS: Tandems (zB PE-Cy5, PE-Cy7 und PerCP-Cy5.5) sollten mit Vorsicht verwendet werden, da sie anfälliger für den Abbau durch Lichteinwirkung sind.
4. Anfärben von Zellen für Zytometrie Analyse
   1. Bereiten ein 5 - ml - Röhrchen mit 1 x 10 ⁶ Splenozyten und ein 5 - ml - Röhrchen mit 1 x 10 ⁶ Darmzellen und halten sie ungefärbt für die Verwendung als negative Kontrollen.
   2. Bereiten und beschriften ein 5 - ml - Röhrchen pro Probe und pro Platte gemäß Tabelle 1. Bereiten Sie die Mischung von Antikörpern, gemäß Tabelle 1, in HBSS 1% FCS.
   3. Transfer 1 x 10 ⁶ Zellen - entweder Splenozyten oder Darmzellen - in jede 5 ml - Röhrchen. 2 mL HBSS 1% FCS und Zentrifuge 5 min bei 4 ° C und 120 x g. Überstand verwerfen und das Pellet in 50 ul Antikörper-Mix.
   4. Beschriften Sie die splenocytes in 2 Stufen. Verwenden Sie zuerst 50 ul der Mischung, die mit PE-markierten Antikörper enthält, Cyanine 5, PerCP-Cyanine 5,5 und PerCP (mit Fc-Rezeptor-blockierend) in einem 5 ml-Röhrchen. Nach 20 min Inkubation im Dunkeln bei 4 ° C, werden 50 & mgr; l der Mischung alle anderen Antikörper zu einem 5-ml-Röhrchen enthält.
      HINWEIS: Diese Strategie begrenzt sterische Hinderung.
   5. Inkubieren für 20 min im Dunkeln bei 4 ° C.
   6. 2 mL HBSS 1% FCS und Zentrifuge 5 min bei 4 ° C und 120 x g. Überstand verwerfen und das Pellet in 200 ul HBSS mit 1% FCS 0,5 ug / ml Propidiumiodid (PI).

2. Herstellung von Einzelfärbung für jedes Fluorochrom auf Gewerbe Compensation Bead Microspheres (zB Ultracomp eBeads), im folgenden als Perlen Geworben

1. Vorbereitung und so viele 5 ml-Röhrchen, wie die Anzahl von Antikörpern beschriften, die in den Platten verwendet werden. 1 Tropfen von Kügelchen in jedem Röhrchen und fügen 1 & #181; L Antikörper pro Röhrchen.
   HINWEIS: Die Perlen verwendet hier (siehe die Tabelle der Materialien) enthalten, gefärbt (positiv) und ungefärbte (negative) Perlen. Antikörper werden im Überschuss auf dem Kügelchen stellen ein helles Signal zu gewährleisten und damit eine klare spektrale Signatur für jeden Farbstoff. Dies wird durch die Software in der Lage sein erforderlich, um eine genaue Entmischung zu machen.
2. Inkubieren für 20 min im Dunkeln bei 4 ° C.
3. 2 mL HBSS 1% FCS und Zentrifuge für 5 min bei 120 x g. Überstand verwerfen und das Pellet in 100 & mgr; l HBSS 1% FCS.

3. Zellsuspension Herstellung von embryonalen Mäuseherzen

1. Sezieren von Embryonen
   1. Plane zu erhalten timed-trächtige Weibchen im Voraus durch Paarung 2 Weibchen mit einem Männchen (immer in dem Käfig der männlichen) am Ende des Tages (zwischen 17 und 19 h). Am nächsten Morgen, Weibchen mit Vaginalpfropf wird als bei 0,5 Tagen nach coitum sein.
   2. Euthanize die E17.5 schwanger females durch Genickbruch. Stellen Sie sicher, dass das Tier durch festes Drücken der Mauspfote (toe-Pinch-Reflex) nicht reagiert. Befeuchten Sie den Bauch mit 70% Ethanol zu sterilisieren und die Ausbreitung der Maus Fell zu verhindern.
   3. Einen Einschnitt in der Haut in der Mitte des Bauches mit einer Schere und ziehen die Haut auseinander mit den Fingern.
   4. Öffnen der Bauchhöhle durch Ziehen und Einschnitte in den Bauchmuskel von der Mitte zu den beiden Seiten des Bauches unter Verwendung grober Pinzette und Schere.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, nicht in den Dünndarm zu beschädigen, die unmittelbar unterhalb der Bauchmuskel ist.
   5. Sammelt die Uterushörner (mit den Embryonen), indem sowohl auf der Ebene des Gebärmutterkörpers und der Ovarien zu schneiden. Genießen sie in einem 90 x 15 mm ² Petrischale mit 50 ml DPBS.
   6. Isolieren von jedem Embryo zwischen jedem Decidua Schneiden, gefolgt von der Gebärmutter muskulären Wand und dem viszeralen Dottersack mit einer feinen Pinzette und Schere. Ziehen Sie die Embryonen intHandlung. Schließlich schnitt die Nabelschnur.
   7. Schneiden Sie die E17.5 Embryonen Köpfe mit einer Schere (Enthauptung), bevor die Dissektion zu starten.
2. Sammlung von Herzen
   1. Einweichen dekapitiert Embryonen in einem 90 x 15 mm Petrischale ² ein nasses Papiertuch Bettwäsche in den Schalenboden und 50 ml HBSS mit 1% FCS enthält.
   2. Unter einem Stereomikroskop, mit jedem Embryo Brutto Zange halten, so dass die ventrale Seite nach oben weist.
   3. Öffnen Sie vorsichtig die Brust Gitter durch die rechte Seite der Brust mit einer Schere, um Schneiden Schädigung des Herzens zu verhindern.
   4. Setzen Sie das Herz durch den Brustkorb mit grober Pinzette.
   5. Ziehen Sie das Herz auseinander (noch zusammengebaut mit Lungen und Thymus) , indem die großen Gefäße halten (die großen Gefäße enthalten , und in- Ausströmen des Herzens) und sie in ein 35 x 15 mm ² Petrischalen mit 2 ml HBSS 1% mit FCS.
   6. Isolieren Sie die Herzen von den umliegenden Organen undBindegewebe mit einem feinen Pinzette und Skalpell.
   7. Waschen Sie die Herzen in ein neuen 35 x 15 mm Petrischalen mit 2 ml HBSS 1% FCS und halten sie auf Eis für 20 min des Herz zu ermöglichen, in den Kammern, das Blut zu pumpen.
3. Herstellung von Herzzellsuspensionen
   1. Pre-warm die 200 ug / ml Kollagenase in HBSS + / + (im folgenden als Enzymlösung bezeichnet) auf 37 ° C.
      HINWEIS: Verdünne die Kollagenase in HBSS + / + (mit Ca ²⁺ und Mg ²⁺ -Kationen) , um die Enzymaktivität zu maximieren; Kollagenase-Aktivität ist stabil zwischen den Chargen.
   2. Ersetzen der Waschlösung, die Herzen (HBSS 1% FCS) mit 1 ml vorgewärmtes enzymatischer Lösung Einweichen.
   3. Unter einem Stereomikroskop, Hackfleisch , die Herzen in 1-mm ³ Stücke unter Verwendung einer feinen Pinzette und ein Skalpell. Fügen Sie ein weiteren 1 ml vorgewärmter Enzymlösung und überträgt das zerkleinerte Gewebe in ein 5-ml-Röhrchen mit einem Deckel.
      HINWEIS: Für eine optimale Verdauung, legen Sie eineMaximal 5 E17,5 Herzen pro 2 ml enzymatische Lösung. Wenn mehr Herzen gleichzeitig verdaut werden, teilen sie sie in verschiedene 5-ml-Röhrchen auf.
   4. Inkubieren Sie die gehackten Herzen für 15 min bei 37 ° C.
      HINWEIS: Legen Sie die 5-ml-Röhrchen (richtig geschlossen) in den Inkubator, um das Gewebe entlang der Lösung zu verbreiten.
      1. Am Ende der Inkubation homogenisieren Sie das Gewebe in der gleichen enzymatischen Lösung durch Pipettieren auf und ab etwa 20 Mal mit der P1000-Pipette. Setzen Sie das 5-ml-Röhrchen in die senkrechte Position und lassen Sie das restliche Gewebe-Fragment Sediment (ca. 3 min).
      2. Sammeln Sie den Überstand (enthaltend die verdauten Zellen in Suspension) in einem 50-ml-Röhrchen, fügen Sie 2 ml HBSS 10% FCS hinzu (das gleiche Volumen wie das Volumen der enzymatischen Lösung, die den Gewebefragmenten hinzugefügt wurde), und halten Sie sie auf Eis, während Sie fortfahren Verdauungsprozess
         HINWEIS: Die HBSS 10% FCS-Lösung und das Eis sind wichtig, um die Enzym-Wirkung inaktiv zu halten, während das übrige Gewebe istAufschluß.
      3. 2 mL vorgewärmtes enzymatische Lösung für die 5-ml-Röhrchen mit den verbliebenen Gewebefragmenten und weiterhin die Verdauung durch Wiederholen von Schritt 3.3.4 bis kein Gewebe mehr beobachtet wird.
         HINWEIS: Um 4 Zyklen der Verdauung sind genug, um vollständig das Herzgewebe (5 E17.5 Herzen in 2 ml Enzymlösung) zu distanzieren.
   5. Zentrifugieren die 50-ml-Röhrchen mit Zellen in Suspension für 10 min bei 300 xg und den Überstand verwerfen.
   6. Resuspendieren des Zellpellets, 1 ml HBSS - / - 1% FCS, und Filtern der Zellsuspension obwohl ein Gitter 70 um Nylon. Zählen Sie die Zellen mit einer Neubauer Kammer einen Trypanblau Vitalfärbemittel verwenden.
      HINWEIS: Resuspendieren der Zellen mit HBSS - / - (ohne Ca ²⁺ und Mg ²⁺ Kationen) Zellaggregation zu minimieren. Zwischen 800.000 und 1.000.000 Zellen werden von einem E17.5 Herzen erhalten.
4. Anfärben Herzzellen mit fluoreszierenden Antikörpern
   HINWEIS: Alle Antibodies vorher optimale Definition der Zellpopulationen zu erhalten titriert (die Titration mit dem Antikörper Charge variieren kann) .Die im Herzen Platte verwendeten Antikörper sind in Tabelle 1 aufgeführt.
   1. die Herzzellen in Suspension durch eine 96-Well-Platte (Rundboden) verteilen. Verteilt sie gleichmäßig über alle benötigten Vertiefungen (200 & mgr; l pro Vertiefung), Kurz Spin Zentrifuge der 96-Well-Platte für 1 min bei 480 x g und den Überstand verwerfen.
      HINWEIS: Alle Vertiefungen des 96-Well-Platte (mit runden Boden) verwendet werden.
   2. Resuspendieren des Pellets und inkubiere die Herzzellen für 20 min im Dunkeln bei 4 ° C mit 100 & mgr; l des Cocktails von Antikörpern (dh CD45-PE, TER119-PE, CD31-Alexa 647 und Sca-1-PE-Cyanine5 verdünnt) in HBSS - / - 1% FCS.
   3. Waschen Sie die Herzzellen aus dem Überschuß an Antikörper, die durch Zugabe von 200 & mgr; l HBSS - / - 1% FCS und Kurz Spin um die Zellen für 1 min bei 480 x g zentrifugiert.
   4. Überstand verwerfen und wiederholendie Kurzspinn Zentrifugation (Schritt 3.4.3).
   5. Resuspendieren der Zellen in 200 ul HBSS - / - 1% FCS und sie auf ein 5-ml-Röhrchen, die 200 & mgr; l bereits HBSS - / - 1% FCS.
   6. Vor der Übernahme, fügen 400 ul HBSS - / - 1% FCS mit 0,5 ug / ml PI und Filtern der Zellsuspension obwohl ein 70 um Nylon-Mesh.

4. Erwerb von Beschriftete Splenic, Darm- und Herzzellen mit dem Spectral Durchflusszytometer

1. Vor dem Erwerb der Daten kalibriert automatisch die spektralen cytometer die Anweisungen des Herstellers folgen. Führen Sie die täglichen und die monatlichen Qualitätskontrollverfahren jeden Tag des Experiments.
2. Wenn das Zytometer bereit ist, starten Sie die Vorschau der Proben, die die Zellsuspensionen mit allen Antikörpern markiert enthält.
   HINWEIS: Seien Sie nicht erwerben.
3. Stellen Sie sicher, dass alle Laser auf sind je nach Bedarf. Stellen Sie die FSC Verstärkung derart, dass alle Zellen in dem jeweiligen sichtbarenParzellen. Gate die Zellpopulation und wendet dieses Gate an die beiden Spektraldiagramme entsprechend den 488-nm und mit dem 638/405-nm-Laser.
   HINWEIS: Wenn Fluorochrome durch den 638-nm - Laser angeregt werden ( das heißt, wenn der 638-nm - Laser eingeschaltet ist), gibt es eine Maske , die Abschirmungen 617 bis 662 nm Licht in die PMT den 638 - nm - Laser , um zu verhindern scheint. Dies bewirkt den Verlust eines Teils des Spektrums, und verursacht daher eine geringere Abscheidung von Farbstoffen in der Nähe dieser Wellenlängen emittieren. Allerdings kann das gesamte Signal durch Ausschalten des 638-nm-Laser gesammelt werden, wenn es nicht für die Erfassung erforderlich ist.
4. Stellen Sie den 32-Kanal - Photomultiplier (PMT) Spannung (%) , so dass alle Fluorochrome innerhalb des Bereichs der Intensität in der Y-Achse angezeigt sind (1-10 ⁶⁾ in den zwei verschiedenen Spektraldiagramme Anzeige 488 nm und 405/638 nm Erregungen.
   HINWEIS: Die Ausbildung ist erforderlich, um die Spektren aller Fluorochrome verwendet zu erkennen.
5. Starten Sie die Proben zu erwerben. Klicke auf "; Vorschau“ , um die Zellen auf dem Bildschirm sichtbar zu machen und klicken Sie dann auf‚Acquire‘ , um die Probe zu erfassen aus jeder Probe zu 2 x 10 ⁶ Veranstaltungen sparen..
6. Nachdem die gefärbten Proben zu erwerben, erwerben, die mit dem Vitalfarbstoff gefärbte Probe und dann einzeln den Kompensationsperlen gefärbt mit allen verwendeten Antikörpern. Klicken Sie auf „Vorschau“, um die Zellen auf dem Bildschirm sichtbar zu machen und dann auf „Acquire“, um die Proben aufzunehmen.
   HINWEIS: Halten Sie die gleiche PMT - Spannung für alle Proben und Kontrollen (dh Perlen und ungefärbten Proben); 5.000 Veranstaltungen sind weitgehend ausreichend.
7. Schließlich erwerben die Daten von den nicht markierten Zellsuspensionen. Klicken Sie auf „Vorschau“, um die Zellen auf dem Bildschirm sichtbar zu machen und dann auf „Acquire“, um die Proben aufzunehmen.
   HINWEIS: Der Erwerb der ungefärbten Proben am Ende des Experiments minimiert die Verschleppung von fluoreszierenden Zellen.
8. Reinigen Sie das Zytometer nach den Anweisungen des Herstellers eind das Experiment in den Erwerb Ordner schließen.
   HINWEIS: Erst nach dem Experiment Schließen wird es für die Analyse gespeichert und verfügbar sein.

5. Die Analyse der Daten mit Spectral FCM Software

1. In der „Farbpalette“ Fenster der „Analyse“ Registerkarte registrieren alle Parameter, die in der Platte durch jedes Fluorochrom Zugabe verwendet und die entsprechende Markierung (wählen Sie aus der Liste oder einen neuen Parameter hinzufügen). Außerdem gehören die Autofluoreszenz und Lebensfähigkeit Parameter; Alle ausgewählten Parameter werden im „Entmischung“ Fenster angezeigt.
2. Wählen Sie die erste Single gefärbte Probe (done mit Ausgleichskugeln) in den „Control“ Fenster unter der „Tube List“ dieses Experiments auf der „Analyse“ aus. In dem Arbeitsblatt, klicken Sie auf „Polygon - Design - Tool“ und entwerfen Sie ein Tor auf der Beadpopulation im FSC / SSC Plot. Doppelklicken Sie auf der Oberseite des Gatters ein spektrales oder Punktdiagramm zu öffnendie gated Perlen in einer Tochter Grundstück zu visualisieren.
   1. Design Ein Tor für die positiven und ein Gatter für die negativen Perlen entweder auf dem Spektrum oder auf dem Dot-Plot. Überprüfen Sie die gesamten Spektren auf die beiden Lasersätze für jede positive und negative Fraktion entspricht, und Ausreißer eliminieren, indem nacheinander Anschnitt- und Klicken auf das Tor die Tochter Population zu verifizieren. Geben Sie den negativen und positiven Gates in der „Entmischung“ -Fenster.
   2. Wiederholen Sie Schritt 5.2 für jede einzelne gefärbte Probe.
      Hinweis: Beachten Sie, dass die positive und negative Gating-Strategie auf die Probe entspricht, das analysiert wird, obwohl das Programm ermöglicht es in jeder Probe gestellt werden. Statt eine negative Fraktion für jede Einzel gefärbte Probe zur Bestimmung, verwenden, um eine ungefärbte Probe bead ein universelles negativ einzustellen.
3. Wählen Sie die ungefärbten Zellprobe in der „Tube List“ und Design Tore für autofluoreszenten und für Nicht-autofluoreszenten Zellen.
4. Wenn alle negativen und positiven Tore für alle Parameter, einschließlich Auto-Fluoreszenz und die Lebensfähigkeit in der „Entmischung“ Fenster ausgewählt sind, klicken Sie auf „Berechnen“. Tragen Sie die Entmischung zu den Proben analysiert werden.
5. Analysieren Sie die Daten durch Tore Entwerfen und Erstellen von zweiparametrige Plots.
   1. Zunächst entwirft ein Tor für SSC gegen FSC und tote Zellen entfernen, indem alle Zellen mit der Lebensfähigkeit Marker (PI gegen CD45) markiert ausgenommen. Auf dem Rest der Zellen, Design - Gatter für alle Populationen von Interesse , die Strategie für jedes Zellsuspension folgenden beschrieben (Abbildungen 1-3).
      HINWEIS: Falls erforderlich, stellen Sie die Kompensation in der „Referenzspektrum Teller.“ Dies ist ein Werkzeug, das nach Entmischung verwendet werden kann, um den Median der positiven Populationen für jede Fluorochrom neu zu justieren, wenn der Algorithmus nicht perfekt machen kann.

Results

21-Parameter-Spektraldaten FCM Panel Splenozyten zu analysieren

Abbildung 1 zeigt die erhaltenen Ergebnisse mit dem 19-fluoreszierendes-Antikörper - Panel Milz- Zellen angewendet, die verschiedene Antikörper Untergruppen von T, B, NK, dendritische und myeloiden Zellen zu erkennen, während alle hämatopoetischen CD45 kernhaltiger Zellen markiert. Die Platte enthält auch einen Lebensfähigkeitsfarbstoff (PI), sowie d...

Discussion

Herkömmliche FCM auf der Detektion von Photonen basierend emittieren nach Anregung von Fluoreszenzsonden. Die Fluoreszenzemission von einem Fluorochrom in einem Detektor erfaßt ausgelegt, das Signal von einem anderen Fluorochrom zu messen induziert physikalische Überlappung. Diese Spill-over zwischen Emissionsspektren muss durch Kompensationen korrigiert werden.

Spectral FCM und Datenverarbeitung durch die Entmischung Entfaltungsalgorithmus erlaubt die Kombination von Fluorochromen mit engen...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mäuse	Janvier Labs	CD45.2	Quelle der Zellen
Ethanol 70%	VWR	83801.36	Sterilisation
DPBS (Ca2+, Mg2+)	GIBCO ThermoFisher	14040-174	Embryonensammlung
Hanks' ausgewogene Salzlösung (+Ca2+ +Mg2+) (HBSS+/+)	GIBCO Life ThermoFisher	14025092	Dissoziations-, Aufschluss- und Färbelösungen
Hanks' Balanced Salt Solution (-Ca2+, -Mg2+) (HBSS-/-)	GIBCO Life ThermoFisher 14175095		Dissoziations-, Aufschluss- und Färbelösungen
Fötales Kälberserum (FCS)	EUROBIO	CVFSVF00-0U	Dissoziations-, Aufschluss- und Färbelösungen
Kollagenase	Sigma	C2139	Enzymatische Lösung
90 x 15 mm, Petrischalen für plastische Gewebekulturen.	TPP	T93100	Entnahme von Embryonen und Herzen
, 35 x 15 mm, Petrischalen aus Kunststoffgewebekultur.	TPP	T9340	Hearts collection
Feine Irisschere	Fine Science Tools	14090-09	Sezierwerkzeuge
Grobpinzette (Pinzette mit schmalem Muster, gebogen 12 cm)	Fine Science Tools	11003-12	Sezierwerkzeuge
Feine Pinzette (Dumont Nr. 7 Pinzette)	Fine Science Tools	11272-30	Sezierwerkzeuge
Skalpell	VWR	21909-668	Präparierwerkzeuge
LEICA MZ6 Präpariermikroskop	LEICA	MZ6 10445111	Probenahme; Okular W-Pl10x/23
Kaltlampenquelle	SCHOTT VWR	KL1500 compact	Probenahme; Zwei an Schwanenhalsfasern
angepasste FACS-Röhrchen	VWR	60819-310	Aufschlusszellen
96 Well-Platte (runder Boden)	VWR	10861-564	Färbezellen
Nylonnetz-Verschraubungstuch sterilisiert, 50/50 mm Stücke.	SEFAR NITEX	SEFAR NITEX	Zellfiltration
UltrasComp eBeads
Fluoreszenzmarkierte Antikörper	Biolegend	Katalognummer siehe Tabelle unten	Färben von Zellen