Präziser zellulärer Ablationsansatz zur Modellierung akuter Nierenverletzungen bei der Entwicklung von Zebrafisch

Zusammenfassung

Diese Arbeit präsentiert ein neues in vivo Modell der segmentalen Nierenverletzung mit Nieren GFP transgenen Zebrafisch. Das Modell ermöglicht die Induktion der gezielten Ablation von Nierenepithelzellen, um die zellulären Mechanismen der Nephronverletzung und Reparatur zu zeigen.

Zusammenfassung

Akute Nierenverletzung (AKI) ist eine häufige Erkrankung mit einer hohen Sterblichkeitsrate. Mit den Reparaturfähigkeiten der Niere ist es möglich, eine adäquate Nierenfunktion nach einer unterstützenden Behandlung wiederherzustellen. Jedoch ist ein besseres Verständnis davon, wie Nephron-Zelltod und -reparatur auf zellulärer Ebene stattfinden, erforderlich, um den Zelltod zu minimieren und den regenerativen Prozess zu verbessern. Der Zebrafisch pronephros ist ein gutes Modellsystem, um dieses Ziel zu erreichen, weil es anatomische Segmente enthält, die dem Säugetier-Nephron ähnlich sind. Bisher war das häufigste Modell, das verwendet wurde, um Nierenverletzungen bei Fischen zu untersuchen, das pharmakologische Gentamicin-Modell. Allerdings erlaubt dieses Modell keine präzise räumlich-zeitliche Kontrolle der Verletzung, und daher ist es schwierig, zelluläre und molekulare Prozesse zu untersuchen, die an der Nierenreparatur beteiligt sind. Um diese Einschränkung zu überwinden, stellt diese Arbeit eine Methode dar, durch die im Gegensatz zum Gentamicin-Ansatz ein spezifisches Green Fuorescent Protein (GFP) -exPress-Nephron-Segment kann mit einem violetten Laserlicht (405 nm) fotografiert werden. Dieses neuartige Modell von AKI bietet viele Vorteile, die andere Methoden der Epithelverletzung fehlen. Seine Hauptvorteile sind die Fähigkeit, das Verletzungsniveau und die präzise räumlich-zeitliche Kontrolle im robusten In-vivo- Tiermodell zu "wählen". Diese neue Methode hat das Potenzial, das Niveau des Verständnisses von Nierenverletzungen und Reparaturmechanismen deutlich zu verbessern.

Einleitung

Akute Nierenverletzung (AKI) ^{1 , 2} , die auch als akutes Nierenversagen bezeichnet werden kann, ist weitgehend als plötzliche Beeinträchtigung der Nierenfunktion definiert ³ . Während das Niveau des Verständnisses dieser Bedingung im Laufe der Jahre bemerkenswert verbessert wurde, blieben die Morbiditäts- und Sterblichkeitsraten hoch ^{1 , 2} . Die derzeitige Behandlung für diese Bedingung ist meist unterstützend, da die Ergebnisse aus mehreren klinischen Studien der medikamentösen Therapie negativ waren ⁴ ....

Protokoll

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den Empfehlungen in der Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labor-Tiere der National Institutes of Health durchgeführt. Das Protokoll wurde von der NYIT College of Osteopathic Medicine Institutional Animal Care und Use Committee (NYITCOM IACUC) genehmigt. Alle Operationen und In-vivo- Experimente wurden unter Trikose Anästhesie durchgeführt, und alle Anstrengungen wurden gemacht, um Leiden zu minimieren.

1. Erhalt und Erhaltung von Embryonen

1. Erhalten Sie Embryonen durch Überqueren der Niere GFP fluoreszierenden Zebrafisch.
   HINWEIS: Beispiele für fluoreszenzmarkie....

Ergebnisse

Bitte beachten Sie, dass dieses Protokoll erfolgreich mit einer Anzahl von Nieren-GFP-transgenen Linien verwendet wurde, einschließlich ET (krt8: EGFP) sqet11-9, ET (krt8: EGFP) sqet33-d10 und Tg (atp1a1a.4: GFP). Die hier gezeigten Beispielergebnisse wurden unter Verwendung der ET (krt8: EGFP) sqet11-9 Linie erhalten.

Abbildung 1 zeigt das Beispiel-Photoablationsprotokoll. Die durchschnittliche G.......

Diskussion

Es ist zu beachten, dass die gesamte Laserleistung zwischen den Systemen variiert. Jedoch ermöglicht die Verwendung von Prozent-GFP-Photobleichen ein Auslesen der Gesamtenergie, die an die fluoreszierende Niere abgegeben wird, unabhängig von der Änderung der Laserleistung und kompensiert durch die Belichtungsdauer. Denken Sie jedoch daran, dass die Reaktion der verschiedenen Gewebe auf diese Methode der Photoablation variiert. Auch bei der Nierenreifung ist es wesentlich schwieriger, eine 50% ige Reduktion der GFP-Fluor.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Petrischale, 35 x 10 mm	Genesee Scientific	32-103	Prozedurale Verwendung: Schritt 2.4, 2.7
Petrischale, 100 x 15 mm	Midwest Scientific	910	Prozedurale Verwendung: Schritt 1
Dechorinationszange - Elektronenmikroskopie Sciences Dumont Pinzette 5 Dumostar	Fischer Scientific	50-241-57	Prozedurale Verwendung: Schritt 2.1.1
Kunststoff-Transferpipettenkugel	Scientific	135030	Prozedurale Verwendung: Schritt 2.5, 3.6
Tricain	Sigma Aldrich	A5040-25G	Prozedurale Verwendung: Schritt 2.3, 3.4
Agarose	Fischer Scientific	BP165-25	Prozedurale Verwendung: Schritt 2.3
Gezogene Glassonde (manuell aus Glaskapillarröhrchen hergestellt)	Fischer Scientific	21-1640-2C	Prozedurale Verwendung: Schritt 2.4
Stereomikroskop	Nikon	SMZ1270	Verfahren Verwendung: Schritt 1.5
SOLA Light Engine	Lumencor	SOLA SM-5-LCR-SB	Verfahren Verwendung: Schritt 1.5
Eclipse C2 Plus Konfokalmikroskop System	Nikon		Verfahren Verwendung: Schritt 3
1x E3 Lösung			Rezept zur Erzeugung: 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2 , 0,33 mM MgSO4 Verwendung des Verfahrensschritts: 1.2, 1.3, 2.2, 2.3
PTU	Sigma	P7629-10G	Verwendung des Verfahrensschritts: 1.3, 2.2, 3.4, 4.2
NIS Elements Software	Nikon	C2+	Verwendung des Verfahrens: Schritt 3
Lasereinheit	Agilent	MLC 400	Verfahrensschritt 3.11
Propidium Iodid (PI)	Sigma Aldrich	P4170-100MG	Verwendung des Verfahrensschritts: 4.2