Method Article

Bewertende primäre Explosion Effekte In Vitro

DOI:

10.3791/55618

⸱

September 18th, 2017

 ,  , 
1Department of Bioengineering, Imperial College London

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verstehen, wie Zellen durch die Einwirkung von Stoßwellen moduliert werden kann helfen, die Mechanismen hinter Verletzungen von Blast-Ereignisse ausgelöst. Dieses Protokoll verwendet speziell angefertigten Schock Röhre Ausrüstung Zelle Monolagen Stoßwellen bei einer Reihe von Belastungen zuweisen und die Folgewirkungen im Zellviabilität zu identifizieren.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Exposition gegenüber Explosion Ereignisse kann schwere Traumata lebenswichtiger Organe wie Lunge, Ohren und Gehirn verursachen. Das Verständnis der Mechanismen hinter solche Explosion verursachten Verletzungen ist von großer Bedeutung, die in Anbetracht des jüngsten Trends zur Verwendung von Sprengstoffen in modern Warfare und Terrorist-Vorfälle. Um Explosion verursachten Verletzungen zu verstehen, müssen wir zuerst in der Lage, solche Explosion Ereignisse in einer kontrollierten Umgebung mit einer reproduzierbaren Methode replizieren sein. In diese Technik mit Schock Tube Equipment, Stoßwellen bei einer Reihe von Belastungen können in lebenden Zellen gewachsen in 2D propagiert und Marker der Zellviabilität können sofort analysiert werden, mit einem Redox-Indikator-Assay und der fluoreszierenden Bildgebung von lebenden und toten Zellen. Diese Methode zeigte, dass erhöht den Gipfel Explosion Überdruck bis 127 kPa einen deutlichen Rückgang im Zellviabilität im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen stimulieren kann. Proben sind nicht beschränkt auf adhärente Zellen, sondern zählen Zellsuspensionen, Ganzkörper- und Gewebe Proben durch geringfügige Änderungen im Schock-Rohr-Setup. Replizieren die genauen Bedingungen, die Gewebe und Zellen zu erleben, wenn Sie eine echte Explosion Ereignis ausgesetzt ist schwierig. Techniken wie die in diesem Artikel vorgestellten können helfen, Schäden Schwellenwerte definiert und identifiziert die transkriptionellen und epigenetischen Veränderungen in den Zellen, die von der Schockwelle Exposition auftreten.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mit der jüngsten Trend zur Nutzung von improvisierten Sprengkörpern in modern Warfare und terroristische Aktionen auf Zivilisten ist das Verständnis der Auswirkungen von explosiven Ereignisse auf den menschlichen Körper von großer Bedeutung. Verletzungen durch Exposition gegenüber Explosion Veranstaltungen erhalten können tödliche und tödliche, mit den körperlichen Prozessen der Verletzung wird in vier Kategorien unterteilt werden. Primäre Verletzungen resultieren aus direkte Sonneneinstrahlung die Druckwelle, die lokal mit dem Körper in einer Druck- und anschließend expansive Weise interagiert, wodurch die Beeinträchtigung der Membranen und Weichteile1. Sekundäre Verletzungen gehören stumpfes Trauma oder durchdringenden Wunden verursachten Auswirkungen mit massearmen Objekte mit hoher Geschwindigkeit durch die Druckwelle angetrieben. Tertiäre Verletzungen auftreten, wenn die Druckwelle ausreichend Energie hat, um Gegenstände von Hochamt oder Einzelpersonen gegen Objekte zu werfen. Zu guter Letzt werden quartäre Blast Verletzungen durch andere sonstigen Verletzungen definiert, die nicht die anderen Kategorien, wie z. B. Flash Verbrennungen2passen. Nach Exposition gegenüber solchen Blast-Veranstaltungen sind primäre Verletzungen Schädel-Hirn-Verletzungen3,4,5, heterotopic Verknöcherung6,7, Explosion Lunge Verletzungen8, Verlust des Hörvermögens 9u.10.

Eine häufig beobachtete Wellenform von Blast Veranstaltungen ist die Friedlander Welle, vertritt eine Freifeld, im Gegensatz zu einer geschlossenen-Raum, Explosion. Die Wellenform besteht aus einer Explosion-Front, die als einen scharfen und schnellen Anstieg der positiven Druck definiert werden kann. Unmittelbar danach durch eine Explosion Wind der Luft mit hoher Geschwindigkeit und eine Release-Welle, die den Druck, unter dem atmosphärischen Niveau reduziert. Ein teilweises Vakuum bleibt in der Region der ersten Explosion, die Ergebnisse in den langsamen Rückfluss der Luft. Die positiven und negativen Phasen der Welle (Abbildung 1A) führen in der Push-Pull-Bewegung der Explosion Welle1. Experimentelle Modelle ist um zu helfen, die Mechanismen hinter primäre Blast Verletzungen erläutern, entstanden um Wellenformen, wie die Welle Friedlander, produzieren die Zellen und Gewebe konfrontiert sein wird wenn Sie eine echte Explosion Ereignis ausgesetzt. In der Literatur aufgeführten aktuellen Systeme umfassen Schock Röhren11,12,13,14,15,16,17, Barochambers18,19, Kolsky Bar20erweiterte Explosion Simulatoren21, Split Hopkinson Druck Bar22und die Erholung der alternative Explosion Ereignisse in einer kontrollierten Umgebung mit Pentaerythritol tetranitras23. Trotz der breiten Palette von Modellen zur Verfügung beeinflussen viele Variablen die Verletzung von Druckwellen, einschließlich der Vorspannung angewendet, und die mechanischen Eigenschaften der einzelnen Zelltypen oder Gewebe unter Auswertung24erhalten. Während die Untersuchung von Gewebe oder Organe Gewebe Verformung und grob morphologischen Veränderungen erlitten infolge der Explosion Ereignisse beleuchten kann, kann Analyse auf zellulärer Ebene transkriptionelle und epigenetische Veränderungen beeinflusst durch die Schockwelle aufdecken.

Dieser Methoden-Artikel beschreibt eine Technik, um Schockwellen bei einer Reihe von Belastungen in lebenden Zellen in einem monomolekularen Film zu propagieren. Dies ermöglicht die sofortige Charakterisierung der Zellviabilität, Aufklärung potenzieller Schaden Schwellenwerte von Stoßwellen. Darüber hinaus lebensfähige Zellen an standard Kulturbedingungen zurückgegeben werden können, und langfristigen biologische Wirkungen von der Explosion Veranstaltung beurteilt werden können. Das Protokoll unten beschreibt zwei Zelle überleben Techniken, die auf Zellen in Kultur verwendet werden können.

figure-introduction-1
Abbildung 1: Approximation einer Welle Friedlander. (A) eine Annäherung an eine Friedlander Welle am Sensor 3 auf dem Schock-Schlauch beobachtet. (B) repräsentative Daten zeigen die unterschiedlichen Druckprofile bei Sensoren 1, 2 und 3 auf dem Schock-Schlauch beobachtet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Zellkultur und Probenvorbereitung

  1. erhalten einen entsprechenden Zell-Linie (z. B. Zellen der dermalen Papille).
    Hinweis: Das aktuelle Protokoll ist konzipiert für adhärente Zellen mit Ratte dermalen Papille Fibroblasten isoliert von Tasthaare zum Vorbild.
  2. Kultur der Zellen in einem T-75 Kolben mit minimalen wesentliche mittlere (MEM) α mit fötalen Rinderserum 10 % und 1 % Penicillin-Streptomycin ergänzt. Die Zellen standard Kulturbedingungen 37 ° C und 5 % CO 2 in eine feuchte Umgebung bleiben, bis sie 80 % Zusammenfluss erreichen.
  3. Aspirieren Sie das Medium und die Zellen in Dulbecco zweimal waschen ' s Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Trennen Sie die Zellen aus der Flasche durch brüten sie in 2 mL Trypsin/EDTA bei standard Kultur Bedingungen für 5 min. kurz zu überprüfen, um sicherzustellen, dass Zellen erfolgreich aus der Flasche mit einem Licht/Phase-Kontrast-Mikroskop (mit einem 10 X-Objektiv getrennt haben ).
  4. Fügen Sie 4 mL Kulturmedium, die Trypsinization Reaktion zu neutralisieren. Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 15 mL Zentrifugenröhrchen.
  5. Zentrifuge bei 200 X g für 4 min zu die Zellen zu Pellets. Langsam Aspirieren des Überstands, kümmert sich nicht um die Pellets zu verdrängen. Wieder aussetzen das Pellet in 5 mL Medium.
  6. Ein 20 µL Aliquot der Zellsuspension auf eine saubere Hemocytometer übertragen und zählen Sie die Zellen unter dem Mikroskop mit einem 10 X-Objektiv ausgestattet.
  7. Bereiten die Zellen für die Explosion durch drei 35 mm Schalen in einem 90-Millimeter-Teller platzieren. Beschriften Sie sie entsprechend. Jedes Gericht 35 mm fügen Sie 2 mL Medium hinzu und Samen Sie insgesamt 5 x 10 4 Zellen pro Schale, die Zellen gleichmäßig um die Schale zu verteilen. Inkubieren Sie die experimentellen Proben Übernachtung im standard Kulturbedingungen, um angemessene Zellhaftung vor der Druckwelle Belichtung ermöglichen.
    Hinweis: Für Fluoreszenz-Bildgebung, Zellen müssen werden gesät auf sterile Glasdeckgläser.

2. Schock-Baugruppe

figure-protocol-1
Abbildung 2 : EVOC Rig und Schock Tube Assembly. (A) Bild von EVOC-Rig. (B) schematische Darstellung der Schock-Rohr-Apparat. Schock-Rohrdimensionen umfassen einen Innendurchmesser von 59 mm und einer Gesamtlänge, einschließlich das EVOC-Rig von 4,13 m. Die Länge des angetriebenen Rohres und die EVOC Rig Summen 2,71 m. Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

  1. Tragen Stahl-Zehe Arbeitsstiefel und ein Laborkittel während der Montageabläufe.
  2. Insert gefunden die beiden Ausrichtung Balken durch die zwei Bohrungen in der horizontalen Ebene der Auslass-Flansch. Legen Sie ein Nitrilkautschuk Dichtung Blatt über das Ende der Achse Bars, so dass es zwischen dem Auslass-Flansch und ex Vivo Orgel Kultur (EVOC) Rig sitzt.
    Hinweis: Das EVOC-Rig ist eine speziell angefertigte Halterung zur Verwendung mit 35 mm Petrischalen ( Abbildung 2A).
  3. Ausgang Flansch der Schock Röhre durch Verschieben der Leuchte über die Ausrichtung-Balken, um sicherzustellen, dass es richtig ausgerichtet ist, so dass der Abschnitt, der die Petrischale hält an seinem Fuße befindet das EVOC-Rig beimessen.
  4. Legen Sie vier M24 Schrauben und Unterlegscheiben in die verbleibenden Löcher. Die Muttern so positionieren, dass sie den Flansch berühren.
  5. Dicht befestigen Sie die Schrauben und Muttern nacheinander diagonal symmetrische Weise zwar visuell überprüfen, ob die EVOC Rig und Schock Röhre erfolgreich ausgerichtet haben.
  6. Der EVOC Rig ein Druckaufnehmer beimessen und an die Stromquelle mit einem Sensorkabel anschließen. Anschließend verbinden Sie die Stromquelle mit einem BNC-Kabel, mit dem Oszilloskop.
  7. Stellen Sie sicher, dass alle Ventile freizugeben und Kontrollen auf dem Schock-Schlauch fließen sind geschlossen. Öffnen Sie die integrierten externen Druckluftleitung und manuell drehen Sie den Druckregler im Uhrzeigersinn, um die Magnetspule zu 2,5 Bar laden
  8. Das Sicherheitsventil auf das komprimierte Gasflasche durch Drehen gegen den Uhrzeigersinn 180° öffnen.
  9. Drehen Sie langsam den Druckregler, befindet sich oben auf der Gasflasche im Uhrzeigersinn, um den Druck auf ca. 15 bar erhöhen
    Hinweis: Die Einstellung Punkt dieses Reglers sollte werden leicht oberhalb der höchsten Berstdruck der dicksten Membran, die im Experiment verwendet werden.
  10. Bereiten die Membranen von 0,125 mm dicken Plastikfolie in 10 x 10 cm Quadrate schneiden.
    Hinweis: Die Dicke der Membran wird korrelieren mit der Berstdruck, verändern den Spitzendruck der Stoßwelle (d. h., die eine dickere Membran eine Schockwelle mit einem größeren Spitzendruck führt; Tabelle 1).
< tabelle Fo:keep-together.within-seite "1" = > Mylar Membran Maße (cm) Berstdruck (Bar) Sensor 3 Druckbereich (kPa) 10 x 10 X 0,023 2 ± 0,2 47 ± 7,5 10 x 10 x 0.050 4 ± 0,2 72 ± 7,5 10 x 10 x 0,125 9,5 ± 0,5 127 ± 12,5 < / t in der Lage >

Tabelle 1: Burst Druck entsprechend Dicke Membran und Spitzendruck.

  1. Griffe aus Band erstellen, auf der Ober- und Unterseite der Membran zu beheben und nutzen sie, um das Zwerchfell neben der vorderen kleinen Flansch sorgfältig von der Beckenendlage Kammer positionieren. Sicherzustellen, dass die Membran gerade und korrekt positioniert ist, vor dem Schließen des Verschlusses.
  2. Sichern dies mit vier M24 Schrauben und Muttern. Fest befestigen Sie die Schrauben und Muttern nacheinander auf diagonal symmetrische Weise.

3. Vorbereitung der Zellen nur vor der Druckwelle Exposition

  1. vorbereiten eine Gewebe-Laminar-Flow-Kapuze durch ultraviolette Sterilisation durchführen. Reinigen Sie ihn mit einer desinfizierenden Lösung und 70 % Ethanol. Sammeln Sie alle Artikel für Umgang mit vorheriger zu/post-shock Zellen benötigt Welle Exposition und legen Sie sie in die sterile Haube.
    Hinweis: Dazu gehören frisches Medium, selbstklebende gasdurchlässigen Membranen, sterile Schere, Pipetten und Pipette Tipps.
  2. Übertragung einer 90 mm Petrischale mit drei experimentellen Proben aus dem Inkubator, der sterile Haube.
  3. Schnitt eine selbstklebende gasdurchlässigen Membran in sechs Quadrate, Blatt (siehe die Tabelle der Materialien), so dass jeder ist groß genug, um ein 35 mm Petrischale bedecken.
  4. Aspirieren Sie das Medium aus dem 35 mm Petrischale, setzen Sie den Deckel auf der einen Seite und mit Klebstoff gasdurchlässigen Membranen zweiteilig, sicherstellen, dass Sie eine gute Abdichtung zwischen der Membran und dem Rand der Schale abdecken.
  5. Die Probe in das EVOC-Rig zu übertragen und auf der Basis der Vorrichtung zu sichern, so dass die Spitze der Schale mit der inneren Basis der Schock Röhre ausgerichtet wird.

4. Schock-Rohr-Betrieb

  1. Auge Schutzbrillen, Gehörschutz, Sicherheitsschuhe und ein Laborkittel zu tragen, wenn die Schock-Rohr-System unter Druck zu setzen.
  2. Drehknopf die Strömung am Regler im Uhrzeigersinn, so dass Gas in den Schlauch anschließen der Pressluftbehälter mit dem Schock-Rohr fließen.
  3. Am unteren Rand der Systemsteuerung, wählen Sie entweder die " doppelte Verschluss " Einlass für einen kurzzeitigen Schock Wave oder die " Treiber Tube " Einlass für eine erhöhte Welle Dauer.
  4. Schalten Sie die DC Stromquelle und Oszilloskop die Wellenformdaten zu erwerben. Legen Sie die Oszilloskop Abtastrate bis 50,0 MS/s, mit einer Länge von 1 M Punkte. Stellen Sie einen Bereich von 50 mV für brennen bei 2 Bar und 100 mV für über 4 Bar
  5. Schalten Sie mit dem Schalter an der Wand gegenüber der Systemsteuerung Sicherheit Lichter.
    Hinweis: Dies weist andere Forscher nicht um den Raum zu betreten, wenn der Schock-Tube aufgeladen wird.
  6. Schalten Sie den Schalter am Magnetventil Steuerkasten das Magnetventil geschlossen.
    Hinweis: Dieses Sicherheits-Feature schließt ein Ventil befindet sich auf der doppelte Verschluss-Kammer, so dass für das System geladen werden.
  7. Auf dem Bedienfeld öffnen Sie langsam die Ablaufsteuerung durch Drehen des Drehknopfes, erhöhen Sie den Druck innerhalb der Verdichtungsraum gegen den Uhrzeigersinn. Überwachung des Drucks mit dem Control Panel Display.
  8. Sobald die Membran Druck platzen erreicht ist, wird die Membrane Bruch und eine " bang " ertönt. Schnell schließen die Ablaufsteuerung durch Drehen des Drehknopfes.
    Hinweis: Die Schockwelle reist durch die Röhre über die Zellprobe und aus dem Ende des Rohres.
  9. Öffnen Sie die Magnetspule durch Drehen Sie den Schalter am Magnetventil Steuerkasten und schalten Sie die Sicherheits-Licht (mit dem Schalter an der Wand gegenüber der Systemsteuerung).
  10. Übertragen die Zellprobe auf der sterilen Haube, entfernen Sie die klebenden gasdurchlässigen Membranen und füllen Sie die Schale mit 2 mL frische Wachstumsmedium. Die Zellen können sofort für Bewertung, verwendet, wie in Schritt 5 beschrieben, oder zurück in den Inkubator für längerfristige Studien.

5. Handy-Lebensfähigkeit

  1. Assess Zellviabilität nach Schockwelle Exposition mit der Kombination von einem Redox-Indikator-Assay und der fluoreszierenden Bildgebung von lebenden und toten Zellen.
    Hinweis: Für Fluoreszenz-Bildgebung, Zellen müssen werden gesät auf sterile Glasdeckgläser in Abschnitt 1: Handy-Kultur und Probe Vorbereitung. Diese können innerhalb der 35-mm-Petrischalen platziert werden.
  2. Transfer 200 µL der Redox-Statusanzeige-Reagenz (siehe die Tabelle der Materialien) zu jedem experimentellen Gericht direkt nach dem Wiederbefüllen sie mit 2 mL Medium nach dem Schock wave Exposition. Inkubation bei standard Kulturbedingungen für 4 Std.
  3. Für jedes Gericht übertragen (in einer dunklen sterilen Haube) 2 x 100 µL Aliquots, entweder schwarz oder klar 96-Well-Platte, je nachdem ob Fluoreszenz oder Absorption Beurteilungder Rentabilität verwendet werden wird.
  4. 96-Well-Platte auf eine geeignete Platte Leser ausgestattet mit den richtigen Filter übertragen und lesen mit Erregung Bands 530ex/590em für Fluoreszenz oder 570 nm kombiniert mit 600 nm Referenz für Absorption. Exportieren und Speichern der Daten.
  5. Analysieren die Daten um keinen Unterschied zwischen Stoßwelle ausgesetzt Proben und nicht-exponierten Kontrollen zu identifizieren, wie dies einen Tropfen im Zellviabilität.
    Hinweis: Eine negative Kontrolle sollte auch in den Versuchsplan aufgenommen werden. Darüber hinaus kann die Interpolation von einer Standardkurve verwendet werden, um Zelle Zahlen berechnen.
  6. Aspirieren der Redox-Indikator-Reagenz-haltigem Medium. Ersetzen Sie es mit 2 mL frisches Medium und inkubieren Sie die Zellen am standard Kulturbedingungen für 24 h
  7. Wiederholen Sie die obigen Schritte nach Bedarf zu einen zweiten Zeitpunkt Lebensfähigkeit zu erhalten.
  8. Für die Fluoreszenz Imaging von lebenden und toten Zellen, aspirieren Sie das Medium und die Zellen zweimal in 1 mL PBS waschen. Übertragen von 100 µL des kompletten Reagenz in der Bildgebung gefunden, jedes Sample kit (siehe die Tabelle der Materialien) und inkubieren Sie bei Raumtemperatur lichtgeschützt für 15 min.
  9. Aspirieren das Reagenz und einmal mit 1 mL PBS waschen. Nehmen Sie das Deckglas aus der 35 mm-Schale mit feinen Spitze Pinzette, vorsichtig und legen Sie sie verdeckt auf einen Glasobjektträger Mikroskopie.
  10. Erwerben Bilder für jede Probe mit einem fluoreszierenden Mikroskop (10 X-Objektiv, 0,50 numerische Apertur) ausgestattet, mit der richtigen Anregung und Emission Filter (ex / Em 488 nm/515 nm und 570 nm nm/602).
    Hinweis: Lebende Zellen werden intensive, gleichmäßige, grüne Fluoreszenz emittieren. Toten oder sterbende Zellen mit einer kompromittierten zellulären Membran werden Aufnahme der Toten Kit Komponente, wodurch die Emission von rote Fluoreszenz, überwiegend im nuklearen Bereich der Zelle gefunden.
  11. Verwenden Bildanalyse Software entweder manuell oder automatisch die Anzahl der lebenden und toten Zellen aus jedem Bild.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mit der oben beschriebenen Methode, wurden Zellen in einem monomolekularen Film gewachsen in dreifacher Ausfertigung, Schockwellen erzeugt mit einem Schock-Rohr (Abb. 2 b) ausgesetzt. Marker der Zellviabilität wurden bewertet. Mit einem Redox-Indikator-Assay, ergab, dass die Anwendung eine Schockwelle 127 kPa die Lebensfähigkeit der dermalen Papille Zellen im Vergleich zu Kontrollen nach 24 h in der Kultur (Abbildung 3) deutlich reduzieren konnte. Die Anwendung von einer Schockwelle ≤72 kPa reduzieren Lebensfähigkeit nicht. Um diese Beobachtungen zu unterstützen, wurde ein fluoreszierende Bild-Assay in der Lage, Eindringmittel Kennzeichnung lebenden oder tote Zellen mit grünen oder roten Fluorophore, bzw. eingesetzt. Die Quantifizierung von lebenden und toten Zellen aus 13 fluoreszierende Bilder pro biologische replizieren zeigte eine Reduktion im Zellviabilität in exponierten, 127 kPa Stoßwelle im Vergleich zu dem Regler (Abbildung 4). Statistische Auswertung erfolgte über eine einfache ANOVA, gefolgt von mehreren Tukey Vergleichstest mit p < 0,05 gilt als statistisch signifikant. Die Stichprobengröße pro Gruppe belief sich auf 9 für die Redox-Indikator-Assay und 39 für die quantitative Fluoreszenz-imaging-Analyse.

figure-results-1
Abbildung 3 : Redox-Assay Indikatordaten zeigen zeitlichen Verlauf der Zelle Lebensfähigkeit nach Schockwelle Exposition. Nach 24 h in der 127-kPa Stoßwelle-exponierten Gruppe im Vergleich zu den unbehandelten Kontrolle wurden deutlich weniger Zellen beobachtet. Die negativ-Kontrolle, die bestand aus einem 30-s-Behandlung mit 2 % Desinfektionsmittel (siehe die Tabelle Materialien) zeigte deutlich weniger Zellen an T0 und 24 h im Vergleich zu anderen Gruppen. Jeder Balken repräsentiert den Mittelwert ± 1 Standardabweichung (SD); biologischer Replikate, N = 3; technische repliziert, n = 3. = p < 0,0001. * = p < 0,05. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

figure-results-2
Abbildung 4 : Fluoreszenz-Imaging. (A) Quantitative Daten von fluoreszierenden Bilder von lebenden und toten Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 24 h Post-Stoßwelle Exposition erfasst. Deutlich weniger lebensfähige Zellen verzeichneten die 127 kPa (bedeuten = 93,42) Stoßwelle ausgesetzt Probe im Vergleich zu den 47 kPa (bedeuten = 98.18), 72 kPa (bedeuten = 98,87), und Gruppen zu kontrollieren (bedeuten = 99.10). Keine lebensfähigen Zellen wurden nach 24 h auf die negative Kontrollgruppe beobachtet (bedeuten = 0). (B) repräsentative Fluoreszenzbilder. Grün zeigt lebende Zellen, während Rot abgestorbene Zellen zeigt. Jede Boxplot zeigt die obere und untere Quartile mit Tukey Schnurrhaare; biologischer Replikate, N = 3; technische repliziert, n = 13. = p < 0,0001. Maßstabsleiste = 300 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Primäre Verletzungen erhalten vor der Exposition gegenüber Explosion Ereignisse sind noch nicht vollständig aufgeklärt. Identifizierung und das Verständnis der Mechanismen, die Explosion verursachte Verletzungen, z. B. Schädel-Hirn-Verletzung-3,auslösen sind4 und heterotopic Verknöcherung6,7, wichtige erste Schritte zur Entwicklung effektive Methoden der Prophylaxe. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden eine Reihe von experimentellen Systemen entwickelt, um die Explosion Ereignis Exposition11,12,13,14,18,19 replizieren . Die beschriebene Technik setzt hier Schock Röhre (Abbildung 2) in der Lage ist, feuert Schockwellen bei einer Reihe von Drücke bei Ganzkörper (d. h. Nagetier), Gewebe- oder Zellproben. Die Fähigkeit, einzelne Zelltypen, anstatt ganze Gewebe laden gibt die Möglichkeit, verschiedene zelluläre Reaktionen analysieren Schäden auftreten kann, gleichzeitig über eine Reihe von Mechanismen1,2. Beispielsweise um traumatische modellieren ermöglichen-Hirn-Trauma, die Bewertung der einzelnen Zelltypen, wie Neuronen und Astrozyten, die Identifizierung von zellspezifische Verletzungen. Außerdem kann die gesamte Orgel Antwort mit Hirngewebe beurteilt werden. Die einzelnen Zelltypen und Gewebeproben haben Wert und können unterschiedlichen Informationen geben. Es ist auch möglich, die Menge der Luft zu ändern, die unter Druck gesetzt wird, den Schock durch Auswahl Doppel-Verschluss oder Treiber-Schlauch Zulauf zu generieren. Dies steuert die Dauer der Stoßwelle. Eine weitere Möglichkeit ist die Membran Material und Dicke der Höhepunkt Druck25ändern ändern.

Ein weiterer zu berücksichtigender Faktor sind Ende Interferenzeffekte vorliegen können, wenn das Probe-Gehäuse sich in der Nähe der Ausfahrt der Schock Röhre, wie auf das EVOC-Rig im derzeitigen System beschrieben gefunden befindet. Chandra Et al. Sie schaute Blast Wave Profile an verschiedenen Orten auf eine Komprimierung-driven Schock Tube gefunden und festgestellt, dass die Friedlander Wellenform am besten an einem Ort tief im Inneren der Schock Rohr15vertreten war. Michelle Et al. auch sekundäre Belastung der Probe untersucht und festgestellt, dass die Platzierung eine Endplatte am Ende des Rohres Schock unerwünschte reflektierten Wellen16beseitigen konnte. Unter Berücksichtigung der Daten in diesen Publikationen15,16, zukünftige Änderungen an das Schock-Rohr-System in diesem Artikel beschriebenen verbessern könnte die Platzierung von EVOC Rig an einer tieferen Stelle innerhalb der angetriebenen Röhre gefunden oder, Alternativ die Aufnahme eine Endplatte auf dem Schock-Rohr. Einschränkungen des beschriebenen Verfahrens könnte den relativ niedrigen Durchsatz von Proben enthalten. Ein einzelner Benutzer lässt das Schock-Rohr sicher bei einer Leistung von rund um 6-8 Proben pro Stunde. Derzeit ist das System um die Verwendung von einzelnen 35 mm Petrischalen geeignet. Daher können größere Experimente mit mehreren Gruppen und biologische Wiederholungen nur schwer zu erreichen sein.

Dieser Methoden-Artikel zeigt, wie die Lebensfähigkeit der dermalen Papille adhärente Zellen durch die Exposition gegenüber einer einzigen Schockwelle betroffen war. Einer kurzzeitigen Schockwelle (< 10 ms) des ≤72 kPa hatte keinen Einfluss auf Rentabilität im Vergleich zu der Kontrolle (Abbildung 3 und Abbildung 4). Im Gegensatz dazu angeregt eine Schockwelle bei 127 kPa einen deutlichen Rückgang Lebensfähigkeit bei 24 h Post-Blast, dargestellt durch ein Redox-Indikator-Assay (Abb. 3) und fluoreszierende Bildanalyse (Abbildung 4). Miller Et Al. berichtet eine ähnliche Reduktion im Zellviabilität in Ratte organotypischen hippocampal Slice Kulturen wenn Zellen entweder ausgesetzt waren ein 147 kPa oder 278 kPa Stoßwelle mit einer offenen, Helium-driven Schock Rohr14. Im Gegensatz dazu VandeVord Et Al. berichtet, gab es keine Auswirkung auf Lebensfähigkeit in Ratte Astrozyten ausgesetzt zu einer kurzzeitigen Überdruck von > 200 kPa, obwohl ein Barochamber anstatt eine Schock-Rohr-18verwendet wurde. Es sei darauf hingewiesen, dass der Druck von außen auf die Druckwelle angewiesen ist, obwohl dieses komplexen Belastung Wellen innerhalb des Körpers, wodurch die Art der Belastung stark abhängig von der mechanischen Eigenschaften von Geweben oder Zellen erzeugt. Zusätzliche Charakterisierung Studien über die zelluläre Reaktion auf Ereignisse der Explosion ist erforderlich. Darüber hinaus bewertet Druckwelle Exposition auf zellulärer Ebene, wie in dieser Technik dargestellt, können biologische Reaktionen ausgelöst, die aus der Verletzung, wie z. B. die Störung der Signalisierung Wege oder epigenetische Veränderungen identifiziert und weiter erforscht.

Diese Arbeit beschreibt zusammenfassend die Verwendung aus einem Rohr aus rostfreiem Stahl Schock und eine modifizierte EVOC-Rig, primären Zellkulturen zu integrieren. Stoßwellen bei einer Reihe von Belastungen können generiert und verbreitet in lebenden Zellen, die Effekte, die auftreten vor der Exposition gegenüber eine Druckwelle zu replizieren. Dieses Protokoll veranschaulicht die Zellviabilität bewerten, aber längerfristige Änderungen an einzelnen Zelltypen können auch untersucht werden. In Zukunft planen wir die unterschiedlichen Auswirkungen zu bewerten, die komplexe Stoßwellen in verschiedenen Zelltypen, mit dem Ziel fördern unser Verständnis von Blast-induzierten primären Verletzungen hervorrufen können.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keinen finanziellen Interessenkonflikt.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir möchten die finanzielle Unterstützung der Royal British Legion Zentrum für Blast Verletzungen Studien HA und Mittel aus dem Medical Research Council (M01858X/1) für CAH anerkennen.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
MEM α, NukleosideThermoFisher22571020
Fetal Bovine Serum, zertifiziert, US-amerikanischesThermoFisher16000044Supplement zur Herstellung kompletter Wachstumsmedien.
Dulbecco' s Phosphatgepufferte KochsalzlösungSigma AldrichD8537
Penicillin-StreptomycinThermoFisher15070-063Ergänzung zur Erstellung kompletter Wachstumssubstrate.
Trypsin-EDTA (0,5%), kein PhenolrotThermoFisher15400-054Vor Gebrauch 1 zu 10 verdünnen.
CytoOne T-75 Kolben, TC-behandelt, belüftetStarlabCC7682-4875
TC-Schale (PS) 35 mm, 8,5 cm2Triple RedTCD010035
Petrischale (PS) 90 x 14,2 mm ohne EntlüftungVWR UK391-0453 
Gasdurchlässige KlebeplattendichtungenThermoFisherAB-0718
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)ThermoFisherR37601
Alamarblue Reagenz für die ZellviabilitätFisher Scientific13494309
Virkon TablettenVWR UK115-0020Zur Herstellung einer 2%igen Lösung als Reagenz zur Viabilitätskontrolle verwenden.
Dumont PinzetteSurgicalTools11295-10Zum Entfernen von Deckgläsern aus der Petrischale.
Deckglas, quadratischVWR UK631-0125
ObjektträgerVWR UK631-1553
96 Well-Platte, massiv schwarzAppletonWoodsCC760Platte für Fluoreszenzmessungen.
96 Well-Platte, klar, (PS)VWR UK734-1799Platte zur Verwendung für Absorptionsmessungen.
Leica DMi1 Kamerastativ LeicaMicrosystemsOptisches Mikroskop für die Zellkultur.
Zeiss PALM MicroBeam Laser Capture MicrodissecitonZeissFluoreszenzmikroskop für die LIVE/DEAD-Bildgebung.
EnVision Multilabel ReaderPerkinElmer2104-0010APlatten-Reader für Fluoreszenz-/Absorptionsmessungen.
Mylar Elektrik & Chemische Isolierfolie, 304 mm x 200 mm x 0,023 mm RS Components785-0782Zur Erstellung einer Stoßdämpfermembran verwenden.
Mylar Elektrik & Chemische Isolierfolie, 304 mm x 200 mm x 0,05 mm RS Components785-0786Zur Erstellung einer Stoßdämpfermembran.
Mylar Elektrik & Chemische Isolierfolie, 304 mm x 200 mm x 0,125 mm RS Components785-0798Zur Herstellung einer Stoßdämpfermembran verwenden.
StromversorgungDytran Intruments Inc.4103CStromquelle für 2300V1 Sensor.
IEPE-DrucksensorDytran Instruments Inc.2300V1Drucksensor befindet sich am Stoßdämpferrohr.
Digitales Phosphor-OszilloskopTektronixDPO 4104BZum Sammeln und Speichern von Sensordaten des Sensors 2300V1.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Proud, W. G. The physical basis of explosion and blast injury processes. J R Army Med Corps. 159, Suppl 1 4-9 (2013).
  2. Born, C. T. Blast Trauma: The Fourth Weapon of Mass Destruction. Scand J of Surg. 94 (4), 279-285 (2005).
  3. Kocsis, J. D., Tessler, A. Pathology of blast-related brain injury. J Rehabil Res Dev. 46 (6), 667-671 (2009).
  4. Bass, C. R., et al. Brain Injuries from Blast. Ann Biomed Eng. 40 (1), 185-202 (2012).
  5. Cernak, I. Brain Neurotrauma: Molecular, Neuropsychological, and Rehabilitation Aspects. Frontiers in Neuroengineering. Kobeissy, F. H. , (2015).
  6. Alfieri, K. A., Forsberg, J. A., Potter, B. K. Blast injuries and heterotopic ossification. Bone Joint Res. 1 (8), 174-179 (2012).
  7. Potter, B. K., Burns, T. C., Lacap, A. P., Granville, R. R., Gajewski, D. A. Heterotopic Ossification Following Traumatic and Combat-Related Amputations. Prevalence, Risk Factors, and Preliminary Results of Excision. J Bone Joint Surg Am. 89 (3), 476-486 (2007).
  8. Sasser, S. M., Sattin, R. W., Hunt, R. C., Krohmer, J. Blast Lung Injury. Prehosp Emerg Care. 10 (2), 165-172 (2006).
  9. Cho, S. -I., et al. Mechanisms of Hearing Loss after Blast Injury to the Ear. PLoS ONE. 8 (7), 67618(2013).
  10. Bull, M. A., Clasper, J., Mahoney, P. Blast Injury Science and Engineering: A Guide for Clinicians and Researchers. , Springer. (2016).
  11. Arun, P., et al. Studies on blast traumatic brain injury using in-vitro model with shock tube. Neuroreport. 22 (8), 379-384 (2011).
  12. Ahlers, S. T., et al. Assessment of the effects of acute and repeated exposure to blast overpressure in rodents: toward a greater understanding of blast and the potential ramifications for injury in humans exposed to blast. Front Neurol. 3, 32(2012).
  13. Polfer, E. M., et al. The development of a rat model to investigate the formation of blast-related post-traumatic heterotopic ossification. Bone Joint J. 97 (4), 572-576 (2015).
  14. Miller, A. P., et al. Effects of Blast Overpressure on Neurons and Glial Cells in Rat Organotypic Hippocampal Slice Cultures. Front Neurol. 6, 20(2015).
  15. Chandra, N., et al. Evolution of blast wave profiles in simulated air blasts: experiment and computational modeling. Shock Waves. 22 (5), 403-415 (2012).
  16. Kuriakose, M., et al. Tailoring the Blast Exposure Conditions in the Shock Tube for Generating Pure, Primary Shock Waves: The End Plate Facilitates Elimination of Secondary Loading of the Specimen. PLoS ONE. 11 (9), 0161597(2016).
  17. Reneer, D. V., et al. A Multi-Mode Shock Tube for Investigation of Blast-Induced Traumatic Brain Injury. J Neurotrauma. 28 (1), 95-104 (2011).
  18. VandeVord, P. J., et al. Up-regulation of reactivity and survival genes in astrocytes after exposure to short duration overpressure. Neurosci Lett. 434 (3), 247-252 (2008).
  19. Kane, M. J., et al. Altered gene expression in cultured microglia in response to simulated blast overpressure: Possible role of pulse duration. Neurosci Lett. 522 (1), 47-51 (2012).
  20. Nienaber, M., Lee, J. S., Feng, R., Lim, J. Y. Impulsive pressurization of neuronal cells for traumatic brain injury study. J Vis Exp. (56), (2011).
  21. Zhang, J., et al. Transcriptional Profiling in Rat Hair Follicles following Simulated Blast Insult: A New Diagnostic Tool for Traumatic Brain Injury. PLoS ONE. 9 (8), 104518(2014).
  22. Bo, C., et al. Cellular characterization of compression-induceddamage in live biological samples. AIP Conf Proc. 1426 (1), 153-156 (2012).
  23. Tannous, O., Griffith, C., O'Toole, R. V., Pellegrini, V. D. Heterotopic ossification after extremity blast amputation in a Sprague-Dawley rat animal model. J Orthop Trauma. 25 (8), 506-510 (2011).
  24. Chen, Y. C., Smith, D. H., Meaney, D. F. In-Vitro Approaches for Studying Blast-Induced Traumatic Brain Injury. J Neurotrauma. 26 (6), 861-876 (2009).
  25. Nguyen, T. T. N., Wilgeroth, J. M., Proud, W. G. Controlling blast wave generation in a shock tube for biological applications. JPCS. 500 (14), 142025(2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Blast EffectsShock TubeCell ViabilityRedox Indicator AssayFluorescent ImagingPrimary CellsShock Wave ExposureCell CulturePressure TransducerOscilloscope

Related Articles